基因克隆的策略及实例分析.ppt

1、第四章 基因克隆的策略,引 言第一节 目的基因的获得第二节 基因的重组与转移 第三节 重组体克隆的筛选和鉴定第四节 实例分析,基因克隆的策略及实例分析,引 言,基因克隆的本质是把某一目标DNA片段通过无性的方式进行扩增和表达，而这一过程往往是通过载体和寄主细胞来实现的。一般而言，基因克隆包括四部分工作：1、目标DNA片段的获得；2、克隆载体的构建；3、寄主细胞的转化；4、重组体克隆的选择和鉴定。目前，以大肠杆菌为寄主，以质粒和噬菌体等为载体的基因克隆体系已经相当的成熟，本章将以这种克隆模式为主体对基因克隆的策略展开讨论和分析。,大肠杆菌作为寄主进行DNA克隆的实验方案,DNA片段的获得,载体构

2、建,细菌转化,重组体的鉴定,限制性内切酶消化,机械切割,双链cDNA的合成,化学法直接合成,同聚物加尾,粘性末端连接,平末端连接,加接头造成粘性末端,重组噬菌体DNA转染,重组质粒的转化,体外包装进行转导,表型鉴定,核酸杂交,免疫学分析,酶切鉴定,第一节 目的基因的获得,一、化学法直接合成基因二、从基因组文库中钓取目的基因三、从cDNA文库中钓取目的基因四、通过PCR直接扩增出目的基因,一 基因组DNA片断化,（一）限制性内切酶法,用限制性内切酶把基因组DNA切成不同大小的片断。,酶切,由于带有粘性末端，产物可以直接与载体连接。,1.优点,2.缺点,目的基因内部也可能有该内切酶的切点。目的基因

3、也被切成碎片！,BamH I,BamH I,BamH I,gene,（二）随机片断化,1.限制性内切酶局部消化法,控制内切酶的用量和消化时间，使基因组中的酶切位点只有一部分被随机切开。,内切酶识别位点的碱基数,影响所切出的产物的长度和随机程度。,（1）限制性内切酶的选用原则,1）4bp的内切酶,平均每46（4096）bp一个切点。,2）6bp的内切酶,平均每44（256）bp一个切点。,随机程度高。如Hae、AluI、Sau3A。,内切酶粘性末端,能与常用克隆位点相连。,（Sau3ABamH I）,2.机械切割法,（1）超声波,超声波强烈作用于DNA，可使其断裂成约300bp的随机片断。,（2

4、）高速搅拌,1500转/分下搅拌30min，可产生约8kb的随机片断。,1976年H.G.Khorana提出了用化学方法合成基因的设想，并于1979年在science上发表了率先成功地合成大肠杆菌酪氨酸tRNA基因的论文。,二 化学合成目的基因,（一）目前常用的方法,磷酸二酯法、,磷酸三酯法、,亚磷酸三酯法、,固相合成法,自动化合成法。,保护dNTP的5端P 或3端-OH,用酸或碱的脱保护,（1）原理,1.磷酸二酯法,带保护的单核苷酸连接,保证合成反应的定向进行。,带5保护的单核苷酸与带3保护的另一个单核苷酸以磷酸二酯键连接起来。,（2）合成过程,下一个5端保护的单核苷酸又可以同3端保护的二核

5、苷酸聚合。,原理与磷酸二酯法一样。只是参加反应的单核苷酸都是在3端磷酸和5-OH上都先连接了一个保护基团。,2.磷酸三酯法,将第一个核苷酸的3-OH端固定在固相支持物上。,固相磷酸三酯合成法,是目前通用的合成方法。,15,合成的二核苷酸连接处有三个酯键！,固相磷酸三酯合成过程,固相支持物,结果是全保护的DNA：5 DMT,3固相支持物,核苷酸之间对氯苯。最后脱保护,固相 支持物,固相 支持物,C,化学合成的DNA片断一般在200bp以内。,（二）、化学合成DNA片断的组装,用T4多核苷酸激酶使各个片段的5端带上磷酸。,1.互补连接法,预先设计合成的片断之间都有互补区域，不同片断之间的互补区域能

6、形成有断点的完整双链。,（2）5端磷酸化,（1）互补配对,（合成的DNA单链的5端是-OH）,T4 DNA连接酶,T4多核苷酸激酶,使5-OH磷酸化,完整的DNA双链,（3）连接酶连成完整双链,2.互补延伸连接法,预先设计的片断之间有局部互补区，可以相互作为另一个片断延长的引物，用DNA聚合酶延伸成完整的双链。,3,5,5,3,5,3,T4DNA连接酶,Klenow片段,引物,1.直接合成基因,（三）、寡聚核苷酸化学合成的优点,2.合成引物（20mer左右）,（1）mRNA的含量很低，很难作cDNA,3.合成探针序列,4.定点突变合成,合成带有定点突变的基因片断。,（2）有些基因比较短，化学合

7、成费用较低,DNA合成仪,5.合成人工接头或衔接物,含有各种酶切位点人工接头（Adaptor）或衔接物（Linker）序列。,EcoRI,EcoRI,Linker,Adaptor,将某种生物细胞的整个基因组DNA切割成大小合适的片断，并将所有这些片断都与适当的载体连接，引入相应的宿主细胞中保存和扩增。理论上讲，这些重组载体上带有了该生物体的全部基因，称为基因文库。,（一）、基因文库的构建,1.基因文库（gene library）,三 从基因组文库中钓取目的基因,（2）目前常用的载体,2.构建基因文库的载体选用,载体能够容载的DNA片断大小直接影响到构建完整的基因文库所需要的重组子的数目。,载体

8、容量越大，所要求的DNA片断数目越少，所需的重组子越少。,（1）对载体的要求,载体系列：容量为 24 kp cosmid载体：容量为 50 kb YAC：容量为 1 Mb BAC:容量为 300 kb,断点完全随机，片断长度合适于载体连接。不能用一般的限制性内切酶消化法。,（1）染色体DNA大片段的制备,3.基因文库构建的一般步骤,超声波（300bp）或机械搅拌（8kb）。,物理切割法：,内切酶Sau3A进行局部消化。可得到10-30kb的随机片断。,酶切法：,（2）载体与基因组DNA大片段的连接,粘性末端直接连接,载体与外源DNA大片段的两个末端都有相同的粘性末端。,如：Sau3A与BamH

9、I的酶切末端。,直接连接、人工接头或同聚物加尾。,人工接头法（adapter）,人工合成的限制性内切酶粘性末端片断。,各种酶的接头可以向公司定做或购买。,接上人工接头,粘性末端,CCC,CCC,末端转移酶,粘性末端,同聚物加尾,4.基因组文库的大小,一个文库要包含99%的基因组DNA时所需要的克隆数目。,N=,ln(1-p),ln(1-f),:文库包含了整个基因组DNA的概率（99%）,f:插入载体的DNA片断的平均长度占整个基因 组DNA的百分数,N：所需的重组载体数（克隆数）,例如：人的基因组是 3109 bp，插入DNA片断的平均长度如果是1.7104 bp,N=,ln(1-p),ln(

10、1-f),=,ln(1-99%),ln(1-f),=,4.61,G,f,N=,4.61,G,f,G：Genome大小；f：fragment大小,N=,4.61,G,f,=,4.61,3109,1.7104,=8.1105,1.cDNA,以mRNA为模板逆转录出的DNA称cDNA。,2.cDNA library,四、从cDNA文库中钓取目的基因,mRNA,cDNA,3,3,5,5,反转录酶,引物,利用某种生物的总mRNA合成cDNA，再将这些cDNA与载体连接，转入细菌细胞中进行保存和扩增，称cDNA文库。,（1）不含内含子序列。（2）可以在细菌中直接表达。（3）包含了所有编码蛋白质的基因。（4

11、）比DNA文库小的多，容易构建。,4.构建cDNA文库的一般步骤,（1）总RNA（total RNA）提取,3.cDNA文库的特点,提取总RNA有商业化的试剂盒（kit）。,分离mRNA用商业化的Oligo dT纤维柱。,利用mRNA都含有一段polyA尾巴，将mRNA从总RNA（rRNA、tRNA等）中分离纯化。mRNA只占总RNA的1%-2%。,（2）mRNA的分离纯化,原理,mRNA的分离纯化,Column（柱）,反转录酶,（3）cDNA的合成,cDNA第一链合成,逆转录酶能以RNA为模板合成DNA。用Oligo dT（或随机引物）作引物，合成cDNA的第一链。,mRNA,cDNA,3,

12、5,5,AAAAAAA,TTTTTTT,Oligo dT引物,用碱处理或用RNaseH降解mRNA-DNA杂交分子中的mRNA。,mRNA,cDNA,3,3,5,5,反转录酶,引物,mRNA,cDNA第一链,3,3,5,5,引物,cDNA第一链,3,5,引物,降解mRNA模板,或RNaseH,碱,剩下的cDNA单链的3末端一般形成一个弯回来的双链发卡结构（机理不明），可成为合成第二条cDNA链的引物。用DNA聚合酶合成第二链DNA.。,cDNA第一链,5,cDNA第二链合成,DNA聚合酶,cDNA第一链,cDNA第二链,5,3,cDNA第二链合成,去掉发卡结构,核酸酶S1,用核酸酶S1可以切掉

13、发卡结构（但这会导致cDNA中有用的序列被切掉！）。,cDNA第一链,cDNA第二链,5,3,cDNA第一链,cDNA第二链,5,3,5,3,在双链cDNA末端接上人工接头，即可与载体连接，转入受体菌。或借助末端转移酶给载体和双链cDNA的3端分别加上几个C或G，成为粘性末端。,5.cDNA与载体连接：,接上人工接头,粘性末端,CCC,CCC,末端转移酶,6.cDNA文库的大小,一个cDNA文库要包含99%的mRNA时所需要的克隆数目。,N=,ln(1-p),ln(1-),:文库包含了完整mRNA的概率（99%）,:某一种低丰度（不足14份拷贝）mRNA占细胞整个mRNA的比例,N：所需的重组

14、载体数（克隆数）,1,n,1,n,文库的查询（screening）,用目的基因探针与文库中的重组载体进行Southern blot杂交。,文库,载体,探针,电泳后杂交放射自显影,测序分析,五、PCR扩增获得目的基因,1.直接从基因组中扩增,（1）提取基因组DNA作模板,（2）根据目的基因序列设计引物,（3）PCR扩增,真核生物基因组含有内含子！,适合扩增原核生物基因。,原核基因组部分,原核细胞,提取基因组DNA,PCR扩增,（1）提取基因组 total RNA,（2）反转录合成总cDNA作模板,（4）PCR扩增,（3）根据目的基因序列设计引物,2.从mRNA中扩增:RT-PCR,原核生物不易得

15、到mRNA，也不含有polyA尾。,适合扩增真核生物基因。,目的基因 的引物1,反转录成目的基因cDNA第一链,目的基因 的引物2,目的 基因cDNA第二链,PCR,mRNA,克隆外源基因,外源DNA,载体DNA,重组分子,原核细胞,真核细胞,扩增或表达,表达,连接,转化或转导,电穿孔或显微注射,受体细胞,第二节 基因的重组与转移,（一）、粘性末端的连接,DNA连接酶把相互靠近的5端磷酸与3-OH连到一起。,一 DNA片段的体外连接,1.两段DNA的连接,依靠粘性末端,2.DNA片断与载体的连接,依靠粘性末端,ligase,nick,（二）、齐平末端（blunt end）的连接,5端与3端并列

16、靠近的时间太短，不容易被连接酶连接。,1.直接连接,T4DNA连接酶虽然能连接平末端，但效率很低，只有粘性末端的1%。,5,5,5,5,3,3,3,3,-OH,-OH,-P,-P,P-,P-,HO-,HO-,5,3,-OH,-P,P-,HO-,5,3,1972年，斯坦福大学的P.Labban和P.Kaiser提出。,（1）同聚加尾 法,2.人工加尾形成“粘性末端”,DNA末端转移酶能在没有模板的情况下给DNA的3-OH端加上脱氧核苷酸。,原理：,分别给载体和插入片断加上互补的核苷酸。,加尾碱基互补,缺点：,优点：,能把任何片段连接起来,不能把插入片段再切下来。,非酶切位点,用T4 DNA连接酶连到平端DNA上，然后再用酶切，形成一个人工粘性末端。,（2）衔接物(linker)连接,linker,用化学合成法合成的一段10-12bp的特定限制性内切酶识别位点序列的平端双链。,GGAATTCC CCTTAAGG,EcoRI linker：,linker的作用,缺点：,1）可以用内切酶把插入片段切下来。,如果插入片段内部也有该酶位点，不能切下完整的插入片段,2）能给载体连接上Polylink