CD8mAb对呼吸道合胞病毒诱导的哮喘小鼠气道炎症的影响.docx

CD8mAb对呼吸道合胞病毒诱导的哮喘小鼠气道炎症的影响.docx

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CD8mAb对呼吸道合胞病毒诱导的哮喘小鼠气道炎症的影响

CD8mAb对呼吸道合胞病毒诱导的哮喘小鼠气道炎症的影响

【摘要】目的：

观察CD8mAb对呼吸道合胞病毒诱导哮喘小鼠气道炎症的影响.方法：

Balb/c小鼠50只，随机分成5组：

磷酸盐缓冲液对照组；卵白蛋白组；OVA/RSV模型组；CD8mAb治疗组；IgG2αmAb治疗对照组.应用OVA腹腔注射致敏、OVA气道雾化结合RSV滴鼻激发复制小鼠哮喘模型，观察实验动物气道炎症和气道反应性变化，支气管肺泡灌洗液作细胞分类计数，测定BALF上清中白细胞介素4,IL5,干扰素γ含量并采用三色光流式细胞分析法检测气管旁淋巴结中CD4+,CD8+T细胞及细胞内细胞因子IFNγ,IL4,IL5表达.结果：

与模型组相比，CD8mAb可明显减轻小鼠气道炎症和气道高反应.CD8mAb治疗后BALF中嗜酸性粒细胞及上清中细胞因子IFNγ,IL4,IL5含量明显减少，CD8+T细胞百分比及Tc2/Tc1比值明显下降.PBLN中CD8+T细胞百分比与BALF中IFNγ,IL4,IL5含量呈显着正相关（分别rs=,;rs=,;rs=,）.结论：

CD8mAb对RSV诱导的哮喘小鼠气道炎症和气道高反应具有抑制作用，其部分机制可能与致敏条件下病毒感染引起CD8+T细胞功能发生转化，即由产生IFNγ为特征的细胞毒CD8+T细胞转化为产生IL4,IL5为特征的非细胞毒CD8+T细胞有关.

【关键词】呼吸道合胞病毒；哮喘；CD8+T细胞；CD8单克隆抗体；气道炎症

0引言

临床及流行病学研究表明，呼吸道病毒感染是哮喘急性加重、致死的重要原因［1］.Osullivan等［2］在因重度哮喘死亡患者的肺标本中检测到呼吸道合胞病毒,鼻病毒基因组，并发现气管旁有大量CD8+T细胞浸润，且CD8+T细胞表面分子CD25,穿孔素表达增高，提示重度哮喘患者气道局部存在CD8+T细胞数量和功能的异常.Schwarze等［3］的研究表明，病毒诱导的哮喘与过敏性哮喘在气道炎症的发生机制上有所不同，前者的Th2型炎症主要由CD8+T细胞产生和维持，而后者主要由CD4+T细胞产生和维持.上述研究提示，CD8+T细胞在呼吸道病毒诱导的哮喘发作及急性加重中起重要作用.因此，我们采用RSV诱导的小鼠哮喘模型，观察CD8mAb对哮喘气道炎症和气道反应性的影响.

1材料和方法

材料

动物、试剂和仪器清洁级雌性Balb/c小鼠50只，6~8周龄，体质量17~20g.乙酰胆碱,卵白蛋白;IFNγ,IL4,IL5酶联免疫吸附试验试剂Kit;大鼠抗小鼠CD8a（Ly2）mAb，大鼠抗小鼠IgG2αmAb对照抗体;流式细胞检测试剂盒包括：

刺激剂卟啉醇肉豆蔻酸乙酸酯,离子霉素,阻断剂（brefeldinA,BFA），大鼠抗小鼠PECy5标记CD3，FITC标记CD8，PE标记IFNγ,IL4,IL5mAb及大鼠IgG1阴性对照（Caltag）;动物肺功能体描箱，呼吸机（北京鑫奥成科技有限公司提供）；软件分析系统，酶标仪，真空冻干机，FACScalibur流式细胞仪.

细胞和病毒RSVLong株A型;人喉癌上皮细胞.HEp2细胞在含100mL/L灭活胎牛血清的DMEM中37℃,50mL/LCO2条件下培养，细胞长满单层后，RSV接种HEp2细胞，继续在含20mL/L灭活胎牛血清的DMEM的维持液中培养，待细胞病变达100%时收获病毒，并冻存于-80℃冰箱中，反复冻融、离心后，留上清备用.参照文献［4］的方法采用空斑形成试验测定病毒滴度，取滴度为×106空斑形成单位RSV备用.

方法

实验分组和动物模型Balb/c小鼠50只随机分成5组，每组10只，分别为磷酸盐缓冲液对照组；卵白蛋白（OVA）组；OVA/RSV模型组；CD8mAb治疗组；IgG2αmAb治疗对照组.动物分别于第1，14日腹腔注射致敏液mL，第15日起将小鼠置于透明密闭容器中以10g/LOVA溶液10mL雾化吸入，每次20min，隔日1次，连续5wk，并分别于第21,35,49日用滴度为×106PFu/mL的RSV50μL鼻腔滴入，每日观察小鼠症状，于最后1次RSV滴入4d后测气道反应性.CD8mAb治疗组和IgG2αmAb治疗对照组分别于RSV应用6h后按1mg/kgipCD8mAb和IgG2αmAb对照抗体.

气道反应性测定小鼠经腹腔麻醉、气管切开后，置密闭体描箱中，吸气管、呼气管、测压管按指示连接，小鼠按频率90次/min、潮气量5~6mL/kg机械通气，调节呼气末压为-8cmH2O，记录经肺压、流速、潮气容积变化.气道反应性用ACH激发后以肺阻力（RL）表示，将ACH分别按浓度、容积为35μL/次尾静脉注射激发，经肺压和潮气容积曲线回到基线后，将浓度增加3倍，每次应用ACH后记录至少10次峰反应的肺变量.

肺泡灌洗液（

　　BALF）细胞分类计数以mLPBS进行肺泡灌洗，反复2次，1200r/min离心5min，上清保存在-20℃冰箱中待测定细胞因子.沉淀细胞用mLHanks液重悬，取mL进行细胞计数，其余沉淀细胞经涂片，瑞氏吉姆莎染色，按细胞形态进行分类计数（至少计数200个细胞）.

细胞因子测定将BALF上清放入真空冻干机内-70℃冻干后，加入200μL生理盐水重融，按ELISA试剂说明书检测其中IFNγ,IL14,IL5含量.

三色光流式细胞分析取气管旁淋巴结（PBLN）3~4枚，眼科剪仔细剪碎，经300目尼龙膜过筛获单细胞悬液，1200r/min离心5min,将沉淀细胞置于RPMI1640培养液中，调整细胞密度为×105/L，按参考文献［5］的方法进行流式细胞检测.

肺组织病理学变化取右肺中叶进行乙醇脱水，石蜡包埋连续切片，常规苏木素伊红染色观察大体组织病变和炎症细胞浸润情况.

统计学处理：

实验数据以x±s表示，用统计软件进行分析，气道反应性变化采用析因设计方差分析，其余指标组间比较采用单因素方差分析，相关性采用Spearman等级相关分析，以为差异有统计学意义.

2结果

2．1气道反应性变化当ACH分别按5，15和45g/L浓度激发时，OVA组RL分别为，（±）和（±）cmH2o/（mL・s）;与OVA/RSV模型组，（±）和（±）cmH2o/（mL・s）比较，两组差异具有统计学意义;与OVA/RSV模型组比较，应用CD8mAb后，（±）和（±）cmH2o/（mL・s），气道反应性明显下降.　vsOVA组；　vsOVA/RSV模型组.OVA：

卵白蛋白；RSV：

呼吸道合胞病毒；ACH:

乙酰胆碱.图1各组动物气道反应性变化细胞分类计数及上清细胞因子表达与OVA组比较，OVA/RSV模型组嗜酸性粒细胞及细胞因子IFNγ,IL4,IL5明显升高.应用CD8mAb后嗜酸性粒细胞及细胞因子IFNγ,IL4,IL5明显下降.表1各组BLAF中细胞分类计数

中CD4+,CD8+T细胞及胞内细胞因子表达与OVA组比较，OVA/RSV模型组CD8+T细胞百分比及Tc2/Tc1比值明显升高.应用CD8mAb后CD8+T细胞百分比、Tc2/Tc1比值下降.表2各组PBLN中CD4+,CD8+T细胞及胞内细胞因子表达变化

肺组织病理学变化OVA/RSV模型组气道上皮增厚、破坏，管腔狭窄，有支气管收缩征象，管壁周围大量炎症细胞浸润.CD8mAb治疗后气道上皮增厚，管腔狭窄，管壁周围炎症细胞浸润较模型组减轻.治疗对照组与模型组比较无明显变化.OVA组气道上皮增厚，管壁周围炎症细胞浸润程度亦较模型组减轻.PBS组未见明显病理变化.

相关性分析经Spearman等级相关分析,PBLN中CD8+T细胞百分比与BALF中IFNγ,IL4,IL5细胞因子含量呈显着正相关（分别rs=,;rs=,;rs=,）.

3讨论

本研究观察到，与OVA组比较，OVA/RSV模型组小鼠气道炎症、肺阻力明显增加，提示OVA致敏后RSV感染可显着加重哮喘，这与大部分的研究结果相同［6］.采用流式细胞分析进一步检测PBLN中CD4+,CD8+T细胞百分比发现，OVA/RSV模型组CD8+T细胞百分比及Tc2/Tc1比值较OVA组明显升高，且CD8+T细胞百分比与BALF中IFNγ,IL4,IL5细胞因子含量呈显着正相关，提示与OVA致敏性哮喘不同，OVA致敏条件下RSV感染后BALF中IFNγ,IL4,IL5细胞因子主要来源于CD8＋T细胞，即CD8＋T细胞，尤其Tc2在呼吸道病毒诱导的哮喘加重中起重要作用.新近研究表明［7］，外源性IL4能体外诱导CD8＋T细胞分泌Th2型细胞因子如IL5,IL13，提示在哮喘患者IL4表达占优势的环境中，病毒感染可刺激CD8＋T细胞合成Th2型细胞因子，这可能是呼吸道病毒加重哮喘的原因.

应用CD8mAb后，OVA/RSV模型组小鼠气道反应性明显下降，BALF中IL4,IL5,IFNγ含量及嗜酸性粒细胞均显着下降，气道周围炎症细胞浸润亦明显减轻，提示CD8mAb可显着抑制RSV感染相关哮喘的气道炎症和AHR.这可能与致敏条件下在Th2型细胞因子环境中，RSV感染引起细胞毒CD8+T细胞转化为产生IL5的非细胞毒T细胞，CD8mAb对其的抑制可使Th2型细胞因子和嗜酸性粒细胞气道分泌、趋化减少有关.当然，CD8+T细胞对气道上皮产生直接破坏以及CD8+T细胞介导嗜酸性粒细胞脱颗粒，其中释放的主要碱性蛋白（MBP）能结合气道平滑肌M2受体导致M2受体功能下降，促进AHR［8］，CD8mAb对其的抑制效应可在保护气道上皮、减轻气道炎症和AHR中起一定作用.

综上所述，OVA致敏条件下RSV感染可明显增加气道炎症和气道反应性，其中CD8+T细胞表型的转化加重Th2型气道炎症并导致大量嗜酸性粒细胞气道募集可能起重要作用.由于临床上病毒诱发的哮喘十分频繁，且与哮喘的急性加重密切相关，针对CD8+T细胞的单克隆抗体治疗有可能在减少哮喘的急性发作，减轻哮喘病情、降低死亡率探索一条新途径.

【参考文献】

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