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气相色谱内标法检测烟碱含量方法学考察

生物与化学工程学院

仪器分析实训报告

题目：

气相色谱内标法检测烟碱含量方法学考察

StudyonthemethodologyinvestigationofdetectingnicotinecontentbyGCinternalstandardmethod

专业：

食品科学与工程

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学号：

***********

完成日期：

2010-5-24

气相色谱内标法检测烟碱含量方法学考察

【摘要】烟碱（又称尼古丁）是烟叶中的主要成分。

本次试验以喹啉为内标物，烟碱为测定对象，考查及检测气相色谱法内标法测定烟碱含量的方法学。

试验中以有机溶剂萃取、填充气相色谱法测定对试验的重现性及精密度和线性关系进行进行了认真分析。

一定范围内，烟碱含量的峰高比及面积比呈现线性关系，重现性及精密度良好。

【关键词】：

内标法烟碱气相色谱方法学

Studyonthemethodologyinvestigationofdetecting

nicotinecontentbyGCinternalstandardmethod

Abstract：

Nicotine（alsocallednicotine）isthemainingredient.TobaccoThistrialasinternalstandardwiththings,-1h-qunolin-2-onesnicotinetodetermineobject,examinesanddetectinggaschromatographyinternalstandardmethodfordeterminingthecontentofnornicotinemethodology.Experimentswithorganicsolventextraction,fillinggaschromatographywasdevelopedforthedeterminationofthetestthereproducibilityandprecisionandlinearrelationshipbetweenanalyzedcarefully.Acertainrange,highratioofnicotinecontentthanpresentpeakareaoflinearrelation,reproducibilityandprecisionisgood.

Keywords：

Internalstandardmethodnicotinegaschromatography

methodology

1绪论……………………………………………………………………5

1.1烟碱的结构与化学性质………………………………………………5

1.2烟碱的检测方法………………………………………………………6

1.2.1非水滴定法检测烟碱含量…………………………………………6

1.2.2紫外线分光光度法检测烟碱含量…………………………………6

1.2.3水蒸气蒸馏法检测烟碱含量………………………………………6

1.2.4高效液相色谱法检测烟碱含量……………………………………7

1.2.5气相色谱法检测烟碱含量…………………………………………7

1.2.5.1外标法检测烟碱含量……………………………………………8

1.2.5.2归一化法检测烟碱含量…………………………………………8

1.2.5.3内标法检测烟碱含量……………………………………………8

1.3检测方法学考察……………………………………………………9

1.3.1线性关系的考察……………………………………………………9

1.3.2精密度的考察………………………………………………………9

1.3.3重现性实验的考察…………………………………………………10

1.3.4回收率………………………………………………………………10

1.3.5验证性………………………………………………………………10

2实验部分………………………………………………………………11

2.1目的……………………………………………………………………11

2.2材料和仪器……………………………………………………………11

2.2.1材料……………………………………………………………………11

2.2.2仪器……………………………………………………………………11

2.3色谱条件………………………………………………………………11

2.4实验设计及结果分析…………………………………………………11

2.4.1线性关系实验的考察…………………………………………………11

2.4.2精密度实验的考察……………………………………………………13

2.4.3重现性实验的考察……………………………………………………14

2.4.4结果分析………………………………………………………………15

参考文献……………………………………………………………………………15

气相色谱内标法检测烟碱含量方法学考察

1绪论

1.1烟碱的结构与化学性质

烟碱又名尼古丁，是一种无色至淡黄色透明油状液体，是烟草中含氮生物碱的主要成分，在烟叶中的含量为1～3%。

它能迅速溶于水及酒精中，通过口、鼻、支气管黏膜，很容易被人体吸收。

粘在皮肤表面的尼古丁，可“渗”入人体内。

香烟中的尼古丁对人的致死量是50～70毫克，相当于20～25支香烟尼古丁的含量。

如果将一支雪茄或三支香烟的尼古丁一次注入人的静脉内,3～5分钟人即可死亡。

对昆虫具有杀灭作用

1.1.1烟碱的结构

尼古丁

1.1.2烟碱化学性质

一种吡啶型生物碱，分子式C10H14N2。

俗称尼古丁（nicotine）。

存在于烟草属经济植物中。

无色挥发性液体，有刺激性臭味，熔点－79℃，沸点246.7℃（745毫米汞柱），相对密度1.0097（20／4℃），比旋光度－169°。

可以水蒸气蒸馏。

在空气中易发生变质。

易溶于水、乙醇、乙醚、氯仿和石油醚。

烟碱能与各种无机酸（如盐酸、硫酸）和有机酸（如酒石酸、苦味酸）生成结晶的单盐和双盐，其中双苦味酸盐的熔点278℃，常用来鉴别烟碱。

烟碱与二氧化汞生成结晶形复合物，此反应可用来纯化烟碱。

1.2烟碱的检测方法

1.2.1非水滴定法检测烟碱含量

烟碱含量是烟草质量的重要指标，本法分别以盐酸和水为浸取剂、三氯甲烷为萃取剂、溴甲酚绿和甲基红的混合试剂为指示剂，在最佳浸取、萃取、ｐＨ值等条件下，用标准硫酸溶液直接滴定烟碱的方法。

本法准确、快速、简便。

烟草样品中,烟碱的测定方法有:

有机溶剂萃取蒸馏酸碱滴定法,在强碱性介质中蒸汽蒸馏.硅钨酸沉淀重量法,另外文献亦有报导;烟草中钾的测定方法,有钾与亚硝酸钴钠生成复盐,高锰酸钾分解,草酸返滴定法;漆酚冠醚钾离子选择性电极格兰计算法等,提出用氟硼酸根离子选择性电极作为指示电极、四苯硼钠电位滴定法测烟叶中的钾与总烟碱量。

样品加入过量四苯硼钠的溶液,分别在pH=10中沉淀钾在pH=4、pH=10时沉淀烟碱与钾,过量的四苯硼钠分别用溴化十六烷基三甲基铵返滴，计算出烟碱含量。

1.2.2紫外分光光度法检测烟碱含量

它是根据物质分子对波长为200-760nm这一范围的电磁波的吸收特性所建立起来的一种定性、定量和结构分析方法。

操作简单、准确度高、重现性好。

波长长（频率小）的光线能量小，波长短（频率大）的光线能量大。

分光光度测量是关于物质分子对不同波长和特定波长处的辐射吸收程度的测量。

烟碱（又名尼古丁）是烟草特有的植物碱,它给予吸烟者感官上感觉到“劲头”而满意,所以烟碱是烟草质量的重要化学成份之一.过去我们采用经典的硅钨酸沉淀法测定,这个方法准确性虽高,但化费时间却很长,每作一个样品的测定需要30个小时,因此不能适应我国烟草工业形势发展的需要,现我们改用紫外分光光度法来测定,其原理是烟碱溶液在特定波长的紫外光源通过时,紫外光量的吸收与烟碱浓度成比例.一个样品仅需两小时就可完成测定

1.2.3水蒸气蒸馏法检测烟碱含量

烟碱是由两个杂环（吡啶和四氢吡咯）构成含氮碱，很容易与盐酸反应生成烟碱盐酸盐而溶于水。

此提取液加入NaOH后可使烟碱游离。

游离烟碱在左右具有一定的蒸气压，可用水蒸气蒸馏法分离提取。

水蒸气蒸馏法是将含有挥发性成分的药材与水共蒸馏，使挥发性成分随水蒸气一并馏出，经冷凝分取挥发性成分的浸提方法。

该法适用于具有挥发性、能随水蒸气蒸馏而不被破坏、在水中稳定且难溶或不溶于水的药材成分的浸提。

水蒸气蒸馏法可分为共水蒸馏法、通水蒸气蒸馏法、水上蒸馏法。

为提高馏出液的浓度，一般需将馏出液进行重蒸馏或加盐重蒸馏。

常用设备为多能提取罐、挥发油提取罐，它在生产活动中被广泛使用。

本法的基本原理是根据道尔顿定律，相互不溶也不起化学作用的液体混合物的蒸汽总压，等于该温度下各组分饱和蒸气压（即分压）之和。

因此尽管各组分本身的沸点高于混合液的沸点，但当分压总和等于大气压时，液体混合物即开始沸腾并被蒸馏出来。

该方法具有安装操作简单、减少污染和缩短实验时间等优点。

在碱性条件下将烟草浸泡１２ｈ以上用水蒸气蒸馏法收集７００～８００ｍＬ蒸出液，即可收集到９５％以上的烟碱．分别用酸碱滴定法和紫外光谱法测定其烟碱含量。

1.2.4高效液相色谱法检测烟碱含量

　高效液相色谱法是在经典色谱法的基础上，引用了气相色谱的理论，在技术上，流动相改为高压输送（最高输送压力可达4.9´107Pa）;色谱柱是以特殊的方法用小粒径的填料填充而成，从而使柱效大大高于经典液相色谱（每米塔板数可达几万或几十万）;同时柱后连有高灵敏度的检测器，可对流出物进行连续检测。

高效液相色谱还有色谱柱可反复使用、样品不被破坏、易回收等优点，但也有缺点，与气相色谱相比各有所长，相互补充。

高效液相色谱的缺点是有“柱外效应”。

在从进样到检测器之间，除了柱子以外的任何死空间（进样器、柱接头、连接管和检测池等）中，如果流动相的流型有变化，被分离物质的任何扩散和滞留都会显著地导致色谱峰的加宽，柱效率降低。

高效液相色谱检测器的灵敏度不及气相色谱。

1.2.5气相色谱法检测烟碱含量

气相色谱法中有外标法、归一化法、内标法三种。

1.2.5.1外标法

用待测组分的纯品作对照物质，以对照物质和样品中待测组分的响应信号相比较进行定量的方法称为外标法（externalstandardmethod）。

外标法是色谱分析中的一种定量方法，它不是把标准物质加入到被测样品中，而是在与被测样品相同的色谱条件下单独测定，把得到的色谱峰面积与被测组分的色谱峰面积进行比较求得被测组分的含量。

外标物与被测组分同为一种物质但要求它有一定的纯度，分析时外标物的浓度应与被测物浓度相接近，以利于定量分析的准确性。

外标法操作、计算简单，无需各组分都被检出、洗脱，但进样量要求十分准确，要严格控制在与标准物相同的操作条件下进行，否则造成分析误差，得不到准确的测量结果。

1.2.5.2归一化法

归一化是一种简化计算的方式，即将有量纲的表达式，经过变换，化为无量纲的表达式，成为纯量。

内标法internalstandardmethod是色谱分析中一种比较准确的定量方法，尤其在没有标准物对照时，此方法更显其优越性。

1.2.5.3内标法

内标法（internalstandardmethod）是色谱分析中一种比较准确的定量方法，尤其在没有标准物对照时，此方法更显其优越性。

内标法是将一定重量的纯物质作为内标物加到一定量的被分析样品混合物中，然后对含有内标物的样品进行色谱分析，分别测定内标物和待测组分的峰面积（或峰高）及相对校正因子，

本法是通过测量内标物及欲测组分的峰面积的相对值来进行比较的，因而由于操作条件变化而引起的误差，将同时反映在内标物及欲测组分上而得到抵消，所以可得到较准确的结果。

这是内标法的主要优点。

内标物的选择是重要的。

它应该是试样中不存在的纯物质；加入的量应该是接近与被测组分；同时要求内标物的色谱峰位于被测组分色谱峰附近，或几个被测组分色谱峰中间，并且与这些组分完全分离，还应注意内标物与被测组分的物理及物理化学性质（如挥发度、化学结构、极性以及溶解度等）相近，这样，当操作条件变化时，更有利于内标物与被测组分做匀称的变化。

此法优点是定量较为准确，而且不像归一化法有使用上的限制，但每次分析都要准确称取试样和内标物的质量，因而它不利于做快速控制分析。

在此实验中将使用内标法来测定烟碱的含量方法如下:

内标法是将一定重量的纯物质作为内标物加到一定量的被分析样品混合物中，然后对含有内标物的样品进行色谱分析，分别测定内标物和待测组分的峰面积（或峰高）及相对校正因子，可求出被测组分在样品中的百分含量：

校正因子（f）：

f=（As/ms）/（Ar/mr）

其中As和Ar分别为内标物和对照品的峰面积或峰高，ms和mr分别为加入内标物和对照品的量。

根据含内标物的待测组分溶液色谱峰响应值，计算烟碱含量（mi）：

mi=f×Ai/（As/ms）

其中Ai和As分别为供试品和内标物的峰面积或峰高，ms为加入内标物的量（必要时，再根据稀释倍数、取样量和标示量折算成为标示量的百分含量，或根据稀释倍数和取样量折算成百分含量）。

1.3检测方法学考察

1.3.1线性关系的考察

线性在两个变量之间存在一次性关系，就称它们之间存在线性关系。

正比例关系是线性关系中的特例，反比例关系不是线性关系。

更通俗一点讲，如果把两个变量分别作为点的横坐标与纵坐标，其图像是平面上的一条直线，则这两个变量之间的关系就是线性关系。

即如果可以用一个二元一次方程来表达两个变量之间关系的话，这两个变量之间的关系称之为线性关系。

线性范围是指利用一种方法取得精密度、准确度均符合要求的试验结果，而且成线性的供试物浓度的变化范围，其最大量与最小量之间的间隔，可用mg／L~mg／L、ug／ml~ug／ml等表示。

1.3.2精密度的考察

精密度是用来表示测量结果中随机误差大小的程度，也可以简称为精度，描述测量数据的分散程度。

即指多次重复测定同一量时各测定值之间彼此相符合的程度，表征随机误差的大小。

精密度表示测量的重现性，是保证准确度的先决条件，但是高的精密度不一定能保证高的准确度。

好的精密度是包拯获得良好准确度的先决条件，一般来说，测量精密度不好，就不可能有好的准确度，反之，测量精密度好，准确度也不一定好，这种情况表明随机误差小，但系统误差大。

精密度通常以计算平均差、极差、标准差或方差来量度。

精密度同被测定的量值的大小和浓度有关，因此，在报告精密度时，应该指明获得该精密度的被测定的量值的大小和浓度。

1.3.3重现性实验的考察

在不同的实验室由不同分析人员测定同一样品各个独立测定结果之间的精密度，称为重现性。

当分析方法将被法定标准采用时，应进行重现性实验。

例如，建立兽药典分析方法时应通过不同实验室的复核检查得出重现性结果，复查检验的目的、过程、重现性结果均应记载在起草说明中。

应注意重现性实验用的样品本身的质量的均匀性和储存运输中环境等影响因素，以免影响重现性结果。

1.3.4回收率

是指投射到物体上而被吸收的热辐射能与投射到物体上的总热辐射能之比称为该物体的吸收率。

这是针对所有波长而言，应称为全吸收率，通常就简称为吸收率。

1.3.5验证性

验证性实验是指对研究对象有了一定了解,并形成了一定认识或提出了某种假说,为验证这种认识或假说是否正确而进行的一种实验.验证性实验强调演示和证明科学内容的活动,科学知识和科学过程分离,与背景无关,注重探究的结果（事实,概念,理论）,而不是探究的过程.验证性实验传递了这样一种信息:

了解一个发现和如何把这个发现的结果应用到一个确定的问题上比直接学习如何发现要重要得多.验证性实验强调实验操作和观察等个别智力技能,强调任何快速经济的获得生物化学知识。

2实验部分

2.1目的

本次试验以喹啉为内标物，烟碱为测定对象，考查及检测气相色谱法内标法测定烟碱含量的方法学。

学会气相色谱法的原理及应用，内标法的理解及实际操作，并检测出烟碱的含量。

学会线性关系，重现性，精密度，吸收率的验证实验的设计和结果分析。

2.2材料和仪器

2.2.1材料

98％烟碱（自制备）、喹啉（分析级别）、水（蒸馏水）、进样量为1ul、甲醇（分析级别）

2.2.2仪器

气相色谱仪（7890Ⅱ型上海天美公司）、毛细管柱（30mlengthTM—WAXFrom20℃to260℃）

2.3色谱条件

气体流速:

N230ml/minAir400ml/minH210ml/min

柱箱温度（OVEN）180℃进样口温度（INJ）260℃

检测器温度（DET）260℃

2.4实验设计及结果分析

通过实验及对实验结果的分析得出以下结论。

2.4.1线性关系实验的考察

所用试剂：

100ug/mL烟碱甲醇溶液，100ug/mL喹啉甲醇溶液，甲醇（99%以上）

配制浓度分别为1、10、20、30、40、50ug/ml的烟碱甲醇溶液，内含50ug/ml的喹啉，吸取1ul进样检测，并记录烟碱和喹啉的峰面积及峰高，计算出它们之间的峰高比和面积比，结果见表1。

表1：

烟碱/喹啉的峰高比及面积比

Table1:

peakheightratioandarearatioofnicotine/quinoline

TestuL

--------------------------------------peakheightratioarearatio

No.nicotinequinolinemethylhydroxide

1050050000

21005004000.072960.07293

32005003000.181290.17391

43005002000.240000.55056

54005001000.637360.55287

650050000.800850.67499

图1烟碱/喹啉的峰高比

Fig.1peakheightratioofnicotine/quinoline

以烟碱与喹啉的峰高比为Y轴，以烟碱含量（单位ug）为X轴的回归方程分别为Y=-0.07088+0.00174X（r=0.98356）由此可以看出烟碱含量在0—50ug/ml范围内，采用气相色谱法测定时其浓度与峰高比呈良好的线性关系。

用Origin7.5软件处理数据作图如下：

图2烟碱与喹啉的面积比

Fig.2arearatioofnicotine/quinoline

以烟碱与喹啉的面积比为Y轴，以烟碱含量（单位ug）为X轴的回归方程分别为Y=-0.04956+0.00143X（r=0.9892）由此可以看出烟碱含量在0—50ug/ml范围内，采用气相色谱法测定时其浓度与峰面积比呈良好的线性关系。

用Origin7.5软件处理数据作图如下：

2.4.2精密度实验的考察

配制浓度为50ug/ml的烟碱甲醇溶液，内含50ug/mL的喹啉，取同一支试管中的试液连续进5针，并记录烟碱和喹啉的峰面积及峰高，计算出它们之间的峰高比和面积比，结果见表2。

表2：

精密度试验

Table2：

precision

TestuL

----------------------------peakheightratioarearatio

No.nicotinequinoline

15005000.800850.67499

25005000.772640.67436

35005000.499400.54750

45005000.870850.76262

55005000.396580.40752

峰高比:

S=0.2016RSD%=30.1%

面积比:

S=0.2762RSD%=49.9%

2.4.3重现性实验的考察

配制浓度为50ug/ml的烟碱甲醇溶液，内含50ug/mL的喹啉，5支试管中的试液各进1针，并记录烟碱和喹啉的峰面积及峰高，计算出它们之间的峰高比和面积比，结果见表3。

表3：

重现性试验

Table3：

reproducibility

TestuL

----------------------------peakheightratioarearatio

No.nicotinequinoline

15005000.391850.40751

25005000.396580.38030

35005000.724990.68784

45005000.454620.44840

55005000.718820.66520

峰高比:

S=0.18037RSD%=33.6%

面积比:

S=0.1323RSD%=25.5%

2.4.4结果分析

1.线性关系试验中，t检验峰值比的t=9.50>t0.01，面积比的t=11.60>t0.01，查表t0.01=4.61，说明线性关系较好。

2.精密度试验及重现性试验，就差异系数而言，RSD﹪远大于5﹪，精密度很不好。

偶然误差存在几率较大，但也有可能操作人员不熟练出现“误差”，造成结果不精确。

参考文献：

[1]王瑞新，烟草化学[M]，北京：

中国农业出版色，2010。

[2]刘惠明，穆怀静，王芳等。

烟草科技。

2007年,27（7）:

75-78。

[3]陈燕，烟草科技，2006年。