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酶工程实验3doc

实验一过氧化氢酶米氏常数的测定

一、目的

了解米氏常数的意义，测定过氧化氢酶的米氏常数。

二、实验原理

H2O2被过氧化氢酶分解出H2O和O2，未分解的H2O2用KMNO4在酸性环境中滴定，根据反应前后H2O2的浓度差可求出反应速度。

本实验以马铃薯提供过氧化氢酶，以1/ν~1/[S]作图求Km

三、实验器材

1.锥形瓶100～150ml（×6）。

2.吸管1.0ml（×2）、0.5ml（×2）、2.0ml（×2）、5ml（×2）、10.0ml（×1）。

3.温度计（0～100℃）。

4.微量滴定管5ml（×1）。

5.容量瓶1000ml（×1）。

四、实验试剂

1、0.02mol/L磷酸缓冲液（Ph7.0）

取磷酸二氢钾0.68g，加0.1mol/L氢氧化钠溶液29.1ml，用水稀释至100ml,即得。

2、酶液：

称取马铃薯5g，加上述缓冲液10ml，匀浆，过滤。

3、0.02mol/LKMnO4：

称取KMnO4（AR）3.2g，加蒸馏水1000ml，煮沸15min，2d后过滤，棕色瓶保存。

4、0.004mol/LKMnO4：

准确称取恒重草酸钠0.2g，加250ml冷沸水及10ml浓硫酸，搅拌溶解，用0.02ml/L的KMnO4滴定至微红色，水浴，加热至65℃，继续滴定至溶液微红色并30s不褪，算出KMnO4的准确浓度稀释成0.004mol/L即可。

5、0.05mol/LH2O2：

取30%H2O223ml加入1000ml容量瓶中，加蒸馏水至刻度（约0.2mol/L），用标准KMnO4（0.004mol/L）标定其准确浓度，稀释成0.05mol/L（标定前稀释4倍，取2.0ml，加25%H2SO42.0ml，用0.004mol/LKMnO4滴定至微红色）。

6、25%H2SO4

五、操作

取锥形瓶6只，按下表顺序加入试剂：

表一过氧化氢酶米氏常数的测定

管号

试剂

0.05mol/LH2O2/ml

蒸馏水/ml

酶液/ml

9.5

0.5

1.00

8.50

0.5

1.25

8.25

0.5

1.67

7.83

0.5

2.5

7.0

0.5

5.00

4.50

0.5

先加好0.05mol/LH2O2及蒸馏水，加酶液后立即混合，依次记录各瓶的起始反应时间。

各瓶时间达5min时立即加2.0ml25%硫酸终止反应，充分混匀。

用0.004mol/LKMnO4滴定各瓶中剩余的H2O2至微红色，记录消耗的KMnO4体积。

六、计算

分别求出各瓶的底物浓度[S]和反应速度v。

[S]=c1V1/10

式中[S]：

底物物质的量浓度（mol/L）；

c1：

H2O2物质的量浓度（mol/L）；

V1：

H2O2体积（ml）；

10：

反应的总体积（ml）；

υ：

反应速度（mmol/min）；

c2：

KMnO4物质的量浓度（mol/L）；

V2：

KMnO4体积（ml）；

以1/υ对1/[S]作图求出Km。

实验二酶促反应中初速度时间范围测定

一、实验目的

1.了解酶促反应中初速度时间范围测定的基本原理；

2.掌握酶促反应中初速度时间范围的测定方法。

二、实验原理

酸性磷酸酯酶（acidphosphatase,EC3.1.3.2）广泛分布于动植物体中，尤其是植物的种子、动物肝脏和人体的前列腺中。

它对生物体内核苷酸、磷蛋白和磷脂的代谢起着重要作用。

酸性磷酸酯酶能专一性水解磷酸单酯键。

以人工合成的对硝基苯磷酸酯（4-nitrophenylphosphate,NPP）作底物，水解产生对硝基苯酚和磷酸。

在碱性溶液中，对硝基酚的盐离子于405nm处光吸收强烈，而底物没有这种特性。

利用产物的这种特性，可以定量的测定产物的生成量，从而求得酶的活力单位。

即通过测定单位时间内405nm处光吸收值的变化来确定酸性磷酸酯酶的活性。

酸性磷酸酯酶的一个活力单位是指在酶反应的最适条件下，每分钟生成1μmol产物所需的酶量。

要进行酶活力测定，首先要确定酶反应时间。

而酶的反应时间应该在初速度时间范围内选择。

可以通过进程曲线的制作来求出酶的初速度时间范围。

进程曲线的制作是指在酶反应的最适条件下，采用每隔一定时间测定产物生成量，以酶反应时间为横坐标，产物生成量为纵坐标绘制而成。

从进程曲线可知，在曲线起始的一段时间内为直线，其斜率代表初速度。

随着反应时间的延长，曲线趋于平坦，斜率变小，反应速度下降。

要真实反映出酶活力大小，就应在初速度时间内测定。

三、实验试剂与器材

1.试剂

（1）酸性磷酸酯酶原液（从绿豆芽中提取）

（2）酸性磷酸酯酶液（通过原酶液稀释得到）

取原酶液，用0.05mol/L、pH5.0柠檬酸盐缓冲液稀释，使进程曲线中第11号管吸光度A405在0.6～0.7之间。

（3）1.2mmol/L对硝基苯磷酸酯

精确称取NPP0.4454g，加缓冲液定容至100mL。

（4）0.3mol/LNaOH溶液

2．器材

恒温水浴槽，可见分光光度计，试管，刻度吸管，离心机。

四、操作步骤

1.酸性磷酸酯酶原酶液的制备

称取一定重量的绿豆，浸泡24h，在25～30°C温箱中培养5～7d。

长出的豆芽取其颈部，依次用自来水和重蒸水冲洗干净，置滤纸上吸干水分，称30g放入研钵中匀浆，加0.2mol/L乙酸盐缓冲液4mL，置4°C冰箱中6h以上。

然后用双层纱布挤压过滤，滤液6000r/min离心15min,上清液置透析袋用蒸馏水充分透析，间隔换水10次，透析24h以上。

将透析后酶液稀释至最终体积与豆芽质量（g）相等，以6000r/min离心30min，所得上清液即为原酶液，置冰箱待用。

2.酶促反应

取试管12支，按表1.1编号，0号为空白。

各管加入1.0mL1.2mol/LNPP；另外2支试管，各加入稀释好的酶液7mL，在酶反应前底物与酶都放入35°C恒温水浴槽中预热2min。

然后向1～11号管内各加入1.0mL预热的酶液。

立即摇匀并开始计时。

按时间间隔为3min、5min、7min、10min、12min、15min、20min、25min、30min、40min、50min进行反应。

待反应进行到上述各相应时间时，加入3.0mL0.3mol/LNaOH终止反应。

冷却后以0号管作空白（0号管加入1.0mLNPP后保温25min，然后加入3.0mL0.3mol/LNaOH，再加入1.0mL酶液），在分光光度计上测定各管A405值。

3.数据处理

以反应时间为横坐标，A405值为纵坐标绘制进程曲线。

由进程曲线中直线部分求出酸性磷酸酯酶反应初速度的时间范围。

表1.1制作酶促反应进程曲线时各物质加入量

试管号

NPP（mL）

稀释酶液（mL）

反应时间（min）

0．3MNaOH（mL）

1.0

3.0

1.0

3.0

1.0

3.0

1.0

3.0

1.0

3.0

1.0

3.0

1.0

3.0

1.0

3.0

1.0

3.0

1.0

3.0

1.0

3.0

1.0

3.0

五、实验报告

绘出酶促反应进程曲线，记录实验结果，计算酸性磷酸酯酶反应初速度的时间范围。

实验三酵母蔗糖酶的部分纯化与酶活测定

一、目的：

了解酶的纯化方法。

二、原理：

酵母中含有丰富的蔗糖酶（EC.3.2.1.26），本实验以酵母为原料，通过破碎细胞方式得到粗酶，并用热变性法除杂蛋白纯化。

（请参考相关教材）

三、试剂与仪器

1、试剂与材料：

（1）干酵母

（2）石英砂

（3）1mol/L醋酸溶液

（4）2mol/L氢氧化钠溶液

（5）醋酸缓冲液（pH4.6）

（6）5%蔗糖溶液

（7）DNS（3,5-二硝基水杨酸）试剂

2、仪器：

电子天平、离心机、分光光度计、水浴锅、电炉、研钵、试管、三角瓶、量筒、移液管。

四、操作方法

1、破碎细胞

取2g干酵母于研钵中，加入2g石英砂，加30ml去离子水，研磨15min，放入冰箱冷冻室（-20℃）冰冻约20min（研磨液面上刚出现冰结为宜）。

取出冷冻酵母，再研磨5min后，在5000r/min条件下离心12min，小心取出上清液（组分一）并量出体积V1，分别取0.5ml上清液到试管A、B中，余者倒入三角瓶。

2、纯化

把三角瓶中的上清液用1mol/L醋酸溶液调pH5.0（试纸）。

然后迅速放入到55℃的水浴中，保温30min。

之后在冰浴中迅速冷却。

在5000r/min条件下离心12min。

取出上清液（组分二）并量出体积V2，分别取0.5ml上清液到试管C、D中。

3、酶反应

取四支试管，分别按顺序加入反应物：

试管编号

①酶液

②氢氧化钠溶液

③醋酸缓冲液

④蔗糖溶液

A（对照管）

0.5ml

1ml

0.5ml

---

2ml

1ml

C（对照管）

0.5ml

1ml

0.5ml

---

2ml

1ml

试管中反应物在55℃水浴中反应5min（秒表计时）后，B、D管立即各加入1ml氢氧化钠溶液（2mol/L）终止反应，A、C管中各加入1ml蒸馏水。

4、酶催化产物检测

取5支试管，分别加入反应物：

试管编号

反应液

DNS试剂

0.5mlA

0.5ml

0.5mlB

0.5ml

0.5mlC

0.5ml

0.5mlD

0.5ml

5（空白）

0.5ml蒸馏水

0.5ml

试管中反应物在沸水浴中反应5min，然后冷却。

加入4ml蒸馏水。

将各试管摇匀，用空白管溶液（5号管）调零点，测定它们的吸光度值A540。

五、结果计算

1、酶活力单位的定义：

本实验中，蔗糖酶的活力单位指在55℃条件下，每1min催化底物转化为1mg还原糖的酶量。

2、酶活计算：

粗酶的计算酶活（组分一）：

纯化后酶的计算酶活（组分二）：

3、总酶活的计算：

总酶活1（组分一，粗酶）：

计算酶活×稀释倍数

总酶活2（组分二，纯化后酶）：

计算酶活×稀释倍数

4、酶活回收率的计算：

酶活回收率=

附：

还原糖和总糖的测定——3,5-二硝基水杨酸比色法

还原糖的测定是糖定量测定的基本方法。

还原糖是指含有自由醛基或酮基的糖类，单糖都是还原糖，双糖和多糖不一定是还原糖，其中乳糖和麦芽糖是还原糖，蔗糖和淀粉是非还原糖。

利用糖的溶解度不同，可将植物样品中的单糖、双糖和多糖分别提取出来，对没有还原性的双糖和多糖，可用酸水解法使其降解成有还原性的单糖进行测定，再分别求出样品中还原糖和总糖的含量（还原糖以葡萄糖含量计）。

还原糖在碱性条件下加热被氧化成糖酸及其它产物，3,5-二硝基水杨酸则被还原为棕红色的3-氨基-5-硝基水杨酸。

在一定范围内，还原糖的量与棕红色物质颜色的深浅成正比关系，利用分光光度计，在540nm波长下测定光密度值，查对标准曲线并计算，便可求出样品中还原糖和总糖的含量。

实验四蔗糖酶包埋及固定化酶活测定

一、目的：

了解凝胶包埋法及固定化酶活测定方法。

二、原理：

海藻酸钠在遇到Ca2+时成胶，从而把酶包埋在其中。

（请参考相关教材）

三、试剂与仪器

1、试剂与材料：

（8）干酵母

（9）海藻酸钠

（10）无水氯化钙

（11）5%蔗糖溶液

（12）DNS（3,5-二硝基水杨酸）试剂

2、仪器：

电子天平、分光光度计、水浴锅、电炉、烧杯、玻棒、量筒、试管、量筒、移液管、注射器（带7号针头）、纱布。

四、操作方法

4、配A液

取0.75g海藻酸钠溶在25ml蒸馏水中，沸水浴（勿用电炉直接加热）充分溶胀。

自然冷却。

5、配B液

取1g干酵母溶在25ml蒸馏水中（室温），搅匀。

6、配C液

A液冷却后，将B液倒入其中，搅匀。

4、配CaCl2液

取2.2g无水CaCl2溶于200ml蒸馏水中。

5、制备胶珠

用注射器（7号针头）将C液滴入CaCl2溶液，滴时不断搅拌溶液。

静置20min，固化胶珠。

纱布过滤得到胶珠，用蒸馏水清洗胶珠，称取湿胶珠质量（W1），并记录。

6、催化

取1g湿胶珠置于烧杯中，加入20ml5%蔗糖溶液，37℃反应10min，取出反应液，与胶珠分离，反应终止。

7、酶催化产物检测

将反应液定容至20ml，取0.5ml稀释至5ml，得D液。

取2支试管，分别加入反应物：

试管编号

反应液

DNS试剂

0.5mlD

0.5ml

2（空白）

0.5ml蒸馏水

0.5ml

试管中反应物在沸水浴中反应5min，然后冷却。

加入4ml蒸馏水。

将各试管摇匀，用空白管溶液调零点，测定它们的吸光度值A540。

五、结果计算

5、酶活力单位的定义：

本实验中，蔗糖酶的活力单位指在37℃条件下，每1min催化得到1mg还原糖所需酶量。

6、酶活计算：

1g固化酶酶活：

六、思考题

1、海藻酸钙包埋法中钙起什么作用？

与豆腐制作中Ca2+的作用有何关系？

2、除了凝胶包埋法，还有哪些包埋方法？

其原理是什么？

实验五尼龙固定化木瓜蛋白酶

一、目的：

了解共价交联法固定酶的原理和步骤

二、原理

尼龙是聚酰胺物质，经HCl水解后暴露出游离NH2，NH2与戊二醛反应，尼龙即成活化载体，可与酶表面NH2反应，把酶连在尼龙上。

三、实验材料、仪器和试剂

1、材料

尼龙布（86或66），140目，剪成3cm×3cm

2、仪器

（1）恒温水浴锅

（2）紫外分光光度计（3）冰箱

3、试剂

（1）18.6%CaCl2溶液

（2）甲醇溶液（3）3.65mol/LHCl溶液

（4）0.2mol/L硼酸缓冲液（pH值8.5）

（5）5%戊二醛溶液：

用0.2mol/L硼酸缓冲液配制，pH值8.5

（6）0.1mol/L磷酸缓冲液（pH值7.8）（7）1mg/mL木瓜蛋白酶溶液

（8）0.5mol/LNaCl溶液（9）0.1mol/L磷酸缓冲液（pH值7.2）

（10）激活剂：

用0.1mol/L磷酸缓冲液（pH值7.2）配制，含20mmol/L半胱氨酸、1mmol/LEDTA的混合液。

（11）0.5%酪蛋白溶液：

用0.1mol/L磷酸缓冲液（pH值7.2）配制。

（12）10%三氯乙酸（TCA）溶液。

四、操作步骤

1、固定化酶的制备

（1）每组取5块尼龙布洗净、晾干，浸入含18.6%CaCl2溶液10s，再浸入18.6%水的甲醇溶液中，轻轻搅拌5min以上至尼龙发粘。

取出后用水洗涤，用滤纸吸干。

（2）将尼龙布用3.65mol/LHCI溶液在室温下水解45min，用水洗至pH值中性（pH试纸检测）。

（3）将尼龙布用5%戊二醛溶液在室温下浸泡偶联20min。

（4）取出尼龙布，用0.1mol/L磷酸缓冲液（pH值7.8）洗涤3次，洗去多余的戊二醛，吸干之后，加入5ml1mg/mL的木瓜蛋白酶液，在室温下固定30min。

（5）从酶液中取出尼龙布，用0.5mol/LNaCl溶液（用0.1mol/L磷酸缓冲液（pH值7.2）配制），洗去多余的酶蛋白，即为尼龙固定化酶。

2、酶活力测定

A．0.2ml木瓜蛋白酶+1.8ml激活剂+1ml酪蛋白液

B．0.2ml木瓜蛋白酶+1.8ml激活剂+2ml10%三氯乙酸+1ml酪蛋白液

C.固定化酶一张（剪碎）+2.0ml激活剂+1ml酪蛋白液

取三支试管按上述加入反应液，37℃反应15min，A、C+2ml10%三氯乙酸。

三支试管过滤上清液到另三支试管中，以B管作空白，测试管A、C吸光值（280nm，紫外）

五、结果计算

1.酶活定义：

每15min增加0.001个消光值所需酶量为1个酶活单位。

2.酶活回收=

六、注意事项

（1）尼龙布的处理是本实验成败的关键，既要让其充分地活化，又不能使其破碎。

（2）固定化酶溶液浓度最好为0.5～1mg/mL，对每块尼龙布用量不宜超过0.8mL。

（3）酶活性测定的反应时间一定要准确。

实验六、产淀粉酶菌株的快速筛选

一、目的

学习和掌握分泌目的酶菌株的基本原理和筛选方法。

二、原理

产淀粉酶的菌株能分泌淀粉酶到菌落周围的培养基中，从而水解培养基中的淀粉，由于使用的是经活性染料标记的带颜色的淀粉（本实验为RBV-淀粉，呈鲜艳的紫红色），当其被淀粉酶作用后便形成可溶，且较易扩散的小分水解物，从而在该菌落周围形成颜色较浅的透明圈。

而透明圈直径与菌落直径之比则可反应菌落分泌淀粉酶能力的高低。

本方法有快速、简单易行等优点。

图1产淀粉酶菌落形成的透明圈

三、材料、试剂和仪器

1、菌的来源

取不同地点的表层土壤。

2、试剂：

RBV-Starch（Sigma）,NaNO3,K2HPO4,MgSO4,KCl,2mol/LNaOH无菌水和琼脂粉等。

3、器皿

250mL三角瓶两个、9.0cm培养皿若干、涂布棒、200µL移液枪、200µL枪头若干、牙签若干、指形管若干、10mL具塞刻度试管四支、滴管四支、取样器和塑料直尺等。

4、仪器设备

高压消毒锅、恒温通气式培养箱、摇床、离心机、电子天平等。

四、实验操作步骤

1、器皿的消毒：

培养皿、枪头、牙签、指形管、塞刻度试管、滴管四支等用四层报纸包好，在121℃下灭菌20min，取出备用。

2、培养基的配制与灭菌

培养基的组成为：

RBV-淀粉（1.2%,w/v），NaNO3（0.2%,w/v）,K2HPO4（0.2%,w/v）,MgSO4·7H2O（0.1%,w/v）,KCl（0.1%,w/v）,琼脂（2%,w/v）,调PH至6.0左右。

在三角瓶中，121℃灭菌20min，将灭菌后的培养基倒入培养皿，每皿大约15mL，静置凝固备用。

（倒平板之前务必将培养基摇晃均匀，以避免标记的RBV-淀粉在培养基中分布不均匀，影响菌落的观察。

）

3、土样的采集及稀释

于校园等不同地点采集土壤样品；取样时，用取样器向下打取1cm左右深度的土样，将从各个地点取得的土样混合；取样点最好选择有机质丰富的地方。

4、富集

称取5.0g混合土样和0.5g的淀粉混合，并加入适量的蒸馏水使其湿润，置于培养皿中富集培养24h。

5、菌种的初筛

称取1.0g步骤4所得的土样于灭菌具塞刻度试管中，在超净工作台内（亦可使用酒精灯，直接在实验台上完成），加入无菌水至5mL，振荡后静置，待土壤颗粒沉降后，取上层液1mL转移至另一刻度试管中，加入9mL无菌水，摇匀；从第二支试管中取出1mL转移至第三支刻度试管，加入9mL无菌水，摇匀；再从第三支试管中取出1mL转移至第四支刻度试管，加入9mL无菌水，摇匀。

如此重复即得到稀释倍数分别10、100、1000倍的土壤稀释液。

用移液枪分别吸取稀释100和1000倍的样品液50µL，加入至已凝固的培养基表面，用涂抹棒涂布均匀。

将涂过样的培养皿倒置放置，于30℃培养箱里培养，观察菌落透明圈的出现情况。

（一般30h后即可出现一些透明圈）。

6、菌株的纯化

于超净工作台内（亦可使用酒精灯，直接在实验台上完成）用接种环挑取长势良好且透明圈直径与菌落直径的比值较大的菌落于平板上划线分离，培养一定时间，进一步分离能形成透明圈的单菌落。

并在斜面培养基中保存。

图2平板划线分离法示意图

五、结果处理与分析

1、菌落产生透明水解圈的观察

用直尺分别于不同方向测量菌落和水解圈的直径大小，求平均值，并计算透明水解圈直径与菌落直径的比值。

表1不同菌落产淀粉酶能力的比较。

菌落编号

菌落直径（mm）

透明圈直径（mm）

透明圈直径/菌落直径

菌落形态特征

2、侯选菌落的形态观察：

观察并描述分离所得菌株的菌落形态，以大致了解产酶菌株属于那一类菌。

3、你所用的涂布平板法或划线法是否较好地得到了单菌落？

如果不是请分析原因。

六、注意事项

1、进行无菌操作前，将接种所需用具放于台面铁架上，对超净工作台即周围环境进行75％酒精喷雾，使灰尘沉降，打开紫外灯照射灭菌30min，操作前，用75％酒精喷手杀菌。

（在本实验中省去此步）。

2、操作应尽量靠里，在酒精灯的火焰旁工作。

3、实验过程中避免说话、走动。

4、每次涂板后涂布棒均要用火焰灼烧灭菌，冷却后再涂下一块板。

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