抗CD20单克隆抗体ADCC生物学活性方法的建立.docx
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抗CD20单克隆抗体ADCC生物学活性方法的建立
抗CD20单克隆抗体ADCC生物学活性方法的建立
王兰6，刘春雨6，郭玮，于传飞，张峰，王文波，李萌，高凯*
中国食品药品检定研究院单克隆抗体产品室，北京100050
6：
并列第一作者；*通讯作者
【摘要】目的建立抗CD20单克隆抗体的ADCC生物学活性检测方法。
方法利用Jurkat/NFAT-luc+FcγRIIIα细胞系作为效应细胞，WIL2-S细胞系作为靶细胞，通过荧光素酶检测系统（BioGloTMLuciferaseAssaysystem）进行抗CD20单抗的ADCC生物学活性检测，并对试验条件进行优化及方法学验证。
结果抗CD20单抗在该方法中存在量效关系，且符合四参数方程式：
y=（A-D）/［1+
（X/C）B］+D。
方法经优化确定靶细胞为WIL2-S细胞，抗体稀释浓度为18000ng/ml，1:
5倍的稀释倍数，效靶比为6:
1，诱导时间为6h。
该方法具有良好的专属性，8次独立试验的回归分析、线性及平行性均通过统计学检验；4个不同稀释组回收率样本经3次测定，相对效价分别为44.39±3.93、72.74±2.78、128.28±7.01以及168.19±2.70，变异系数均小于10%，回收率分别为88.78±
7.85、96.99±3.70、102.63±5.61以及112.12±1.80。
结论首次成功建立抗CD20
单抗ADCC生物学活性的转基因细胞检测方法，该方法专属性强、重复性好，准确性高，可作为抗CD20单抗ADCC生物学活性的常规检测方法。
【关键词】抗CD20单克隆抗体；ADCC；生物学活性；荧光素酶检测系统
CD20抗原是分子量为35kD的非糖基化跨膜蛋白，CD20作为B细胞表面特有的分化抗原，在95%以上的B细胞淋巴瘤细胞膜上高密度表达，而在造血干细胞、血浆细胞和其它正常组织中不表达。
且CD20分子在与单克隆抗体结合后，无显著内化及脱落，是B淋巴细胞瘤免疫靶向治疗的理想靶点。
目前抗CD20单克隆抗体产品已显示良好的临床疗效并得到广泛应用。
大量研究表明，CD20单抗与B细胞淋巴瘤表面抗原结合后,主要通过补体依赖的细胞毒作用
（CDC）以及抗体依赖细胞介导的细胞毒作用（ADCC）将肿瘤细胞溶解。
ADCC
基金项目：
国家“重大新药创制”科技重大专项（编号2014ZX09304311-001、2012ZX09304010）通讯作者：
高凯，E-mail:
效应是CD20单抗杀伤肿瘤靶细胞重要机制之一。
CD20单抗与B细胞淋巴瘤细胞表面的CD20抗原结合后，导致抗体Fc段构象改变而并与细胞毒效应细胞表面上表达的FcRγIIIa结合,从而激发NK、巨噬细胞等效应细胞的杀伤活性，释放穿孔素和颗粒酶，对肿瘤靶细胞进行杀伤。
目前以CD20抗原为靶点的嵌合、人源化及其它各种突变体抗体药物质量研究中，其生物学活性主要采用的是CDC活性测定。
但在抗CD20单抗的另一作用机制ADCC生物学活性领域鲜有问津。
传统的ADCC测活方法多为基于新鲜制备的外周血单个核细胞（peripheralbloodmononuclearcells，PBMC）或者NK细胞作为效应细胞的杀伤试验，存在着变异大、操作繁琐、高背景值等缺陷，因此迫切需要研究建立评价ADCC生物学活性的新方法。
本文以荧光素酶报告基因检测系统为平台，利用改造后的Jurkat细胞系，在国内首次建立了灵敏、快速的ADCC生物学活性检测方法。
1.材料与方法
1.1细胞系
WIL2-S细胞系（购自ATCC）；Jurkat/NFAT-luc+FcγRIIIa细胞系（购自Promega公司）。
该细胞系是稳定转染FcγRIIIa受体以及NFAT（nuclearfactorofactivatedT-cells）反应元件质粒的急性T细胞白血病细胞系细胞系，FcγRIIIa受体是介导ADCC生物学活性的必要分子，通过单抗的Fc段将效应细胞与靶细胞连接起来，激活NFAT通路，启动荧光素酶报告基因的表达。
1.2供试品
抗CD20单抗参比品和供试品为本室留样。
1.3主要试剂及仪器
胎牛血清（FBS）、无酚红RPMI1640培养基、MEM非必需氨基酸溶液（NEAA）及潮霉素B溶液为GIBCO公司产品；牛血清白蛋白（BSA）、G418硫酸盐及Bio-GloTMLuciferaseAssaysystem为Promega公司产品；M5多功能酶标仪及SoftMax分析软件为美国MolecularDevices公司产品；PLA2.0平行线分析软件为Stegmann公司产品。
1.4ADCC剂量效应曲线的绘制
收集对数生长期的WIL2-S细胞及Jurkat/NFAT-luc+FcγRIIIa细胞，1000rpm离心5min后以含0.5%BSA的无酚红RPMI1640培养基（稀释液）重悬细胞，调整细胞浓度分别至1×106个/ml及6×106个/ml，首先将靶细胞WIL2-S接种于白色不透明96孔细胞培养板中，25μl/孔；以稀释液预稀释抗CD20单抗至18000ng/ml，再以稀释液进行1：
5倍稀释，共设9个稀释度，每一稀释度设2个复孔；将稀释好的抗CD20单抗加入已接种WIL2-S细胞的培养板内，25μl/孔，再加入效应细胞Jurkat/NFAT-luc+FcγRIIIa，25μl/孔；以25μl稀释液代替抗CD20单抗作为阴性对照孔（Negative），75μl稀释液作为及背景孔（Background，BG）；置37℃，5%CO2条件下诱导6h后，室温条件下平衡至少15min；加入荧光素酶底物溶液，75μl/孔，混合后在室温条件下反应5min，用M5酶标仪在细胞培养板上读取相对光单位（Relativelightunits，RLU）数值并按照以下公式计算诱导倍数（FoldofInduction，FI）。
FI＝RLU（反应均值—背景均值）/RLU（阴性对照均值—背景均值）；利用SoftMax软件分析试验数据，以抗CD20单抗浓度对数为x轴，对应的FI值为y轴，选用四参数方程回归模型，拟合抗CD20单抗的剂量效应曲线。
1.5试验条件的优化
1.5.1靶细胞的选择
分别以表达CD20（+）的人B淋巴细胞WIL2-S、Raji及Daudi细胞作为靶细胞，按1.4项方法进行检测。
1.5.2抗体浓度范围的选择
设定抗CD20单抗的预稀释浓度为3000ng/ml，分别进行1:
3、1:
4的梯度稀释；同时设定抗CD20单抗的预稀释浓度为18000ng/ml进行1:
5的梯度稀释，按1.4项方法进行检测。
1.5.3效靶比的选择固定效应细胞数量，以改变靶细胞数量的方式分别设定效靶比为3:
1、4:
1、
5:
1、6:
1、7.5:
1、10:
1、15:
1和30:
1，按1.4项方法进行检测。
1.5.4诱导时间的选择
分别设定诱导时间为3h、4h、5h、6h、7h及23h，按1.4项方法进行检测。
1.6方法学验证
1.6.1专属性试验
（1）靶细胞专属性：
以CD20（-）的C8166细胞及稀释液代替WIL2-S细胞进行检测。
（2）效应细胞专属性：
以未转染NFAT-luc-FcγRIIIa的Jurkat细胞及稀释液代替
Jurkat/NFAT-luc+FcγRIIIa细胞进行检测。
（3）抗体专属性：
以抗HER-2单抗及稀释液代替抗CD20单抗进行检测。
1.6.2精密性试验
制备抗CD20单抗预稀释浓度分别为18000ng/ml的50%、75%、100%、125%及150%的样品，每个样品重复检查4次，根据各样品的半数有效浓度（EC50），以100%样品作为参比品，按照以下公式计算相对效价，计算相对效价的变异系数CV（%），验证该方法的精密性。
相对效价（%）＝参比品EC50/样品EC50×100%1.6.3准确性试验
制备抗CD20单抗预稀释浓度分别为18000ng/ml的50%、75%、100%、125%及150%的样品，每个样品重复检查4次，按下式计算回收率，验证该方法的准确性。
回收率（%）＝相对效价测定值/相对效价理论值×100%
2.结果
2.1抗CD20单抗的ADCC剂量效应曲线
利用SoftMax软件分析试验数据，以抗CD20单抗浓度对数为x轴，对应的诱导倍数值为y轴，选用四参数方程回归模型，拟合抗CD20单抗的剂量效应曲
线。
所得数据经SoftMax软件分析，符合四参数方程式：
y=（A-D）［/
1+（X/C）
B］+D，在半对数坐标纸上呈典型的S型曲线，R2＞0.99，见图1。
EC50为7.32ng/ml
（式中C值）。
图1抗CD20单抗ADCC剂量效应曲线
Fig1.Dose-responsecurveofanti-CD20mAbADCC
2.2ADCC试验条件的优化
2.2.1靶细胞的选择
分别以表达CD20（+）的人B淋巴细胞WIL2-S、Raji及Daudi细胞作为靶细胞进行检测，结果见图2。
上述三种细胞作为表达CD20分子的人B淋巴细胞，均可作为抗CD20单抗介导ADCC生物学活性的靶细胞，WIL2-S细胞呈现更好的剂量效应曲线，最大诱导倍数达50.4，分别为Raji细胞和Daudi细胞的2.585倍和2.625倍。
图2三种CD20（+）靶细胞ADCC剂量效应曲线比较
Fig2.Comparedose-responsecurvefromthreegroupsofdifferentCD20（+）targetcell
2.2.2抗体浓度范围的选择
分别对抗CD20单抗进行1:
3倍、1:
4倍（预稀释浓度为3000ng/ml）及1:
5倍（预稀释浓度为18000ng/ml）的梯度稀释，共设9个稀释度，结果见图3。
基于保证剂量效应四参数曲线平台及保证诱导效果的考虑，在检测抗CD20单抗ADCC生物学活性时，最终选择起始稀释浓度为18000ng/ml，1:
5倍的稀释方案。
图3三种稀释方案ADCC剂量效应曲线比较
Fig2.Comparedose-responsecurvefromthreegroupsofdifferentdilutingdesign
2.2.3效靶比的选择
固定效应细胞调整靶细胞使之效靶比分别为3:
1、4:
1、5:
1、6:
1、7.5:
1、10:
1、15:
1和30:
1，共8组。
结果见图4。
改变不同效靶比得到不同ADCC诱导倍数的结果，E:
T=6:
1时可以得到最大诱导倍数。
图4八种不同效靶比ADCC剂量效应曲线比较
Fig4.Comparedose-responsecurvefromeightgroupsofdifferentE:
T
2.2.4诱导时间的选择
改变加入靶细胞、抗CD20单抗及效应细胞后的诱导时间，共设立3h、4h、5h、6h、7h及23h共7组。
结果见图5。
改变不同诱导时间得到不同ADCC诱导倍数的结果，诱导时间为6-7h均可得到较大诱导倍数，考虑到工作效率等因素，选择诱导时间为6h。
图5七种不同诱导时间下ADCC剂量效应曲线比较
Fig5.Comparedose-responsecurvefromsevengroupsofdifferentinductiontime
2.3方法学验证
2.3.1专属性
设立6组对照，分别为：
靶细胞专属性：
a稀释液+抗CD20单抗+效应细胞；bC8166细胞（CD20-）
+抗CD20单抗+效应细胞；
效应细胞专属性：
c靶细胞+抗CD20单抗+稀释液；d靶细胞+抗CD20单抗
+Jurkat（NFAT-luc-；FcγRIIIa-）；
抗体专属性：
e靶细胞+稀释液+效应细胞；f靶细胞+抗HER-2单抗+效应细胞；
结果见图6。
可见ADCC试验的成功依赖于专属的靶细胞、效应细胞及抗体。
图6抗CD20单抗ADCC生物学活性专属性试验检测结果
Fig6.Specificityresultsofanti-CD20mAbADCC
2.3.2.重现性
按1.4项方法分别进行8次独立检测，EC50平均值为11.43±0.88ng/ml，变异系数CV为7.74%，绘制剂量效应曲线，见图7。
以第1次结果数据做参比，用PLA2.0软件对数据进行平行线分析，结果显示8条曲线的回归分析、线性及平行性均通过统计学检验，见表1。
图7抗CD20单抗ADCC生物学活性重现性试验检测结果
Fig7.Repeatabilityresultsofanti-CD20mAbADCC
表1抗CD20单抗ADCC生物学活性重现性试验PLA分析结果（n=8）Tab1.PLAanalysisresultsofanti-CD20mAbADCCrepeatability（n=8）
回归分析线性
平行性
PLA分析
F
P
F
P
F
P
统计学检验
1
/
/
/
/
/
/
参比
2
159.264
＜0.05
0.000
＞0.05
0.044
＞0.05
通过
3
128.517
＜0.05
0.000
＞0.05
0.420
＞0.05
通过
4
157.504
＜0.05
0.000
＞0.05
0.498
＞0.05
通过
5
161.637
＜0.05
0.000
＞0.05
0.001
＞0.05
通过
6
164.958
＜0.05
0.000
＞0.05
0.384
＞0.05
通过
7
152.325
＜0.05
0.000
＞0.05
0.000
＞0.05
通过
8
159.732
＜0.05
0.000
＞0.05
0.381
＞0.05
通过
2.3.3精密性
按照1.6.2项制备50%、75%、100%、125%及150%回收率样品，重复检测4次，结果见表2。
四组样品的相对效价（%）平均值分别为44.39±3.93、72.74
±2.78、128.28±7.01以及168.19±2.70。
变异系数CV（%）均小于10%。
表2抗CD20单抗ADCC生物学活性试验相对效价及回收率检测结果（n=4）Tab2.Potencyandrecoveryofanti-CD20mAbADCC（n=4）
相对效价（%）
样品
回收率（%）
50%样品
±SD44.39±3.93
CV（%）
8.85
±SD88.78±7.85
CV（%）
8.84
75%样品
125%样品
150%样品
72.74±2.78
128.28±7.01
168.19±2.70
3.82
5.47
1.61
96.99±3.70
102.63±5.61
112.12±1.80
3.81
5.47
1.61
2.3.4准确性
4组回收率样品的回收率分别为88.78±7.85、96.99±3.70、102.63±5.61以及112.12±1.80，见表2。
2.3.5.线性
分别以四组样品的相对效价理论值与实测值进行直线回归分析，相关系数为0.9905，两回归线的斜率b之间差异无统计学意义（t=0.033，p>0.05），表明两者的剂量效应曲线相同。
3.讨论
近年来包括Rituximab在内众多重磅炸弹类药品的专利期即将结束，因此以CD20作为靶点的抗体生物类似药（Biosimilar）、人源化抗体、新型高亲和力抗体突变体等一直是国内外研发的热点。
目前我国也有超过10家单位专注于各类抗CD20单抗的研制。
因此如何确保众多抗CD20单抗药物的安全有效，是质量控制标准化研究面临的重要任务之一。
抗CD20单抗ADCC活性是其发挥生物学效应的重要因素，但目前尚无稳定而可靠的ADCC活性检测方法，因此大多抗CD20单抗的质量控制中未进行有效评价。
本文建立的抗CD20单抗ADCC生物学活性测定方法是利用经过基因工程改造的Jurkat细胞系，基于荧光素酶报告基因活性检测系统测定抗CD20单抗的ADCC生物学活性。
抗CD20抗体经倍比稀释后，可以得到较好的S型剂量效应曲线。
通过试验条件的优化，选择WIL2-S作为靶细胞，单抗预稀释浓度为18000ng/ml，按照1:
5倍进行梯度稀释；效靶比选择在6:
1；诱导时间选择6h。
方法学验证数据显示，ADCC的试验成功必须基于特异的CD20阳性靶细胞、特异性的单抗以及FcγRIIIa阳性效应细胞，由于EC50值不仅取决于单抗的亲和力还会受到效靶比、诱导时间、试验用缓冲液等条件影响，导致不同试验件EC50值的变异度较大，因此评价ADCC的方法利用相对效价更加合理可信，相对效数值越低，则说明单抗的ADCC生物学活性越大。
该方法操作简便易行，专属性强、重复性好，准确性高，可作为抗CD20单抗ADCC生物学活性的常规检查方法。
致谢感谢中国食品药品检定研究院中青年发展研究基金（2012B6）对本研究工作的支持。
参考文献
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3.Parekh,B.S.etal.（2012）Developmentandvalidationofanantibody-dependentcell-mediatedcytotoxicity-reportergeneassay.mAbs4,1–9.
4.Surowy,T.etal.（2012）LowvariabilityADCCbioassay.GEN32（7）.
5.Cheng,Z.J.etal.（2012）Developmentofabioluminescentcell-basedbioassaytomeasureFcreceptorfunctionalityinantibody-dependentcell-mediatedcytotoxicity.AmericanAssociationofCancerResearch（AACR）AnnualMeeting,poster#2840.
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