基因克隆的策略及实例分析.ppt

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第四章基因克隆的策略,引言第一节目的基因的获得第二节基因的重组与转移第三节重组体克隆的筛选和鉴定第四节实例分析,基因克隆的策略及实例分析,引言,基因克隆的本质是把某一目标DNA片段通过无性的方式进行扩增和表达，而这一过程往往是通过载体和寄主细胞来实现的。

一般而言，基因克隆包括四部分工作：

1、目标DNA片段的获得；2、克隆载体的构建；3、寄主细胞的转化；4、重组体克隆的选择和鉴定。

目前，以大肠杆菌为寄主，以质粒和噬菌体等为载体的基因克隆体系已经相当的成熟，本章将以这种克隆模式为主体对基因克隆的策略展开讨论和分析。

大肠杆菌作为寄主进行DNA克隆的实验方案,DNA片段的获得,载体构建,细菌转化,重组体的鉴定,限制性内切酶消化,机械切割,双链cDNA的合成,化学法直接合成,同聚物加尾,粘性末端连接,平末端连接,加接头造成粘性末端,重组噬菌体DNA转染,重组质粒的转化,体外包装进行转导,表型鉴定,核酸杂交,免疫学分析,酶切鉴定,第一节目的基因的获得,一、化学法直接合成基因二、从基因组文库中钓取目的基因三、从cDNA文库中钓取目的基因四、通过PCR直接扩增出目的基因,一基因组DNA片断化,

（一）限制性内切酶法,用限制性内切酶把基因组DNA切成不同大小的片断。

酶切,由于带有粘性末端，产物可以直接与载体连接。

1.优点,2.缺点,目的基因内部也可能有该内切酶的切点。

目的基因也被切成碎片！

BamHI,BamHI,BamHI,gene,

（二）随机片断化,1.限制性内切酶局部消化法,控制内切酶的用量和消化时间，使基因组中的酶切位点只有一部分被随机切开。

内切酶识别位点的碱基数,影响所切出的产物的长度和随机程度。

（1）限制性内切酶的选用原则,1）4bp的内切酶,平均每46（4096）bp一个切点。

2）6bp的内切酶,平均每44（256）bp一个切点。

随机程度高。

如Hae、AluI、Sau3A。

内切酶粘性末端,能与常用克隆位点相连。

（Sau3ABamHI）,2.机械切割法,

（1）超声波,超声波强烈作用于DNA，可使其断裂成约300bp的随机片断。

（2）高速搅拌,1500转/分下搅拌30min，可产生约8kb的随机片断。

1976年H.G.Khorana提出了用化学方法合成基因的设想，并于1979年在science上发表了率先成功地合成大肠杆菌酪氨酸tRNA基因的论文。

二化学合成目的基因,

（一）目前常用的方法,磷酸二酯法、,磷酸三酯法、,亚磷酸三酯法、,固相合成法,自动化合成法。

保护dNTP的5端P或3端-OH,用酸或碱的脱保护,

（1）原理,1.磷酸二酯法,带保护的单核苷酸连接,保证合成反应的定向进行。

带5保护的单核苷酸与带3保护的另一个单核苷酸以磷酸二酯键连接起来。

（2）合成过程,下一个5端保护的单核苷酸又可以同3端保护的二核苷酸聚合。

原理与磷酸二酯法一样。

只是参加反应的单核苷酸都是在3端磷酸和5-OH上都先连接了一个保护基团。

2.磷酸三酯法,将第一个核苷酸的3-OH端固定在固相支持物上。

固相磷酸三酯合成法,是目前通用的合成方法。

15,合成的二核苷酸连接处有三个酯键！

固相磷酸三酯合成过程,固相支持物,结果是全保护的DNA：

5DMT,3固相支持物,核苷酸之间对氯苯。

最后脱保护,固相支持物,固相支持物,C,化学合成的DNA片断一般在200bp以内。

（二）、化学合成DNA片断的组装,用T4多核苷酸激酶使各个片段的5端带上磷酸。

1.互补连接法,预先设计合成的片断之间都有互补区域，不同片断之间的互补区域能形成有断点的完整双链。

（2）5端磷酸化,

（1）互补配对,（合成的DNA单链的5端是-OH）,T4DNA连接酶,T4多核苷酸激酶,使5-OH磷酸化,完整的DNA双链,（3）连接酶连成完整双链,2.互补延伸连接法,预先设计的片断之间有局部互补区，可以相互作为另一个片断延长的引物，用DNA聚合酶延伸成完整的双链。

3,5,5,3,5,3,T4DNA连接酶,Klenow片段,引物,1.直接合成基因,（三）、寡聚核苷酸化学合成的优点,2.合成引物（20mer左右）,

（1）mRNA的含量很低，很难作cDNA,3.合成探针序列,4.定点突变合成,合成带有定点突变的基因片断。

（2）有些基因比较短，化学合成费用较低,DNA合成仪,5.合成人工接头或衔接物,含有各种酶切位点人工接头（Adaptor）或衔接物（Linker）序列。

EcoRI,EcoRI,Linker,Adaptor,将某种生物细胞的整个基因组DNA切割成大小合适的片断，并将所有这些片断都与适当的载体连接，引入相应的宿主细胞中保存和扩增。

理论上讲，这些重组载体上带有了该生物体的全部基因，称为基因文库。

（一）、基因文库的构建,1.基因文库（genelibrary）,三从基因组文库中钓取目的基因,

（2）目前常用的载体,2.构建基因文库的载体选用,载体能够容载的DNA片断大小直接影响到构建完整的基因文库所需要的重组子的数目。

载体容量越大，所要求的DNA片断数目越少，所需的重组子越少。

（1）对载体的要求,载体系列：

容量为24kpcosmid载体：

容量为50kbYAC：

容量为1MbBAC:

容量为300kb,断点完全随机，片断长度合适于载体连接。

不能用一般的限制性内切酶消化法。

（1）染色体DNA大片段的制备,3.基因文库构建的一般步骤,超声波（300bp）或机械搅拌（8kb）。

物理切割法：

内切酶Sau3A进行局部消化。

可得到10-30kb的随机片断。

酶切法：

（2）载体与基因组DNA大片段的连接,粘性末端直接连接,载体与外源DNA大片段的两个末端都有相同的粘性末端。

如：

Sau3A与BamHI的酶切末端。

直接连接、人工接头或同聚物加尾。

人工接头法（adapter）,人工合成的限制性内切酶粘性末端片断。

各种酶的接头可以向公司定做或购买。

接上人工接头,粘性末端,CCC,CCC,末端转移酶,粘性末端,同聚物加尾,4.基因组文库的大小,一个文库要包含99%的基因组DNA时所需要的克隆数目。

N=,ln（1-p）,ln（1-f）,:

文库包含了整个基因组DNA的概率（99%）,f:

插入载体的DNA片断的平均长度占整个基因组DNA的百分数,N：

所需的重组载体数（克隆数）,例如：

人的基因组是3109bp，插入DNA片断的平均长度如果是1.7104bp,N=,ln（1-p）,ln（1-f）,=,ln（1-99%）,ln（1-f）,=,4.61,G,f,N=,4.61,G,f,G：

Genome大小；f：

fragment大小,N=,4.61,G,f,=,4.61,3109,1.7104,=8.1105,1.cDNA,以mRNA为模板逆转录出的DNA称cDNA。

2.cDNAlibrary,四、从cDNA文库中钓取目的基因,mRNA,cDNA,3,3,5,5,反转录酶,引物,利用某种生物的总mRNA合成cDNA，再将这些cDNA与载体连接，转入细菌细胞中进行保存和扩增，称cDNA文库。

（1）不含内含子序列。

（2）可以在细菌中直接表达。

（3）包含了所有编码蛋白质的基因。

（4）比DNA文库小的多，容易构建。

4.构建cDNA文库的一般步骤,

（1）总RNA（totalRNA）提取,3.cDNA文库的特点,提取总RNA有商业化的试剂盒（kit）。

分离mRNA用商业化的OligodT纤维柱。

利用mRNA都含有一段polyA尾巴，将mRNA从总RNA（rRNA、tRNA等）中分离纯化。

mRNA只占总RNA的1%-2%。

（2）mRNA的分离纯化,原理,mRNA的分离纯化,Column（柱）,反转录酶,（3）cDNA的合成,cDNA第一链合成,逆转录酶能以RNA为模板合成DNA。

用OligodT（或随机引物）作引物，合成cDNA的第一链。

mRNA,cDNA,3,5,5,AAAAAAA,TTTTTTT,OligodT引物,用碱处理或用RNaseH降解mRNA-DNA杂交分子中的mRNA。

mRNA,cDNA,3,3,5,5,反转录酶,引物,mRNA,cDNA第一链,3,3,5,5,引物,cDNA第一链,3,5,引物,降解mRNA模板,或RNaseH,碱,剩下的cDNA单链的3末端一般形成一个弯回来的双链发卡结构（机理不明），可成为合成第二条cDNA链的引物。

用DNA聚合酶合成第二链DNA.。

cDNA第一链,5,cDNA第二链合成,DNA聚合酶,cDNA第一链,cDNA第二链,5,3,cDNA第二链合成,去掉发卡结构,核酸酶S1,用核酸酶S1可以切掉发卡结构（但这会导致cDNA中有用的序列被切掉！

）。

cDNA第一链,cDNA第二链,5,3,cDNA第一链,cDNA第二链,5,3,5,3,在双链cDNA末端接上人工接头，即可与载体连接，转入受体菌。

或借助末端转移酶给载体和双链cDNA的3端分别加上几个C或G，成为粘性末端。

5.cDNA与载体连接：

接上人工接头,粘性末端,CCC,CCC,末端转移酶,6.cDNA文库的大小,一个cDNA文库要包含99%的mRNA时所需要的克隆数目。

N=,ln（1-p）,ln（1-）,:

文库包含了完整mRNA的概率（99%）,:

某一种低丰度（不足14份拷贝）mRNA占细胞整个mRNA的比例,N：

所需的重组载体数（克隆数）,1,n,1,n,文库的查询（screening）,用目的基因探针与文库中的重组载体进行Southernblot杂交。

文库,载体,探针,电泳后杂交放射自显影,测序分析,五、PCR扩增获得目的基因,1.直接从基因组中扩增,

（1）提取基因组DNA作模板,

（2）根据目的基因序列设计引物,（3）PCR扩增,真核生物基因组含有内含子！

适合扩增原核生物基因。

原核基因组部分,原核细胞,提取基因组DNA,PCR扩增,

（1）提取基因组totalRNA,

（2）反转录合成总cDNA作模板,（4）PCR扩增,（3）根据目的基因序列设计引物,2.从mRNA中扩增:

RT-PCR,原核生物不易得到mRNA，也不含有polyA尾。

适合扩增真核生物基因。

目的基因的引物1,反转录成目的基因cDNA第一链,目的基因的引物2,目的基因cDNA第二链,PCR,mRNA,克隆外源基因,外源DNA,载体DNA,重组分子,原核细胞,真核细胞,扩增或表达,表达,连接,转化或转导,电穿孔或显微注射,受体细胞,第二节基因的重组与转移,

（一）、粘性末端的连接,DNA连接酶把相互靠近的5端磷酸与3-OH连到一起。

一DNA片段的体外连接,1.两段DNA的连接,依靠粘性末端,2.DNA片断与载体的连接,依靠粘性末端,ligase,nick,

（二）、齐平末端（bluntend）的连接,5端与3端并列靠近的时间太短，不容易被连接酶连接。

1.直接连接,T4DNA连接酶虽然能连接平末端，但效率很低，只有粘性末端的1%。

5,5,5,5,3,3,3,3,-OH,-OH,-P,-P,P-,P-,HO-,HO-,5,3,-OH,-P,P-,HO-,5,3,1972年，斯坦福大学的P.Labban和P.Kaiser提出。

（1）同聚加尾法,2.人工加尾形成“粘性末端”,DNA末端转移酶能在没有模板的情况下给DNA的3-OH端加上脱氧核苷酸。

原理：

分别给载体和插入片断加上互补的核苷酸。

加尾碱基互补,缺点：

优点：

能把任何片段连接起来,不能把插入片段再切下来。

非酶切位点,用T4DNA连接酶连到平端DNA上，然后再用酶切，形成一个人工粘性末端。

（2）衔接物（linker）连接,linker,用化学合成法合成的一段10-12bp的特定限制性内切酶识别位点序列的平端双链。

GGAATTCCCCTTAAGG,EcoRIlinker：

linker的作用,缺点：

1）可以用内切酶把插入片段切下来。

如果插入片段内部也有该酶位点，不能切下完整的插入片段,2）能给载体连接上Polylink