FAVD106 复方苯甲酸醇溶液微生物限度检查方法验证方案.docx

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FAVD106复方苯甲酸醇溶液微生物限度检查方法验证方案

复方苯甲酸醇溶液

微生物限度检查方法验证方案

1目的

根据《中国药典》2015版草案中的相关规定，建立复方苯甲酸醇溶液的微生物限度检查方法，并对其进行验证，保证其检验方法的科学性，使检验结果准确可靠。

2范围

本验证方案适用于复方苯甲酸醇溶液的微生物限度检查方法的验证。

3人员与职责

质量控制人员负责验证方案与报告的起草，并按照批准的方案实施，完成检验相关数据的采集；质量保证人员负责验证方案和报告的审核；质量管理负责人负责验证方案和报告的批准。

4培训

本方案实施前应对参加验证人员进行培训，并做好培训记录确保进行验证的人员均能熟悉、掌握验证过程。

5验证方案

5.1制剂信息

复方苯甲酸醇溶液为苯甲酸和水杨酸溶于75%乙醇中配制而成，临床作为外用抗真菌药使用，具有较强的抑菌活性。

其质量标准中规定应进行微生物限度检查，每1ml样品中细菌数不得超过100cfu，霉菌和酵母菌数不得超过100cfu，并不得检出金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌。

根据以上特点，本方案中按《中国药典》2015版草案《非无菌产品微生物限度检查：

微生物计数法》（1105）和《非无菌产品微生物限度检查：

控制菌检查法》（1106）中相关要求，决定采用薄膜过滤法消除复方苯甲酸醇溶液中的抑菌性成分对结果的影响，对供试品中的需氧菌总数及霉菌和酵母菌总数进行计数，根据草案对其质量标准中规定的金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌进行检查，并对所选用的计数和检查方法进行验证。

5.2微生物限度检查法概述

5.2.1微生物限度检查法系检查非灭菌制剂及其原料药、辅料受微生物污染程度的方法。

检查项目包括需氧菌总数计数、霉菌和酵母菌总数计数及控制菌检查。

微生物计数法系用于能在有氧条件下生长的嗜温细菌和真菌的计数。

控制菌检查法系用于在规定的试验条件下，检查供试品中是否存在特定的微生物。

5.2.2微生物计数试验和控制菌检查试验应在受控洁净环境下（D级）的局部洁净度不低于B级的单向流空气区域内进行。

检验全过程必须严格遵守无菌操作，防止再污染，防止污染的措施不得影响供试品中微生物的检出。

单向流空气区域、工作台面及环境应定期进行监测。

5.2.3本方案中的检验量即一次试验所用的供试品量（ml）。

除另有规定外，一般供试品的检验量为10ml。

检验时应从2个以上最小包装单位中抽取供试品。

一般应随机抽取供试品，取规定容器数，混合，取规定量供试品进行检验。

5.2.4本方案中所使用的试验菌株的传代次数不得超过5代（从菌种保藏中心获得的干燥菌种为第0代），并采用适宜的菌种保藏技术进行保存，以保证试验菌株的生物学特性。

制备菌液时应估算菌液中的含菌量，以便于控制加入试验菌的菌量，估算时可采用显微镜直接计数法确定。

5.2.5本方案中需氧菌总数是指胰酪大豆胨琼脂培养基上生长的总菌落数（包括真菌菌落数），霉菌和酵母菌总数是指沙氏葡萄糖琼脂培养基上生长的总菌落数（包括细菌菌落数）。

5.2.6本方案中微生物计数结果中需氧菌总数测定宜选取平均菌落数小于300cfu的稀释级、霉菌和酵母菌总数测定宜选取平均菌落数小于100cfu的稀释级，作为菌数报告（取两位有效数字）的依据。

取最高的平均菌落数，计算1ml供试品中所含的微生物数。

如各稀释级的平皿均无菌落生长，或仅最低稀释级的平板有菌落生长，但平均菌落数小于1时，以﹤1乘以最低稀释倍数的值报告菌数。

控制菌检查中应取相当于1mL供试品的供试液进行试验。

5.3验证所需培养基、仪器设备

5.3.1试验用培养基

pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液；

胰酪大豆胨液体培养基（TSB）；

胰酪大豆胨琼脂培养基（TSA）；

沙氏葡萄糖液体培养基（SDB）；

沙氏葡萄糖琼脂培养基（SDA）；

甘露醇氯化钠琼脂培养基；

溴化十六烷基三甲铵琼脂培养基；

本方案中所使用的培养基均应为购自中国食品药品检定研究院或由其他单位购买但经过适用性检查合格的脱水培养基，配制后应采用验证合格的灭菌程序灭菌。

5.3.2仪器设备

100级净化工作台；

BSC-1100-LIIA型生物安全柜；

BP-II型药物天平；

HHW21型电热恒温水浴箱；

HY35型隔水式电热恒温培养箱；

LRH-250A型生化培养箱；

HTY-302G型微生物限度检验仪；

三洋MLS-3780型高压灭菌锅。

5.4微生物计数方法验证

5.4.1菌种及菌液制备

5.4.1.1金黄色葡萄球菌〔CMCC（B）26003〕

取金黄色葡萄球菌接种于胰酪大豆胨液体培养基上，于30～35℃、培养18～24小时，取其新鲜培养物，用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液稀释制成每1ml含菌量约为5000cfu的菌悬液。

5.4.1.2铜绿假单胞菌〔CMCC（B）10104〕

取铜绿假单胞菌接种于胰酪大豆胨液体培养基上，于30～35℃、培养18～24小时，取其新鲜培养物，用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液稀释制成每1ml含菌量约为5000cfu的菌悬液。

5.4.1.3枯草芽孢杆菌〔CMCC（B）63501〕

取枯草芽孢杆菌接种于胰酪大豆胨液体培养基上，于30～35℃、培养18～24小时，取其新鲜培养物，用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液稀释制成每1ml含菌量约为5000cfu的菌悬液。

5.4.1.4白色念珠菌〔CMCC（F）98001〕

取白色念珠菌接种于沙氏葡萄糖液体培养基上，于20～25℃、培养2～3天，取其新鲜培养物，用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液稀释制成每1ml含菌量约为5000cfu的菌悬液。

5.4.1.5黑曲霉〔CMCC（F）98003〕

取黑曲霉接种于沙氏葡萄糖琼脂培养基上，于20～25℃、培养5～7天，或直到获得丰富的孢子时，取其新鲜培养物加入3～5ml含0.05％聚山梨酯80的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液，反复吹吸将孢子洗脱，然后吸出孢子悬液至无菌试管内，用含0.05％聚山梨酯80的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液稀释制成每1ml含菌量约为5000cfu的黑曲霉孢子悬液。

5.4.2菌液的保存

菌液制备后若在室温下放置，应在2小时内使用；若保存在2～8℃，可在24小时内使用。

稳定的黑曲霉孢子悬液可保存在2～8℃，在验证过的贮存期内使用。

5.4.3供试液制备

取供试品10ml，加入温度不超过45℃的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，稀释制成1﹕10供试液。

按下列要求进行供试液的接种和稀释，制备微生物回收试验用供试液。

所加菌液的体积应不超过供试液体积的1%。

供试液从制备至加入检验用培养基不得超过1小时。

（1）试验组取上述制备好的供试液，加入1ml试验菌液，混匀，每张滤膜所滤过的供试液中含菌量约为50cfu。

（2）供试品对照组取制备好的供试液，以稀释液（温度不超过45℃的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液）代替菌液同试验组操作。

（3）菌液对照组取稀释液（温度不超过45℃的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液）替代供试液，按试验组操作加入试验菌液并进行微生物回收试验。

5.4.4阴性对照

为确认试验条件是否符合要求，应进行阴性对照试验，阴性对照试验应无菌生长。

如阴性对照有菌生长，应进行偏差调查。

5.4.5供试品中微生物的回收

按照“菌种及菌液制备”项中所列的各试验菌应逐一进行微生物回收试验。

取照上述“供试液的制备”、“接种和稀释”制备的供试液10ml，加至90ml稀释液中，混匀，用孔径不大于0.45μm、直径为50mm的滤膜过滤，并用100ml稀释液冲洗滤膜。

若测定需氧菌总数，转移滤膜菌面朝上贴于胰酪大豆胨琼脂培养基平板上，培养温度30～35℃，培养时间不超过3天；若测定霉菌和酵母总数，转移滤膜菌面朝上贴于沙氏葡萄糖琼脂培养基平板上，培养温度20～25℃，培养时间不超过5天。

观察菌落生长情况，点计滤膜上生长的所有菌落数，菌落蔓延生长成片的平皿不宜计数。

每株试验菌每种培养基制备1张滤膜。

同法测定供试品对照组及菌液对照组菌数，计算各试验组的平均菌落数。

5.4.6结果判断

试验组菌落数减去供试品对照组菌落数的值与菌液对照组菌落数的比值应在0.5～2范围内。

若各试验菌的回收试验均符合要求，则方法验证通过，可照所用的供试液制备方法及计数方法进行该供试品的需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数计数；若采用上述方法还存在一株或多株试验菌的回收达不到要求，那么可采用增加稀释液、培养基体积或加入适宜的中和剂、灭活剂来消除供试品的抑菌活性，并重新进行计数方法适用性验证，根据结果选择回收最接近要求的方法和试验条件进行供试品的检查。

5.5控制菌检查方法验证

5.5.1金黄色葡萄球菌检查方法

5.5.1.1供试液制备和增菌培养

取供试品10ml，加入温度不超过45℃的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，稀释制成1﹕10供试液。

取10ml供试液，加至90ml稀释液中，混匀，用孔径不大于0.45μm、直径为50mm的滤膜过滤，并用100ml稀释液冲洗滤膜。

过滤后，取出滤膜接种至100ml胰酪大豆胨液体培养基中，混匀，30～35℃培养18～24小时。

5.5.1.2选择和分离培养

取上述预培养物划线接种于甘露醇氯化钠琼脂培养基平板上，30～35℃培养18～72小时。

5.5.1.3结果判断

若甘露醇氯化钠琼脂培养基平板上有黄色菌落或外周有黄色环的白色菌落生长，应进行分离、纯化及适宜的鉴定试验，确证是否为金黄色葡萄球菌；若平板上没有与上述形态特征相符或疑似的菌落生长，或虽有相符或疑似的菌落生长但鉴定结果为阴性，判供试品未检出金黄色葡萄球菌。

5.5.2铜绿假单胞菌检查方法

5.5.2.1供试液制备和增菌培养

取供试品10ml，加入温度不超过45℃的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，稀释制成1﹕10供试液。

取10ml供试液，加至90ml稀释液中，混匀，用孔径不大于0.45μm、直径为50mm的滤膜过滤，并用100ml稀释液冲洗滤膜。

过滤后，取出滤膜接种至100ml胰酪大豆胨液体培养基中，混匀，30～35℃培养18～24小时。

5.5.2.2选择和分离培养

取上述预培养物划线接种于溴化十六烷基三甲铵琼脂培养基平板上，30～35℃培养18～72小时。

取上述平板上生长的菌落进行氧化酶试验，或采用其它适宜方法进一步鉴定。

5.5.2.3氧化酶试验

将洁净滤纸片置于平皿内，用无菌玻棒取上述平板上生长的菌落涂于滤纸片上，滴加新配制的1%二盐酸二甲基对苯二胺试液，在30秒内若培养物呈粉红色并逐渐变为紫红色为氧化酶试验阳性，否则为阴性。

5.5.2.4结果判断

若溴化十六烷基三甲铵琼脂培养基平板上有菌落生长，且氧化酶试验阳性，应进一步进行适宜的鉴定试验，确证是否为铜绿假单胞菌。

如果平板上没有菌落生长，或虽有菌落生长但鉴定结果为阴性，或氧化酶试验阴性，判供试品未检出铜绿假单胞菌。

5.5.3检查方法验证

5.5.3.1菌液制备

取金黄色葡萄球菌〔CMCC（B）26003〕或铜绿假单胞菌〔CMCC（B）10104〕接种于胰酪大豆胨液体培养基上，于30～35℃、培养18～24小时，取其新鲜培养物，用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液稀释制成每1ml含菌量约为50cfu的菌悬液。

菌液制备后若在室温下放置，应在2小时内使用；若保存在2～8℃，可在24小时内使用。

5.5.3.2适用性试验

按“金黄色葡萄球菌检查方法”或“铜绿假单胞菌检查方法”项，取规定量供试液滤过后，于冲洗液中加入1ml相应的试验菌液，滤过。

依相应的控制菌检查方法，在规定的温度及最短时间下培养，应能检出所加试验菌相应的反应特征。

5.5.3.3阴性对照

为确认试验条件是否符合要求，应进行阴性对照试验，阴性对照试验应无菌生长。

如阴性对照有菌生长，应进行偏差调查。

5.5.3.4结果判断

上述试验若检出试验菌，按此供试液制备法和控制菌检查方法进行供试品检查；若未检出试验菌，应消除供试品的抑菌活性，并重新进行方法验证。

如果经过试验确证供试品对试验菌的抗菌作用无法消除，可认为受抑制的微生物不可能存在于该供试品中，选择抑菌成份消除相对彻底的方法进行供试品的检查。

5.6偏差处理

应严格按照本方案操作，如在试验过程中微生物回收结果或控制菌检查结果出现不符合要求的情况，应上报质量管理负责人，在分析问题原因后，决定是否需对本方案中设定的微生物限度检查方法进行修改，并重新进行验证。

5.7再验证周期

5.7.1当复方苯甲酸醇溶液的处方发生变动或其它因素变更导致复方苯甲酸醇溶液的物料性质改变时，需要对本方案进行调整后作方法学再验证。

5.7.2国家相关微生物限度检查标准修改后需要对本方法重新进行再验证。

6参考文件

《中国药典》2015版草案（1105）《非无菌产品微生物限度检查：

微生物计数法》和（1106）《非无菌产品微生物限度检查：

控制菌检查法》

《复方苯甲酸醇溶液成品质量标准》

《复方苯甲酸醇溶液成品检验标准操作规程》

7附录

附录1复方苯甲酸醇溶液微生物限度检查方法验证报告

复方苯甲酸醇溶液

微生物限度检查方法验证报告

名称

复方苯甲酸醇溶液

开始日期

结束日期

验证方案

复方苯甲酸醇溶液微生物限度检查方法验证方案（FA-VD-106）

偏差情况

是□否□（如选是，在结果分析中详细说明其结果和补救措施）

验证结果分析及结论：

本次验证根据《中国药典》2015版草案《非无菌产品微生物限度检查：

微生物计数法》（1105）和《非无菌产品微生物限度检查：

控制菌检查法》（1106）中相关要求，拟定了复方苯甲酸醇溶液的微生物限度检查方法，并使用其制剂成品（批号：

）进行了检查方法的验证。

微生物计数的回收比值分别为：

金黄色葡萄球菌：

；铜绿假单胞菌；枯草芽孢杆菌：

；白色念珠菌：

；黑曲霉：

；控制菌检查的验证结果为：

金黄色葡萄球菌：

□通过□未通过；铜绿假单胞菌：

□通过□未通过。

验证结果表明本次所建立的复方苯甲酸醇溶液的微生物限度检查方法：

。

质量控制人：

日期：

年月日

验证报告和记录的审核：

质量保证人：

日期：

年月日

验证报告的批准：

质量管理负责人：

日期：

年月日

微生物限度检查方法验证记录

名称

批号

规格

来源

一、金黄色葡萄球菌计数方法验证记录

试验开始日期：

结束日期：

培养温度：

培养湿度：

胰酪大豆胨琼脂培养基（配制批号：

）

培养箱编号：

培养皿号

试验组

供试品对照组

菌液对照组

阴性对照

1

2

平均菌落数

结果计算

结果判定

□验证通过□验证未通过

二、铜绿假单胞菌计数方法验证记录

试验开始日期：

结束日期：

培养温度：

培养湿度：

胰酪大豆胨琼脂培养基（配制批号：

）

培养箱编号：

培养皿号

试验组

供试品对照组

菌液对照组

阴性对照

1

2

平均菌落数

结果计算

结果判定

□验证通过□验证未通过

三、枯草芽孢杆菌计数方法验证记录

试验开始日期：

结束日期：

培养温度：

培养湿度：

胰酪大豆胨琼脂培养基（配制批号：

）

培养箱编号：

培养皿号

试验组

供试品对照组

菌液对照组

阴性对照

1

2

平均菌落数

结果计算

结果判定

□验证通过□验证未通过

四、白色念珠菌计数方法验证记录

试验开始日期：

结束日期：

培养温度：

培养湿度：

沙氏葡萄糖琼脂培养基（配制批号：

）

培养箱编号：

培养皿号

试验组

供试品对照组

菌液对照组

阴性对照

1

2

平均菌落数

结果计算

结果判定

□验证通过□验证未通过

五、黑曲霉计数方法验证记录

试验开始日期：

结束日期：

培养温度：

培养湿度：

沙氏葡萄糖琼脂培养基（配制批号：

）

培养箱编号：

培养皿号

试验组

供试品对照组

菌液对照组

阴性对照

1

2

平均菌落数

结果计算

结果判定

□验证通过□验证未通过

六、金黄色葡萄球菌检查方法验证记录

胰酪大豆胨液体培养基（配制批号：

）

试验开始日期：

甘露醇氯化钠琼脂培养基（配制批号：

）

试验结束日期：

培养温度：

培养湿度：

培养箱编号：

项目

增菌培养

分离培养

分离、纯化

及适宜的鉴定试验

检查结果

试验组

/ml

阴性对照

结果判定

□验证通过□验证未通过

七、铜绿假单胞菌检查方法验证记录

胰酪大豆胨液体培养基（配制批号：

）

试验开始日期：

溴化十六烷基三甲铵琼脂培养基（配制批号：

）

试验结束日期：

培养温度：

培养湿度：

培养箱编号：

项目

增菌培养

分离培养

氧化酶

试验

分离、纯化及适宜的鉴定试验

检查结果

试验组

/ml

阴性对照

结果判定

□验证通过□验证未通过