抗CD20单克隆抗体ADCC生物学活性方法的建立.docx

1、抗CD20单克隆抗体ADCC生物学活性方法的建立抗 CD20 单克隆抗体 ADCC 生物学活性方法的建立王兰 6，刘春雨 6，郭玮，于传飞，张峰，王文波，李萌，高凯*中国食品药品检定研究院单克隆抗体产品室，北京 1000506：并列第一作者；*通讯作者【摘要】 目的 建立抗 CD20 单克隆抗体的 ADCC 生物学活性检测方法。方 法 利用 Jurkat/NFAT-luc+FcRIII 细胞系作为效应细胞，WIL2-S 细胞系作为靶 细胞，通过荧光素酶检测系统（BioGloTM Luciferase Assay system）进行抗 CD20 单抗的 ADCC 生物学活性检测，并对试验条件进行

2、优化及方法学验证。结果 抗 CD20 单抗在该方法中存在量效关系，且符合四参数方程式：y =（A - D）/1 +（X/C）B+ D。方法经优化确定靶细胞为 WIL2-S 细胞，抗体稀释浓度为 18000ng/ml，1:5 倍的稀释倍数，效靶比为 6:1，诱导时间为 6h。该方法具有良 好的专属性，8 次独立试验的回归分析、线性及平行性均通过统计学检验；4 个 不同稀释组回收率样本经 3 次测定，相对效价分别为 44.393.93、72.742.78、 128.287.01 以及 168.192.70，变异系数均小于 10%，回收率分别为 88.787.85、96.993.70、102.635

3、.61 以及 112.121.80。结论 首次成功建立抗 CD20单抗 ADCC 生物学活性的转基因细胞检测方法，该方法专属性强、重复性好， 准确性高，可作为抗 CD20 单抗 ADCC 生物学活性的常规检测方法。【关键词】 抗 CD20 单克隆抗体；ADCC；生物学活性；荧光素酶检测系统CD20 抗原是分子量为 35kD 的非糖基化跨膜蛋白，CD20 作为 B 细胞表面 特有的分化抗原，在 95%以上的 B 细胞淋巴瘤细胞膜上高密度表达，而在造血 干细胞、血浆细胞和其它正常组织中不表达。且 CD20 分子在与单克隆抗体结 合后，无显著内化及脱落，是 B 淋巴细胞瘤免疫靶向治疗的理想靶点。目前

4、抗 CD20 单克隆抗体产品已显示良好的临床疗效并得到广泛应用。大量研究表明， CD20 单抗与 B 细胞淋巴瘤表面抗原结合后, 主要通过补体依赖的细胞毒作用（CDC）以及抗体依赖细胞介导的细胞毒作用（ADCC）将肿瘤细胞溶解。ADCC基金项目：国家“重大新药创制”科技重大专项（编号 2014ZX09304311-001、2012ZX09304010） 通讯作者：高凯， E-mail: 效应是 CD20 单抗杀伤肿瘤靶细胞重要机制之一。CD20 单抗与 B 细胞淋巴瘤细 胞表面的 CD20 抗原结合后，导致抗体 Fc 段构象改变而并与细胞毒效应细胞表 面上表达的 FcRIIIa 结合,从而激发

5、 NK、巨噬细胞等效应细胞的杀伤活性，释 放穿孔素和颗粒酶，对肿瘤靶细胞进行杀伤。目前以 CD20 抗原为靶点的嵌合、人源化及其它各种突变体抗体药物质量研 究中，其生物学活性主要采用的是 CDC 活性测定。但在抗 CD20 单抗的另一作 用机制 ADCC 生物学活性领域鲜有问津。传统的 ADCC 测活方法多为基于新鲜 制备的外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMC）或者 NK 细胞作为效应细胞的杀伤试验，存在着变异大、操作繁琐、高背景值等缺陷，因 此迫切需要研究建立评价 ADCC 生物学活性的新方法。本文以荧光素酶报告基 因检测系统为平台

6、，利用改造后的 Jurkat 细胞系，在国内首次建立了灵敏、快速 的 ADCC 生物学活性检测方法。1. 材料与方法1. 1 细胞系WIL2-S 细胞系（购自 ATCC）；Jurkat/NFAT-luc+FcRIIIa 细胞系（购自 Promega 公司）。该细胞系是稳定转染 FcRIIIa 受体以及 NFAT（nuclear factor of activated T-cells）反应元件质粒的急性 T 细胞白血病细胞系细胞系，FcRIIIa 受体是介导 ADCC 生物学活性的必要分子，通过单抗的 Fc 段将效应细胞与靶细胞连接起来， 激活 NFAT 通路，启动荧光素酶报告基因的表达。1.

7、2 供试品抗 CD20 单抗参比品和供试品为本室留样。1. 3 主要试剂及仪器胎牛血清（FBS）、无酚红 RPMI1640 培养基、MEM 非必需氨基酸溶液（NEAA） 及潮霉素 B 溶液为 GIBCO 公司产品；牛血清白蛋白（BSA）、G418 硫酸盐及 Bio-GloTM Luciferase Assay system 为 Promega 公司产品；M5 多功能酶标仪及 SoftMax 分析软件为美国 Molecular Devices 公司产品；PLA2.0 平行线分析软件 为 Stegmann 公司产品。1. 4 ADCC 剂量效应曲线的绘制收集对数生长期的 WIL2-S 细胞及 Ju

8、rkat/NFAT-luc+FcRIIIa 细胞，1000rpm 离心 5min 后以含 0.5% BSA 的无酚红 RPMI1640 培养基（稀释液）重悬细胞， 调整细胞浓度分别至 1106 个/ ml 及 6106 个/ ml，首先将靶细胞 WIL2-S 接种 于白色不透明 96 孔细胞培养板中，25l/孔；以稀释液预稀释抗 CD20 单抗至 18000ng/ml，再以稀释液进行 1：5 倍稀释，共设 9 个稀释度，每一稀释度设 2 个复孔；将稀释好的抗 CD20 单抗加入已接种 WIL2-S 细胞的培养板内，25l/ 孔，再加入效应细胞 Jurkat/NFAT-luc+FcRIIIa，2

9、5l/孔；以 25l 稀释液代替抗 CD20 单抗作为阴性对照孔（Negative），75l 稀释液作为及背景孔（Background， BG）；置 37，5% CO2 条件下诱导 6h 后，室温条件下平衡至少 15min；加入荧 光素酶底物溶液，75l/孔，混合后在室温条件下反应 5min，用 M5 酶标仪在细 胞培养板上读取相对光单位（Relative light units，RLU）数值并按照以下公式计 算诱导倍数（Fold of Induction，FI）。FIRLU（反应均值背景均值）/RLU（阴 性对照均值背景均值）；利用 SoftMax 软件分析试验数据，以抗 CD20 单抗浓

10、度对数为 x 轴，对应的 FI 值为 y 轴，选用四参数方程回归模型，拟合抗 CD20 单抗的剂量效应曲线。1. 5 试验条件的优化1. 5. 1 靶细胞的选择分别以表达 CD20（+）的人 B 淋巴细胞 WIL2-S、Raji 及 Daudi 细胞作为靶 细胞，按 1.4 项方法进行检测。1. 5. 2 抗体浓度范围的选择设定抗 CD20 单抗的预稀释浓度为 3000ng/ml，分别进行 1:3、1:4 的梯度稀 释；同时设定抗 CD20 单抗的预稀释浓度为 18000ng/ml 进行 1:5 的梯度稀释，按 1.4 项方法进行检测。1. 5. 3 效靶比的选择 固定效应细胞数量，以改变靶细

11、胞数量的方式分别设定效靶比为 3:1、4:1、5:1、6:1、7.5:1、10:1、15:1 和 30:1，按 1.4 项方法进行检测。1. 5. 4 诱导时间的选择分别设定诱导时间为 3h、4h、5h、6h、7h 及 23h，按 1.4 项方法进行检测。1. 6 方法学验证1. 6. 1 专属性试验（1）靶细胞专属性：以 CD20（-）的 C8166 细胞及稀释液代替 WIL2-S 细胞进 行检测。（2）效应细胞专属性：以未转染 NFAT-luc-FcRIIIa 的 Jurkat 细胞及稀释液代替Jurkat/NFAT-luc+FcRIIIa 细胞进行检测。（3）抗体专属性：以抗 HER-2

12、 单抗及稀释液代替抗 CD20 单抗进行检测。1. 6. 2 精密性试验制备抗 CD20 单抗预稀释浓度分别为 18000ng/ml 的 50%、75%、100%、125% 及 150%的样品，每个样品重复检查 4 次，根据各样品的半数有效浓度（EC50）， 以 100%样品作为参比品，按照以下公式计算相对效价，计算相对效价的变异系 数 CV（%），验证该方法的精密性。相对效价（%）参比品 EC50/样品 EC50100% 1. 6. 3 准确性试验制备抗 CD20 单抗预稀释浓度分别为 18000ng/ml 的 50%、75%、100%、125% 及 150%的样品，每个样品重复检查 4 次

13、，按下式计算回收率，验证该方法的准 确性。回收率（%）相对效价测定值/相对效价理论值100%2. 结果2. 1 抗 CD20 单抗的 ADCC 剂量效应曲线利用 SoftMax 软件分析试验数据，以抗 CD20 单抗浓度对数为 x 轴，对应的 诱导倍数值为 y 轴，选用四参数方程回归模型，拟合抗 CD20 单抗的剂量效应曲线。所得数据经 SoftMax 软件分析，符合四参数方程式：y=（A - D）/1 +（X /C）B+ D，在半对数坐标纸上呈典型的 S 型曲线，R20.99，见图 1。EC50 为 7.32ng/ml（式中 C 值）。图 1 抗 CD20 单抗 ADCC 剂量效应曲线Fig

14、 1. Dose-response curve of anti-CD20 mAb ADCC2. 2 ADCC 试验条件的优化2. 2. 1 靶细胞的选择分别以表达 CD20（+）的人 B 淋巴细胞 WIL2-S、Raji 及 Daudi 细胞作为靶 细胞进行检测，结果见图 2。上述三种细胞作为表达 CD20 分子的人 B 淋巴细胞， 均可作为抗 CD20 单抗介导 ADCC 生物学活性的靶细胞，WIL2-S 细胞呈现更好 的剂量效应曲线，最大诱导倍数达 50.4，分别为 Raji 细胞和 Daudi 细胞的 2.585 倍和 2.625 倍。图 2 三种 CD20（+）靶细胞 ADCC 剂量效

15、应曲线比较Fig 2. Compare dose-response curve from three groups of different CD20（+）target cell2. 2. 2 抗体浓度范围的选择分别对抗 CD20 单抗进行 1:3 倍、1:4 倍（预稀释浓度为 3000ng/ml）及 1:5 倍（预稀释浓度为 18000ng/ml）的梯度稀释，共设 9 个稀释度，结果见图 3。基 于保证剂量效应四参数曲线平台及保证诱导效果的考虑，在检测抗 CD20 单抗 ADCC 生物学活性时，最终选择起始稀释浓度为 18000ng/ml，1:5 倍的稀释方案。图 3 三种稀释方案 ADCC

16、 剂量效应曲线比较Fig 2. Compare dose-response curve from three groups of different diluting design2. 2. 3 效靶比的选择固定效应细胞调整靶细胞使之效靶比分别为 3:1、4:1、5:1、6:1、7.5:1、10:1、 15:1 和 30:1，共 8 组。结果见图 4。改变不同效靶比得到不同 ADCC 诱导倍数的 结果，E:T=6:1 时可以得到最大诱导倍数。图 4 八种不同效靶比 ADCC 剂量效应曲线比较Fig 4. Compare dose-response curve from eight groups

17、 of different E:T2. 2. 4 诱导时间的选择改变加入靶细胞、抗 CD20 单抗及效应细胞后的诱导时间，共设立 3h、4h、 5h、6h、7h 及 23h 共 7 组。结果见图 5。改变不同诱导时间得到不同 ADCC 诱 导倍数的结果，诱导时间为 6-7h 均可得到较大诱导倍数，考虑到工作效率等因 素，选择诱导时间为 6h。图 5 七种不同诱导时间下 ADCC 剂量效应曲线比较Fig 5. Compare dose-response curve from seven groups of different induction time2. 3 方法学验证2. 3. 1 专属性

18、设立 6 组对照，分别为：靶细胞专属性：a 稀释液+抗 CD20 单抗+效应细胞；b C8166 细胞（CD20-）+抗 CD20 单抗+效应细胞；效应细胞专属性：c 靶细胞+抗 CD20 单抗+稀释液；d 靶细胞+抗 CD20 单抗+Jurkat（NFAT-luc-；FcRIIIa-）；抗体专属性：e 靶细胞+稀释液+效应细胞；f 靶细胞+抗 HER-2 单抗+效应 细胞；结果见图 6。可见 ADCC 试验的成功依赖于专属的靶细胞、效应细胞及抗体。图 6 抗 CD20 单抗 ADCC 生物学活性专属性试验检测结果Fig 6. Specificity results of anti-CD20

19、mAb ADCC2. 3. 2. 重现性按 1.4 项方法分别进行 8 次独立检测，EC50 平均值为 11.430.88ng/ml，变 异系数 CV 为 7.74%，绘制剂量效应曲线，见图 7。以第 1 次结果数据做参比， 用 PLA2.0 软件对数据进行平行线分析，结果显示 8 条曲线的回归分析、线性及 平行性均通过统计学检验，见表 1。图 7 抗 CD20 单抗 ADCC 生物学活性重现性试验检测结果Fig 7. Repeatability results of anti-CD20 mAb ADCC表 1 抗 CD20 单抗 ADCC 生物学活性重现性试验 PLA 分析结果（n = 8）

20、 Tab 1. PLA analysis results of anti-CD20 mAb ADCC repeatability（n = 8）回归分析 线性平行性PLA 分析FPFPFP统计学检验1/参比2159.2640.050.0000.050.0440.05通过3128.5170.050.0000.050.4200.05通过4157.5040.050.0000.050.4980.05通过5161.6370.050.0000.050.0010.05通过6164.9580.050.0000.050.3840.05通过7152.3250.050.0000.050.0000.05通过8159.7

21、320.050.0000.050.3810.05通过2. 3. 3 精密性按照 1. 6. 2 项制备 50%、75%、100%、125%及 150%回收率样品，重复检测 4 次，结果见表 2。四组样品的相对效价（%）平均值分别为 44.393.93、72.742.78、128.287.01 以及 168.192.70。变异系数 CV（%）均小于 10%。表 2 抗 CD20 单抗 ADCC 生物学活性试验相对效价及回收率检测结果（n = 4） Tab 2. Potency and recovery of anti-CD20 mAb ADCC（n = 4）相对效价（%）样品回收率（%）50%样

22、品SD 44.393.93CV（%）8.85SD 88.787.85CV（%）8.8475%样品125%样品150%样品72.742.78128.287.01168.192.703.825.471.6196.993.70102.635.61112.121.803.815.471.612. 3. 4 准确性4 组回收率样品的回收率分别为 88.787.85、96.993.70、102.635.61 以 及 112.121.80，见表 2。2. 3. 5. 线性分别以四组样品的相对效价理论值与实测值进行直线回归分析，相关系数为 0. 9905，两回归线的斜率 b 之间差异无统计学意义（t = 0.

23、 033，p 0. 05），表明 两者的剂量效应曲线相同。3. 讨论近年来包括 Rituximab 在内众多重磅炸弹类药品的专利期即将结束，因此以 CD20 作为靶点的抗体生物类似药（Biosimilar）、人源化抗体、新型高亲和力抗 体突变体等一直是国内外研发的热点。目前我国也有超过 10 家单位专注于各类 抗 CD20 单抗的研制。因此如何确保众多抗 CD20 单抗药物的安全有效，是质量 控制标准化研究面临的重要任务之一。抗 CD20 单抗 ADCC 活性是其发挥生物学效应的重要因素，但目前尚无稳定 而可靠的 ADCC 活性检测方法，因此大多抗 CD20 单抗的质量控制中未进行有 效评价。

24、本文建立的抗 CD20 单抗 ADCC 生物学活性测定方法是利用经过基因 工程改造的 Jurkat 细胞系，基于荧光素酶报告基因活性检测系统测定抗 CD20 单 抗的 ADCC 生物学活性。抗 CD20 抗体经倍比稀释后，可以得到较好的 S 型剂 量效应曲线。通过试验条件的优化，选择 WIL2-S 作为靶细胞，单抗预稀释浓度 为 18000ng/ml，按照 1:5 倍进行梯度稀释；效靶比选择在 6:1；诱导时间选择 6h。方法学验证数据显示，ADCC 的试验成功必须基于特异的 CD20 阳性靶细胞、 特异性的单抗以及 FcRIIIa 阳性效应细胞，由于 EC50 值不仅取决于单抗的亲和 力还会

25、受到效靶比、诱导时间、试验用缓冲液等条件影响，导致不同试验件 EC50 值的变异度较大，因此评价 ADCC 的方法利用相对效价更加合理可信，相对效 数值越低，则说明单抗的 ADCC 生物学活性越大。该方法操作简便易行，专属性强、重复性好，准确性高，可作为抗 CD20 单 抗 ADCC 生物学活性的常规检查方法。致 谢 感谢中国食品药品检定研究院中青年发展研究基金（2012B6）对本 研究工作的支持。参考文献1. Hogarth, P.M. and Pietersz, G.A. (2012) Fc receptor-targeted therapies for the treatment of

26、inflammation, cancer and beyond. Nature Reviews Drug Discovery 11, 31131.2. Chung, S. et al. (2012) Quantitative evaluation of fucose reducing effects in a humanized antibody on Fc receptor binding and antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity activities. mAbs 4, 115.3. Parekh, B.S. et al. (2012

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