动植物基因组denovo常见问题.docx
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动植物基因组denovo常见问题
动植物基因组denovo常见问题
基础知识
1、什么是基因组denovo测序
答：
对某一物种进行高通量测序，利用高性能计算平台和生物信息学方法，在不依赖于参考基因组的情况下进行组装，从而绘制该物种的全基因组序列图谱。
2、普通基因组的定义
答：
单倍体，纯合二倍体或者杂合度<%，且重复序列含量<50%，GC含量为35%到65%之间的二倍体。
3、复杂基因组的定义
答：
杂合率＞%，重复序列含量＞50%，GC含量处于异常的范围（GC含量＜35%或者GC含量＞65%＝的二倍体，多倍体。
诺禾致源对二倍体复杂基因组进一步细分为微杂合基因组（%＜杂合率＜%＝、高杂合基因组（杂合率＞%）以及高重复基因组（重复序列比例>50%）。
4、怎么查询基因组的大小
答：
查询植物基因组大小的网站：
；
查询动物基因组大小的网站：
。
5、基因组的项目周期
6、基因组承诺的组装指标
答：
简单基因组：
contigN50>20K，scaffoldN50>500K；
复杂基因组：
contigN50>20K，scaffoldN50>300K。
样品要求
1、动植物基因组测序对取样有什么要求
答：
植物：
需要黑暗无菌条件下培养的黄化苗、组培苗，基因组样本量500μg~1mg，越多越好。
选择纯合或杂合度尽可能小的样品（杂合度<%）。
动物：
应选取肌肉、血液等含脂肪较少的部位取样，尽量选择同一个体取样，以减少个体差异性对后续拼接的影响。
基因组样本量500μg~1mg，越多越好。
样本的性别决定模式是XY型，则尽量选择雌性个体（XX型），如果是ZW型，则尽量选择雄性个体（ZZ型）。
2、全基因组测序对DNA样本有什么要求
答：
（1）样品需求量（单次）：
小片段文库，≥3μg；2Kb~5Kb大片段文库，≥20μg；10Kb~20Kb大片段文库，≥60μg；完成全基因组测序样品DNA量需求约为500μg~1mg；
（2）样品浓度：
对于小片段文库，≥50ng/μl，对于2Kb~5Kb大片段文库，≥150ng/μl；对于10Kb~20Kb大片段文库，≥150ng/μl；
（3）样品纯度：
OD260/280=~；无蛋白质、RNA污染或肉眼可见杂质污染；
（4）样品质量：
基因组完整。
如需建立≥5Kb的插入片段文库，则电泳结果，基因组DNA主带≥23Kb；脉冲场电泳结果，基因组DNA主带≥40Kb。
文库构建
1、基因组测序的文库构建及测序策略
答：
简单基因组：
180bp、500bp、2K、5K、10K；PE100测序；测序深度一般为100-150X；
复杂基因组：
180bp、300bp、500bp、2K、5K、10K、20K；PE100测序；测序深度一般为200-300X。
2、DNAFragment文库的定义、用途及实验流程
答：
（1）定义：
将基因组或大片段DNA随机打断成＜800bp的小片段（主要为200bp、300bp、500bp等），加上特定接头做成DNA文库后直接对DNA片段进行单末端（Single-End）或者双末端（Paired-End）测序，不需要克隆到细菌中，可以获得大量的DNA序列信息。
（2）用途：
DNAFragment文库制备的整个过程只需2天，单末端测序长度可达100bp，双末端为200bp。
该技术测序通量高，可在全基因组水平上最大限度的、完整的获取基因组及多态性信息。
广泛地应用于基因组的denovo测序、基因组重测序、BAC测序和长片段PCR产物测序等。
（3）实验流程：
3、DNAmate-pair文库的定义、用途及实验流程
答：
（1）定义：
首先将基因组DNA随机打断到特定大小（2-20kb）；然后经末端修复，生物素标记和环化等实验步骤后，再把环化后的DNA分子打断成400-600bp的片段并通过带有链亲和霉素的磁珠将带有生物素标记的片段捕获。
这些捕获的片段再经末端修饰和加上特定接头后建成大片段文库，不需要克隆到细菌中，直接在Illumina测序仪上进行测序。
通过大片段文库构建，从而获得基因组中较大跨度（2-20kb）片段两端的序列。
（2）用途：
DNAMate-pair文库制备的整个过程需要5天，这种从较大跨度两端所获得的序列对基因组denovo项目的组装和基因组结构变异发掘具有非常重要的作用。
（3）实验流程：
信息分析
1、什么是Read、Contig、Scaffold
答：
Read：
测序读到的碱基序列片段，测序的最小单位；
Contig：
由reads通过对overlap区域拼接组装成的没有gap的序列段；
Scaffold：
通过pairends信息确定出的contig排列，中间有gap。
2、什么是N50，N70，N90
答：
把组装出的contigs或scaffolds从大到小排列，当其累计长度刚刚超过全部组装序列总长度50%时，最后一个contig或scaffold的大小即为N50的大小，N50对评价基因测序的完整性有重要意义；N70和N90的计算方法与N50类似，只是百分数变为70%或90%。
3、普通基因组的解决方案
答：
诺禾采用自主升级的SOAPdenovoII进行普通基因组组装。
组装流程（图1）包括：
（1）构建不同长度的插入片段文库；
（2）构建deBrujin图；
（3）化简deBrujin图；
（4）构建contigs；
（5）构建scaffolds；
（6）补gaps；
诺禾致源的技术升级包括：
（1）开发了新的序列纠错模块，降低测序错误对组装的影响；
（2）在contigs组装步骤，开发了StepK连接模块，以混合拼接算法连接contigs，从而提升原始的contigs长度；
（3）在scaffolds组装步骤，开发了ctgdistanceevaluation模块，更精确地评估contigs间的距离；同时开发了scafconstruction模块，以新的连接单位来组装scaffold，从而提升scaffolds的连接准确率及长度。
图1 基因组denovo测序及拼接组装流程
经过以上几步，最终简单基因组的组装结果至少应达到contigN50>20K，scaffoldN50>300K。
4、复杂基因组（二倍体杂合）的解决方案
答：
针对复杂基因组中二倍体杂合基因组，诺禾致源开发了NOVOheter软件，成功实现了二倍体杂合基因组组装。
与SOAPdenovo相比，NOVOheter软件组装二倍体杂合基因组的技术创新主要体现在以下几个方面：
（1）通过高深度测序（200-300X）将基因组上的杂合和纯合区域分开；
（2）利用reads信息和PE关系连接杂合位点，延长原始contigs：
在杂合部分间距离较短的情况下，利用reads信息将杂合位点连接起来，若杂合部分间距离较长时，利用Pair-End关系连接杂合位点（所以需要加入更多类型的小片段文库，以连接不同距离的杂合位点），从而提高了contigs的长度，为后续组装打下基础（图3）；
图3基于NOVOheter软件构建contigs
a：
利用深度信息区分杂合部分（覆盖度为n）和纯合部分（覆盖度为2n）；
b：
若杂合部分的距离较短（如60bp），则可利用reads信息将杂合位点连接起来；
c：
若杂合部分的距离较长（如400bp），则利用Pair-End关系，将杂合位点连接起来；
d：
得到杂合contigs。
注：
图中不同颜色的点表示杂合位点。
（3）分区域构建scaffolds：
同样利用contigs深度信息区分纯合contigs和杂合contigs；利用Pair-End关系将纯合contigs，杂合contigs分别组装成scaffolds；最后将相邻的纯合contigs和杂合contigs进行连接，构建更长的scaffolds。
5、如何评价组装结果
答：
常染色体区的覆盖度：
评价基因组常染色体区的覆盖度，可以用BAC或者是Fosmid序列来评估；把已公布或者客户提供的BAC或fosmid克隆序列作为Refrence，将拼接完成的基因组序列map回已知的BAC或者fosmid序列上，检查拼接的序列对已知序列的覆盖度到什么水平。
基因区的覆盖度：
评价基因区的覆盖度，可以用EST序列或者是转录组序列来评估；把已公布或者客户提供的EST或转录组序列作为query序列map到拼接完成的基因组序列上，检查拼接序列对已知序列的覆盖度是达到什么水平。
6、影响基因组组装的因素
答：
基因组的重复序列和杂合度，是否污染以及基因组的倍性情况。
7、基因组项目的标准生物信息分析的内容
答：
基因组项目的标准生物信息分析的内容如下：
（1）数据处理；
（2）基因组组装：
基因组评估：
基因组大小、GC含量、复杂序列、杂合度评；
组装：
数据纠错；Contig、Scaffold组装；Gap填充；组装质量分析、评估和结果统计；
（3）基因组注释：
重复序列注释；基因预测；基因组功能注释；非编码RNA注释；
（4）比较基因组学分析：
基因家族鉴定；
基因组共线性分析；
全基因组复制分析（动物：
WGAC；植物：
WGD）；
正选择基因的鉴定及功能分析；
基因家族的扩增收缩分析；
系统发育分析；
物种分化时间估。
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