重组蛋白IFNGA在大肠杆菌中的表达与纯化.docx
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重组蛋白IFNGA在大肠杆菌中的表达与纯化
高中组11年级
生物化学
3人项目
重组蛋白IFNGA在大肠杆菌中的表达与纯化
重组蛋白IFNGA在大肠杆菌中的表达与纯化
摘要：
干扰素γ（Interferongamma，IFN-γ）是体内重要的细胞因子，能够通过调控免疫相关基因的转录协调机体的免疫反应，具有抗病毒、抗肿瘤、增强免疫力能功能。
目前对于IFN-α、IFN-β重组表达的较多，而关于IFN-γ蛋白的纯化表达较少.因此,本研究使用PCR方法扩增IFN-γ基因，将IFN-γ基因分别插入原核表达载体pET-30构建重组表达质粒pET-30--IFN-γ，转化大肠杆菌BL21和Rosetta菌株，在IPTG诱导下表达IFN-γ，SDS-PAGE分析重组表达蛋白。
结果表明：
成功构建重组表达质粒pET-30-IFN-γ；表达产物主要以包涵体形式存在；经Ni2+-NTA亲和层析纯化，获得高纯度重组蛋白。
本实验纯化的蛋白有望在今后用于医学和生物学研究中。
关键词：
干扰素；IFN-γ蛋白；大肠杆菌表达系统；重组表达；蛋白纯化；
1、研究背景
干扰素（IFN）是一种广谱抗病毒剂，并不直接杀伤或抑制病毒，而主要是通过细胞表面受体作用使细胞产生抗病毒蛋白，从而抑制病毒（比如：
乙肝病毒）的复制。
其类型分为三类，α-（白细胞）型、β-（成纤维细胞）型，γ-（淋巴细胞）型；同时还可增强自然杀伤细胞（NK细胞）、巨噬细胞和T淋巴细胞的活力，从而起到免疫调节作用，并增强抗病毒能力。
干扰素是一组具有多种功能的活性蛋白质（主要是糖蛋白），是一种由单核细胞和淋巴细胞产生的细胞因子。
它们在同种细胞上具有广谱的抗病毒、影响细胞生长，以及分化、调节免疫功能等多种生物活性。
其中，IFN-γ是体内重要的免疫调节因子，能通过与细胞表面受体结合，诱导病毒感染细胞产生多种抗病毒蛋白，使细胞内产生抗病毒状态而发挥抗病毒作用。
在诱导效应因子表达的同时，由于IFN-γ能够提高细胞表面MHC分子的表达，增强免疫活性细胞对病原体的杀伤作用，从而协同促进了机体对病毒感染细胞的杀灭，而使机体处于抗病毒状态。
虽然各种类型的干扰素均能介导细胞对病毒感染的反应，但IFN-γ的免疫调节活性在协调免疫反应和确定机体长期的抗病毒状态中发挥更为重要的作用。
其作用可大致总结为以下几点：
①抗增生作用。
这是干扰素能用于治疗多种肿瘤的原因。
②抗病毒作用。
当我们的机体感染病毒时，体内会产生大量的干扰素。
③免疫调节作用。
干扰素是天然免疫的一部分，但干扰素也参与多种特异性的细胞免疫，如增强感染的肝细胞表达被T淋巴细胞识别的蛋白质，帮助T细胞识别病毒感染的细胞等。
④抗纤维化作用。
这是为什么干扰素治疗的病人肝纤维化会明显好转。
⑤干扰素还有抗新血管增生、促进细胞凋亡等多种功能。
但在治疗慢性乙肝方面，抗病毒作用和免疫调节作用，以及抗纤维化作用可能是主要的。
由于IFN-γ能够抑制细胞增生，促进细胞凋亡，抑制肿瘤血管生成，具有抗病毒及免疫调节活性，还可抑制癌基因的表达，因此引起了人们对其在治疗恶性肿瘤方面的关注。
目前，已有文献报道将IFN-γ用于肝细胞癌（Hepaticcellularcarcinoma，HCC）切除术后和消融术后，以预防复发，如Nishisuchi等对30例行HCC根治性术后患者进行长达88周的IFN-γ治疗，结果显示，IFN-γ治疗可提高术后患者的累积生存率。
Lin等也对行消融术后的HCC患者进行IFN-γ治疗，结果发现IFN-γ能够降低肿瘤复发率，提高患者生存率。
IFN-γ局部用药，还可治疗暴露性肿瘤，如恶性黑色素瘤、恶性淋巴瘤、宫颈癌等。
所以我们对其进行了分析与纯化，进一步了解其成分和结构，并纯化出有用蛋白进行加以利用。
2、研究目的
目前对于IFN-α、IFN-β重组表达的较多，而关于IFN-γ蛋白的纯化表达较少；因此本研究希望通过实验研究，在大肠杆菌表达系统中成功表达IFN-γ蛋白，并利用蛋白纯化技术获得较纯的IFN-γ蛋白。
3、材料与方法
1.大肠杆菌表达载体构建
1.1材料
DH5a感受态细胞（TAKARA）；Antibotics（Sigma）；
Restrictionenzyme（TAKARA）；DNALadder（Novoprotein）；pColdII；
载体（TAKARA）；
1.2仪器及品牌
PCR仪（ThermoFisher）；水平电泳仪（大连竞脉）；凝胶成像仪（上海天能）；
台式离心机（湖南赛特）
1.3方法
1.3.1PCR扩增目的基因
设计引物，以含目的基因质粒为模板，PCR扩增IFN-gamma目的基因。
1.3.2重组表达载体构建
经PCR扩增胶纯化获得目的基因，用NdeI和HindIII酶切并胶纯化获得载体pColdII。
目的基因片段与pColdII以SeamLesscloning方法重组克隆，转化DH5a感受态细胞，PCR鉴定阳性克隆，并测序。
2.大肠杆菌表达筛选
2.1材料
XY1培养基（Novoprotein）；IPTG（Sigma）；ProteinMolecularMarker（Novoprotein）；
Antibotics（Sigma）；RosettapLysS表达菌株（TAKARA）；Antibodies（Sigma）；
2.2仪器及品牌
高速冷冻离心机（Beckman）；摇床（上海博彩）；超声破碎仪（宁波新芝）；垂直电泳仪（上海天能）
2.3方法
重组质粒转化BL21（DE3）表达菌株，37℃培养至OD600=0.8后，加IPTG（1mM），37℃诱导3h，收菌。
SDS-PAGE检测表达。
重组质粒转化BL21（DE3）表达菌株，37℃培养至OD600=0.8后，冷却后加IPTG（0.1mM），16℃诱导过夜，收菌。
SDS-PAGE检测表达。
重组质粒转化RosettapLysS表达菌株，37℃培养至OD600=0.9后，加IPTG（1mM），37℃诱导3h，收菌。
SDS-PAGE检测表达。
重组质粒转化RosettapLysS表达菌株，37℃培养至OD600=0.9后，冷却后加IPTG（0.1mM），16℃诱导过夜，收菌。
SDS-PAGE检测表达。
Antibotics（Sigma）；RosettapLysS表达菌株（TAKARA）；Antibodies（Sigma）；
3.蛋白纯化
3.1材料
基本无机试剂（Na2HPO4，KCl，NaCl等）（国药化学集团）；透析袋（上海绿叶）
超声破碎仪（宁波新芝）；AKTApurifier（GE）；高速冷冻离心机（Beckman）；垂直电泳仪（上海天能）ChelatingHP（Ni） 亲和纯化色谱柱（柱体积 1mL）
3.2方法
ChelatingHP（Ni）柱以20mMPB，500mMNaCl，pH7.4平衡液平衡，平衡后上样90mL，然后分别用含20，50，100，200，500mM咪唑的20mMPB，500mMNaCl，pH7.4的洗脱液洗脱。
其中500mM咪唑洗脱流份透析到最终缓冲液中作为蛋白产品保存。
4.成品检测
4.1仪器及品牌
垂直电泳仪（上海天能）；核酸蛋白检测仪（Eppendorf）；
4.2方法
终产品进行浓度，纯度检测合格后按要求分装保存。
四、实验结果与讨论
4.1表达载体的构建（包括目的基因的扩增，酶切、连接和转化，阳性克隆鉴定）
4.1.1目的基因扩增
⏹用聚合酶链式反应（PCR）扩增目的基因（506bp）
Lane1：
IFN-gamma（506bp）M：
Dl2000DNAMarker
图1.目的基因扩增
4.12酶切、连接和转化
⏹将扩增的目的基因用限制性内切酶消化；
⏹连接到相应的空载体；
⏹将构建好的载体转入大肠杆菌
4.13阳性克隆的鉴定
⏹用聚合酶链式反应（PCR）确认正确的构建载体
Lane1-6:
Clone1-6（expectedproductlength600bp）
Mk:
DL2000DNAMarker
Positiveclone:
1-6
Positivecloneforsequencing:
1，6
Sequencingcorrectclone:
1，6
图2.PCR鉴定阳性克隆
4.2表达筛选（包括表达小试确定最佳的表达条件，放大培养）
4.2.1表达小试1
⏹菌株：
BL21（DE3）
⏹培养基：
LB
⏹在600nm波长光吸收值达到1.0时加入1mmolIPTG在37℃培养3h
LaneA:
诱导前全菌
LaneB:
诱导后全菌
LaneC:
破菌上清
LaneD:
破菌沉淀
MK:
分子量标记
图3.SDS-PAGE检测表达条带
从SDS-PAGE电泳上可以看出目的蛋白有明显的可溶表达。
4.2.2表达小试2
⏹菌株：
BL21（DE3）
⏹培养基：
LB
⏹600nm波长光吸收值达到1.0时加入0.1mmolIPTG在16℃培养16h
LaneA:
诱导前全菌
LaneB:
诱导后全菌
LaneC:
破菌上清
LaneD:
破菌沉淀
MK:
分子量标记
图4.SDS-PAGE检测表达条带
从SDS-PAGE电泳上可以看出目的蛋白有明显的可溶表达
4.2.3表达小试3
⏹菌株：
RosettapLysS
⏹培养基：
LB
⏹在600nm波长光吸收值达到1.0时加入1mmolIPTG在37℃培养3h
LaneA:
诱导前全菌
LaneB:
诱导后全菌
LaneC:
破菌上清
LaneD:
破菌沉淀
MK:
分子量标记
图5.SDS-PAGE检测表达条带
从SDS-PAGE电泳上可以看出目的蛋白有明显的可溶表达。
4.2.4表达小试4
⏹菌株：
RosettapLysS
⏹培养基：
LB
⏹在600nm波长光吸收值达到1.0时加入0.1mmolIPTG在16℃培养16h
LaneA:
诱导前全菌
LaneB:
诱导后全菌
LaneC:
破菌上清
LaneD:
破菌沉淀
MK:
分子量标记
图6.SDS-PAGE检测表达条带
从SDS-PAGE电泳上可以看出目的蛋白有明显的可溶表达。
4.2.5放大培养
⏹菌株:
BL21（DE3）
⏹培养基:
XY12升
⏹在600nm波长光吸收值达到1.0时加入0.5mmolIPTG在37℃培养3h
LaneA:
诱导前全菌
LaneB:
诱导后全菌
LaneC:
破菌上清
LaneD:
破菌沉淀
MK:
分子量标记
MKABCD
图7.SDS-PAGE检测表达条带
4.2.6菌体裂解
⏹裂解缓冲液:
20mMPB，500mMNaCl，pH7.4
LaneA:
全菌
LaneB:
破菌上清
LaneC:
破菌沉淀
MK:
分子量标记
图8.SDS-PAGE检测表达条带
4.3目的蛋白纯化
4.3.1金属（镍离子）螯合层析纯化
⏹样品:
破菌上清
⏹平衡缓冲液:
20mMPB，500mMNaCl，pH7.4
⏹洗脱缓冲液:
20mMPB，500mMNaCl，500mM咪唑，pH7.4
⏹层析柱:
ChelatingHis（Ni）Column（柱体积10mL）
ABMKCDEFGHI
MK:
分子量标记
LaneA:
样品
LaneB:
流穿
LaneC:
20mmol咪唑（Imizadole）洗脱组分
LaneD:
50mmol咪唑（Imizadole）洗脱组分
LaneE:
100mmol咪唑（Imizadole）洗脱组分
LaneF:
200mmol咪唑（Imizadole）洗脱组分1
LaneG:
200mmol咪唑（Imizadole）洗脱组分2
LaneH:
500mmol咪唑（Imizadole）洗脱组分1
LaneI:
500mmol咪唑（Imizadole）洗脱组分2
图9.样品纯化条带
4.3.2终产品
LaneA:
终产品（还原）
LaneB:
终产品（非还原）
MK:
分子量标记
120kD
90kD
60kD
40kD
30kD
20kD
14kD
⏹浓度:
0.5mg/mL
⏹Volume:
6mL
⏹总量:
3mg
⏹缓冲液:
PBS，pH7.4
图9.终产品纯化条带
5、收获与体会
1、重组蛋白的纯化扩展了生物试剂应用的视野和多样性。
2、近年来，人们还将基因重组技术与金属螯合层析技术结合起来，在基因水平上为蛋白质的分离纯化提供方便。
3、在接下来的实验中，我们将把得到的高纯度重组蛋白是用于小白鼠，检验其生物作用是否与IFN-γ一致，确定其是否为我们所需要的真正的IFN-γ蛋白。
4、我们将在确认IFN-γ可用性的基础上进一步提高其纯度。
5、通过几次的学习、交流和实际动手操作后，我们对生物知识及其应用有了更大的兴趣，在实验中，我们也扩宽了我的视野和知识面。
同时，面对一次次失败，我们了解耐心在每一次发现中都是必不可少的因素，唯有沉下心来，才可铸成大事，唯有跌倒爬起，才可享受成功的果实。
6、参考文献
[1]鸡γ-干扰素成熟蛋白基因的表达及其产物抗病毒活性测定
[2]重组犬IFN-γ在HEK293T细胞中的表达及犬IFN-γ腺病毒载体的构建
[3]牛干扰素-γ基因的克隆、序列分析及表达研究
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