皖南医学院医学免疫学实验指导.docx

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皖南医学院医学免疫学实验指导

医学免疫学实验指导

皖南医学院微生物学免疫学教研室

2004年12月

实验室规则

实验是映证理论，对学生进行基本技能训练和培养科学研究能力的手段，为保证实验效果，同时避免病原微生物的实验室内传染，保障实验操作者的安全，特制定如下规则：

一、尽量不带个人生活、学习用品入实验室，必要的用具带入后，应放在远离操作的位置。

二、进入实验室后穿上工作衣，离室时脱下反叠带走。

在实验室内应保持安静、整洁、有秩序，不得高声谈笑，随便走动或拆卸仪器、搬弄标本。

三、实验室内严禁吸烟、进食、饮水，严禁用嘴吸移液及润湿标签，尽量不要用手触摸头面部及身体其他暴露部位。

四、如遇不慎而打破菌种管或使有菌材料污染皮肤、衣物、桌面等情况，应立即报告指导教师，切勿隐瞒或自行处理。

五、被污染过且需要回收的吸管、滴管、试管、玻片等物应用完后立即投入已准备的消毒液中，不得放在桌面上或水槽内。

六、爱护公物，节约试剂材料，不得将实验室任何物品私自带走。

如遇仪器、用品损坏，应报告指导教师并按规定予以赔偿。

七、实验完毕，整理桌面，值日生打扫室内卫生，最后离开的同学应注意关好水电、门窗，洗手后离室。

第一单元体外抗原抗体反应

实验目的

掌握体外抗原抗体反应的特点和影响因素；

掌握经典的体外抗原抗体反应的原理、方法和应用。

凝集反应

基本原理颗粒性抗原与相应抗体在一定条件下特异性结合而出现肉眼可见的凝集现象。

实验一直接凝集反应

一、玻片凝集试验

（一）血型鉴定

目的掌握玻片凝集反应的原理和应用；熟悉ABO血型的鉴定方法。

原理将已知标准抗A和抗B血型抗体分别与待测红细胞混合。

如果抗原与抗体相对应，则引起红细胞凝集，反之则不凝集，据其凝集现象可判断血型。

材料1、标准的抗A和抗B单克隆抗体（抗A为蓝色，抗B为黄色）

2、酒精棉球、采血针、生理盐水、试管、滴管、载玻片、蜡笔。

方法1、酒精棉球消毒耳垂或手指末端后，用采血针刺破皮肤，取1—2滴血放入盛有0.5ml

生理盐水的试管中，混匀制成红细胞悬液。

2、取载玻片一张，用蜡笔划分为两格，分别注明A和B，并在相应部位各加一滴标准抗A和抗B单抗。

3、用滴管取红细胞悬液于抗A、抗B单抗中各加一滴。

手持玻片，前后左右轻轻转动，促其充分混匀。

结果观察：

如混合液由均匀红色混浊状逐渐变为透明，并出现大小不等的红色凝集块者，即为红细胞凝集；如混合液仍呈均匀混浊状，则为不凝集。

如肉眼观察难于判定是否凝集，可在显微镜下用低倍镜观察予以确认。

AB

不凝集（-）凝集（+）

表1-1血型鉴定试验结果与判定

诊断血清

凝集反应

血型

抗A抗B

A

+-

B

-+

AB

++

O

--

（二）菌种鉴定在与《医学微生物学》的综合性实验中做

目的观察细菌在玻片上与其相应抗体结合所出现的细菌凝集现象，理解抗原抗体反应的特异性。

原理将已知细菌抗体与待测细菌混合，如果抗原与抗体相对应，则引起细菌凝集，反之则不凝集，据其凝集现象可判断细菌种类。

材料1、1：

20痢疾杆菌免疫血清，1：

20伤寒杆菌免疫血清。

2、痢疾杆菌培养物。

3、生理盐水、玻片、记号笔、接种环、酒精灯、消毒缸等。

方法1、取洁净玻片1张，用记号笔划分三等份，如下图所示：

2、用接种环分别取生理盐水、1：

20伤寒杆菌免疫血清、1：

20痢疾杆菌免疫血清各3-4环按图示位置放在玻片上，注意在换取另一种血清时要烧灼接种环，以免混淆血清产生错误结果。

3、用接种环挑取少量痢疾杆菌加入玻片的生理盐水中，充分混匀，再挑取少量痢疾杆菌加人1:

20伤寒免疫血清中混匀，同法挑取痢疾杆菌加入1：

20痢疾杆菌免疫血清中，混匀。

注意无菌操作。

4、轻摇动玻片，1—2分钟后观察

NS伤寒杆菌免疫血清痢疾杆菌免疫血清

+++

痢疾杆菌痢疾杆菌痢疾杆菌

结果观察

阳性：

液体变清，并有乳白色凝集块出现。

阴性：

液体仍然混浊，，无凝集块出现。

记录结果之后，将玻片放入含消毒液的指定容器内，切勿任意放置或冲洗。

-

+

（阴性）

（阳性）

注意取细菌培养物时不宜过多，与免疫血清混合时，必须将细菌涂散、涂均匀，但不宜将面积涂得过大，以免很快干涸而影响结果观察。

二、试管凝集反应——血型抗体效价滴定

在与《医学微生物学》的综合性实验中做

目的了解试管凝集反应方法；掌握凝集效价的判定及其意义。

材料1. A或B型试者血清、 生理盐水

2. A或B型红细胞悬液

3.小试管、试管架、吸管

4.37℃恒温培养箱等。

方法 取7支小试管，标1—7号。

按上表加样，将待检血清进行倍比稀释。

在第1~7管内加入红细胞悬液各0.5ml。

（注意：

加样顺序由后往前加） 充分混匀后，置37℃恒温箱30分钟后观察记录结果。

表1-2试管凝集实验方法和结果举例

试管号1234567（对照）

生理盐水（ml）0.90.50.50.50.5   0.50.5

待检血清（ml）0.10.50.50.50.50.5（弃0.5）  -

红细胞（ml）0.50.50.50.50.50.50.5

血清稀释度1:

201:

401:

801:

1601:

3201:

640-

37℃30分钟

结果判定++++++++++++++--

结果观察：

先观察生理盐水对照管（第7管），应不发生凝集，液体混浊，管底沉淀呈圆形，边缘整齐。

此沉淀物为红细胞悬液静置时因重力作用自然下沉形成。

然后自第6管开始依次观察管内液体的混浊程度及管底凝集块的大小。

血清对倍稀释方法：

用吸管将第1管的溶液连续吸吹三次，使其充分混匀后吸出0.5ml移入第2管（先反复练习吸吹方法，待掌握操作方法后再进行正式试验），同法使充分混匀后吸出0.5ml移入第3管，如此作倍比稀释至第6管，从第6管吸0.5ml弃去，第7管为不加血清对照。

【结果判定】

凝集物上清液凝集程度

全部凝集澄清++++（最强凝集）

大部份凝集基本透明+++（强凝集）

有明显凝集半透明++（中度凝集）

很少凝集基本混浊+（弱凝集）

不凝集混浊—（不凝集）

孔底凝块观察：

++++　　　　++++++—

凝集效价（血清凝集滴度）的判定：

通常以能与一定量的抗原发生肉眼可见的明显凝集（++）的血清最高稀释度为血清凝集效价。

上表所示结果，血清效价为1：

160

实验二间接凝集反应（类风湿因子检测）

原理

类风湿因子（rheumatoidfactorRF）是抗人或动物IgGFc段的抗体，是以变性IgG为靶抗原的自身抗体。

IgM型RF被认为是RF的主要类型，也是临床免疫检验中常规方法所测定的类型。

IgG吸附于聚苯乙烯胶乳颗粒上作为检测试剂，在反应介质中，待检血清中如含有RF，可与胶乳颗粒出现凝集反应。

这是检测IgM型RF的常用方法，但此方法只能定性或以滴度半定量，其灵敏度和特异性均不高，且只能检出血清中的IgM型RF。

 检测方法：

胶乳颗粒凝集试验

即一定稀释度的待检血清+Ig-胶乳颗粒1~2滴凝集与否

实验三间接凝集抑制试验------乳胶妊娠试验

原理

将待测样品中的抗原与已知抗体作用后，再与相应抗原—乳胶颗粒混合。

因没有游离抗体的存在，乳胶颗粒表面的抗原不能与抗体结合出现凝集现象，即凝集被抑制。

孕妇尿液中含HCG，用抗HCG与之结合后，再加HCG—乳胶，则不出现凝集现象。

方法

1、取玻片一张，左侧加生理盐水一滴，右侧加待检尿液一滴。

2、两侧各加抗HCG（HCG诊断血清）一滴，混匀2分钟。

3、两侧各加HCG—乳胶抗原一滴，混匀2分钟，观察结果。

结果分析

左侧对照实验：

出现均匀的凝集颗粒。

妊娠诊断试验阴性：

出现凝集现象，即凝集未被抑制，说明待检尿液中无HCG。

妊娠诊断试验阳性：

不出现凝集，即凝集被抑制，说明待检尿液中有HCG。

凝集

不凝集

（试验阴性）

（试验阳性）

沉淀反应

基本原理

可溶性抗原与相应抗体在一定条件下特异性结合形成肉眼可见的沉淀物或沉淀线。

实验四凝胶沉淀反应

一、单相琼脂扩散试验

原理

一种定量试验，将一定量的抗体混合于琼脂内，倾注于玻片上，凝固后，在琼脂层上打孔，再将抗原加入孔中，使其向四周扩散。

抗原抗体复合物形成的沉淀环直径与抗原的浓度成正比。

如事先用不同浓度的标准抗原制成标准曲线，则未知标本中的抗原含量即可从标准曲线中求出。

本试验主要用于检查标本中各种免疫球蛋白和血清IgG含量。

材料

１．抗体：

羊抗人IgG单价抗血清。

２．抗原：

待检血清。

３．３％生理盐水琼脂、生理盐水、载玻片、直径３mm打孔器、小三角烧瓶、毛细滴管、湿盒。

方法

1、制备含抗体的琼脂板

取羊抗人IgG单价抗血清一瓶（效价1：

80），量取0.3ml于一小三角烧瓶中，加生理盐水11.7ml（40倍稀释混匀，置56℃水浴中恒温2~3分钟）。

取3%生理盐水琼脂一管，隔水加热使溶，然后置56℃水浴中，待琼脂温度降至56℃时，立即加入等量1：

40稀释抗血清，迅速轻轻混匀，勿使产生气泡，迅速倾入载玻片上，每片3.5ml，待凝固后打孔。

如下图所示。

2、稀释待检血清

将待检血清用生理盐水作40倍稀释，

3、打孔、加样

每份检样加两孔，加满（但不要溢出），加样时毛细滴管尖端不要划破琼脂。

4、温育

将琼脂板置搪瓷盒，垫湿纱布或海绵以防干燥，37℃恒温箱24h。

结果观察与分析

测量并求出每份检样两孔的沉淀环平均直径，按照标准曲线求出IgG含量。

标准抗原

待检抗原

沉淀环直径（mm）

7

5

3

501005001000

标准抗原浓度（mg/100ml）

标准曲线图

二、双向琼脂扩散试验

原理

常用于定性检测，也可用于半定量检测。

将抗原与抗体分别加入琼脂凝胶板上相邻近的小孔内，让它们相互向对方扩散。

当两者在最适当比例处相遇时，即形成一条清晰的沉淀线。

根据有否出现沉淀线，可用已知的抗体鉴定未知的抗原，或用已知的抗原鉴定未知的抗体。

临床常用本方法检查原发性肝癌患者血清中的甲胎蛋白，作为原发性肝癌的早期辅助诊断。

甲种胎儿蛋白（α-Fetalprotein,AFP），是胎儿组织及体液中的正常组织成份。

胎儿在第9周才出现此种蛋白，13~19周达高峰，到21周后逐渐下降，胎儿出生后该蛋白即行消失或含量甚微，普通试验方法检查不出，而肝癌病人及个别卵巢癌或睾丸癌病人的血清检出有此种蛋白。

材料

1．抗AFP血清、已知肝癌病人AFP阳性血清、待检病人血清。

2．1.2%琼脂（用生理盐水配成）。

3．载玻片、毛细吸管、湿盒。

方法

1．制备琼脂玻片将已知加热溶化的1.2%琼脂3.5ml，迅速倾入载玻片上。

2．打孔待凝固后用打孔器按下图样打孔。

（孔径3mm，孔距4mm）

2、3、5孔待检血清为AFP阳性

3．加样

以上方孔为第1孔，按顺时针方向分别称为2、3、4、5和6孔，中央孔为7孔。

7孔加入抗AFP血清，1、4孔加入已知AFP阳性血清（或AFP），作为阳性对照孔；6孔加入已知AFP阴性血清，作为阴性对照孔，其余2、3、5孔为试验孔，加入待检血清。

4．温育置湿盒室温或37℃温育12-24h。

结果观察

1、4孔与7孔间应出现白色沉淀线（如上左图1与7，4与7），6与7孔间应不出现白色沉淀线。

若2、3、5孔与7孔间出现白色沉淀线而且与阳性对照沉淀线吻合者如图中2、3、5与1、4孔间，即为实验阳性，表明待检血清中含有AFP（即AFP阳性）。

如出现与阳性对照相连接，且呈枪刺状如上右图中4与5孔间，说明二者间有共同抗原成分；如出现成交叉的沉淀线如上右图3与4，则是非特异性沉淀反应，为假阳性反应，乃判为实验阴性，表明待检血清为AFP阴性。

三、对流免疫电泳

原理在一定条件下，胶体颗粒是带有电荷的，这些带电胶体颗粒在电的影响下发生移动。

如胶体颗粒带负电，则移向阳极；反之，移向阴极。

这种现象称为电泳。

对流免疫电泳是将病人血清（待检抗原）放在琼脂板阴极端孔内，已知抗血清（含有已知抗体）放于阳极端孔内，在碱性环境条件下同时进行电泳，抗原由阴极向阳极移动快，而抗体系丙种球蛋白，等电点在pH6~7之间，故带负电荷少，移动速度慢，由于电渗作用结果向阴极倒退，于是抗原抗体在电场中相遇，当两者比例适当时，则特异性抗原抗体互相结合，便形成肉眼可见的白色沉淀线。

材料

1．1%，PH8.6，0.075M巴比妥缓冲液。

2．抗AFP血清，已知AFP阳性血清，待检病人血清。

3．玻片、吸管、打孔器、毛细滴管、电泳仪等。

方法

1．将用缓冲液配制好的1.2%琼脂隔水加热溶化，趁热吸取3.5ml加于玻片上，冷凝后打孔，孔直径3毫米，二孔间距离3毫米。

2．分别从上至下向左列1、3、5孔内加入抗AFP血清；向右列2孔内加待检病人血清，4孔内加已知AFP阳性血清作为阳性对照，6孔内加已知阴性对照血清。

各孔加满为度，勿使外溢，

3．将琼脂板置于电泳槽内，抗原端入阴极侧，抗体放阳极侧，二端贴上浸透电泳缓冲液的4层纱布条。

4．通电，固定电压5-6伏/厘米长，通电45~60分钟左右。

结果观察

电泳毕，关闭电源，取出琼脂板。

在黑色背景上方，透过散射光线，首先观察3与4孔间（阳性对照组）、5与6孔间（阴性对照组）的白色沉淀线是否出现；再看试验孔，如孔间未出现这样的沉淀线，则该待检血清为AFP阴性血清。

Ab+11-Ag

四、火箭免疫电泳

原理：

火箭免疫电泳是将电泳与单向扩散结合的一种免疫技术。

将抗体溶入琼脂后制板，在琼脂板的一侧打孔，加入待检样品及不同浓度的标准抗原。

电泳时抗原在含定量抗体的琼脂中向正极移动，并形成浓度梯度，在适宜的部位形成火箭状的沉淀峰。

沉淀峰的高度与抗原的含量成正比，故可定量测定抗原。

方法：

1、制备琼脂板

将抗体血清按一定比例与溶化好的1.5%琼脂在56℃水浴中混匀，迅速浇注成2毫米厚的琼脂板。

2、打孔

3、加样：

分别加入已知浓度的标准抗原溶液和待测抗原，每孔10微升。

4、电泳：

将琼脂板放入电泳槽，抗原放阴极侧，抗体放阳极侧，两端贴上浸透电泳缓冲液的4层纱布条。

固定电压5~6伏/厘米长，通电时间为45~60分钟左右，观察结果。

Ag-+

免疫标记技术

实验目的

1、熟悉酶免疫技术基本原理和方法、免疫荧光技术的基本原理。

2、了解酶联免疫吸附实验（间接法）的基本过程及其作用。

实验用品

1、材料、试剂：

待测人血清、ACA阳性、阴性参考血清、显色A液、B液、PBS洗涤液、酶结合物（HRP-SPA）、终止液。

2、器具：

吸管、滴管、试管、48孔聚苯乙烯反应板、50μl微量移液器、恒温箱（370C）、荧光显微镜。

内容和方法

免疫标记技术是一种用某些物质（如酶、荧光素、放射性同位素等）对抗体或抗原进行标记（这种标记不致影响抗原抗体之间的特异结合），然后再通过检测标记物来观察抗原抗体反应的实验方法。

它的突出优点是可以大大提高实验的敏感性，它还可以对组织标本中的抗原或抗体进行定位鉴定，也可以对样品中的抗原或抗体进行定量测定。

按标记物种类的不同，下面分别对免疫酶技术和免疫荧光技术进行简要的介绍。

实验五免疫酶技术

1、原理

免疫酶技术是将抗原抗体反应的特异性与酶的高效催化作用有机结合的一种方法。

它以

酶作为标记物，与抗体或抗原联结，与相应的抗原或抗体作用后，通过底物的颜色反应作抗原抗体的定性和定量，亦可用于组织中抗原或抗体的定位研究，即酶免疫组织化学技术。

目前应用最多的免疫酶技术是酶联免疫吸附实验（ELISA），它是使抗原或抗体吸附于固相载体，使随后进行的抗原抗体反应均在载体表面进行，从而简化了分离步骤，提高了灵敏度，即可检测抗原，也可检测抗体。

实验方法包括间接法、夹心法及竞争法。

为了检测抗原可用夹心法。

将特异性抗体吸附在固相载体（聚苯乙烯制成的小管、小盘或小孔）上，然后加被测溶液，倘样品中有相应抗原，则与抗体在载体表面形成复合物。

洗涤后加入酶标记的特异性抗体，后者通过抗原也结合到载体的表面。

洗去过剩的标记抗体，加入酶的底物，在一定时间内经酶催化产生的有色产物的量与溶液中抗原含量成正比，可用肉眼观察或分光光度计测定。

为了检测抗体可用间接法。

使抗原吸附于载体上，然后加入被测血清，如有抗体，则与抗原在载体上形成复合物。

洗涤后加酶标记的抗球蛋白（抗抗体）与之反应。

洗涤后加底物显色，有色产物的量与抗体的量成正比。

（见图5-1）

常用的酶有辣根过氧化物酶（HRP）和碱性磷酸酶（AP），相应的底物分别是邻苯二胺（OPD）和对硝基苯磷酸盐，前者呈色反应为棕黄色，后者为蓝色。

可用目测定性，也可用酶标仪测定光密度（OD）值以反映抗原含量。

E+底物显色

▲▲▲▲▲

图5-1

2、方法——间接法测人ACA

ACA（抗心磷脂抗体）主要通过抑制血管内皮细胞合成PGI2，干扰血栓调节素、纤溶酶原激活剂和蛋白质C系统的活性，抑制抗凝血酶III的活化等而致凝血前高凝状态，与复发性动静脉血栓形成、反复自然流产及血小板减少症关系密切。

其主要程序为用纯心磷脂的无水乙醇溶液包被聚苯乙烯板，封闭后分别于标本孔和对照孔中加入一定稀释度的被检血清及阳性与阴性对照血清，之后加入酶标二抗和酶底物，终止反应后肉眼观察结果或测吸光度（A）值。

具体步骤如下（图5-2）：

预步骤：

先用一定浓度的心磷脂溶液包被聚苯乙烯板的小孔，4℃冰箱过夜，次日取出甩尽液体备用。

（1）用微量移液器分别加待检血清、阳性对照、阴性对照各100μl于1、2、3孔中，370C水浴箱温育30min。

（2）用PBS液洗板3次，每次3min，甩干。

（3）每孔加入酶结合物2滴，370C水浴箱温育30min。

（4）用PBS液洗板3次，每次3min，甩干

（5）每孔分别加入显色A液、B液各1滴，混匀。

370C水浴箱温育5-10min。

（6）取出肉眼观察结果。

如待检血清溶液与阳性对照一致均为蓝色，表明待检血清为ACA+血清。

1234

图5-2酶联免疫吸附实验——间接法（测抗体）

1、将抗原吸附于固相载体—AC；

2、洗涤，加被测血清（抗体）—ACA；

3、洗涤，加酶标抗球蛋白（抗抗体）/酶标SPA—SPA-HRP；

4、洗涤，加酶的底物，经酶的催化产生有色产物。

实验六免疫荧光技术

免疫荧光技术，亦称为荧光抗体法，其基本原理是将荧光色素与抗体联接，成为荧光抗

体，用荧光抗体浸染组织或细胞抗原，结合了荧光抗体的组织或细胞在荧光显微镜下发出可见荧光，从而达到抗原或抗体检出及定性的目的。

常用的荧光素为异硫氰酸荧光素（FITC）和罗丹明（RB200），前者在荧光显微镜下发绿色荧光，后者发橙红色荧光。

免疫荧光技术中常用的方法有直接法和间接法两种。

直接法是用荧光抗体直接与被检抗原直接作用，借以鉴定未知抗原（图5-3）；间接法是先用未标记的抗体与抗原作用，冲洗后，再用荧光素标记的抗球蛋白抗体染色。

如果被染上荧光素即表明所试的抗原抗体是对应的。

一、直接法——病原微生物的快速检测

图5-3荧光抗体技术——直接法

免疫荧光技术可用于病原微生物（如痢疾杆菌等）的快速检查，组织切片或培养物中有关抗原、抗体的检查，一些免疫性疾病（如红斑狼疮）的诊断和研究。

二、间接法——（略）

第二单元免疫细胞的检测

采用体外或体内试验对机体各种参与免疫应答的细胞进行鉴定、计数和功能测定，籍以了解机体的免疫状态，并对某些临床疾病的诊断、预后判断及疗效观察等有一定意义。

在长期的科学研究工作中形成的免疫细胞检测技术主要包括两个部分，即对免疫细胞表面蛋白分子的检测和对各类免疫细胞功能的测定。

此外，从实验研究需要出发，也建立起了许多分离细胞的技术。

免疫细胞表面蛋白分子的检测，是对免疫细胞分类、定量的重要依据。

目前的检测技术主要依靠以抗原抗体特异结合原理为基础的膜抗原识别检测，如荧光抗体技术、酶标抗体技术以及补体依赖的细胞毒试验等。

对一些特殊的膜蛋白也可用特殊的配体结合法来加以检测，例如花环形成试验等。

各类免疫细胞的功能检测试验中包括了淋巴细胞转化试验、特异性与非特异性的细胞毒试验、抗体形成细胞的检测试验以及细胞吞噬能力和胞内杀伤能力的功能检测。

由于这些试验都需要以特定细胞群体为试验对象，因此，随之派生了许多细胞分离方法，常见的有密度梯度离心分离技术、尼龙毛分离技术等。

本单元实验介绍了一些较经典的免疫细胞检测试验供同学们对这一检测技术有一个全面的了解，并希望由此达到下列教学要求：

1．掌握免疫细胞的各种分离技术的原理。

2．掌握免疫细胞表面蛋白检测的主要技术类型及原理。

3．熟悉免疫细胞功能检测的类型方法和原理。

4．了解免疫细胞功能检测方法的应用。

实验七中性粒细胞吞噬功能试验（小吞噬试验）

实验目的

1.熟悉中性粒细胞的吞噬作用原理和方法。

2.通过本实验理解机体的非特异性免疫机制。

实验原理

血液中的中性粒细胞即小吞噬细胞，通过趋化、调理、吞入和杀菌等几个步骤，能吞噬和消化衰老、死亡细胞及病原微生物等异物，是机体非特异性免疫的重要组成部分。

实验材料

1.葡萄球菌18h孵育的斜面或肉汤培养物。

2.抗凝人血（3.8%枸橼酸钠一滴加于无菌小试管中）、瑞氏染液、双蒸水

3.试管、玻片、采血针、酒精棉球、吸管、滴管、显微镜、香柏油

实验方法

1.取小试管一支，用滴管加入一滴3.8%枸橼酸钠溶液。

2.用酒精棉球消毒手指和采血针，从消毒部位采取2～3滴血加入试管中。

3.取一滴菌液加入小试管中，用吸管混匀。

4.置37℃水浴箱水浴15分钟，中途混匀一次。

5.取出小试管，用吸管将试管中血液打匀后取血半滴于载玻片上，用另一载玻片推成薄血片。

6.待血片自干后，用瑞氏染液染色。

瑞氏染色法：

取瑞氏染液数滴滴于上述血片上先染1分钟。

然后加等量蒸馏水，

轻轻晃动混匀，继续染5分钟，水洗，用吸水纸吸干后镜检。

结果观察

油镜检查：

寻找中性粒细胞，如果染色结果正确，可见细胞核及被吞噬的细菌染成紫色，而粒细胞的细胞浆则为淡红色。

见下图。

中性粒细胞吞噬试验

计数：

1.吞噬百分率：

观察100个中性粒细胞，计算其中吞噬有细菌的中性粒细胞数，计算出吞噬细胞百分率。

2.吞噬指数：

观察100个中性粒细胞，计算其中被吞噬的细菌总数，平均每个中性粒细胞吞噬的细菌数即为吞噬指数。

吞噬指数=

实验八E花环形成试验

实验目的

1.掌握T淋巴细胞E花环试验的原理、正常值，了解其方法和用途。

2.熟悉光镜下E花环的形态和计数方法。

实验原理

T细胞表面具有能与绵羊红细胞（SRBC）表面糖肽结合的受体，称为E受体（CD2）。

已证实E受体是人类T细胞所特有的表面标志。

当T细胞与SRBC混合后，SRBC便粘附于T细胞表面，呈现花环状。

通过花环形成检查T细胞的方法，称为E花环形成试验。

根据花环形成的多少，可测知T细