酶工程电子教案.docx
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酶工程电子教案
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第二章酶工程基础（8学时）
教学目标
掌握酶工程的基础，即酶学的研究内容，为酶工程的研究奠定基础。
教学重点
酶促反应动力学；酶的分类命名。
教学难点
酶抑制剂；酶催化作用机制。
教学方法及内容
自学结合教师讲授；围绕重难点内容安排了3次实验课。
自学的内容：
影响酶活性的因素；酶促反应的数学推导公式。
一、酶化学本质（组成和结构特点）
酶分为单纯酶和结合酶（全酶）。
全酶为酶蛋白加上辅因子。
单体酶（monomericenzyme）一般一天肽链组成，分子量35KDa以，不含四级结构，催化水解反应。
如牛胰核糖核酸酶（124氨基酸组成）。
胰凝乳蛋白酶由三条肽链组成（A、B两链及B、C两链间通过二硫键形成共价整体，共241个氨基酸残疾组成）。
寡聚酶（oligomericenzyme）：
由几个或多个亚基组成，亚基间以非共价键连接，单个亚基没有催化活性。
亚基之间以非共价键结合，易于分开。
如苹果酸脱氢酶；醇脱氢酶；1，6-二磷酸果糖酶；谷氨酸脱氢酶。
含有相同亚基的寡聚酶中，有的是多催化部位酶；相当数量含有相同亚基的寡聚酶是调节酶。
多酶复合物（multienzymesystem）：
几个酶共价键连接而成的复合物。
这些酶催化将底物转化为产物的一系列顺序反应。
如大肠杆菌色氨酸合成酶复合体；大肠杆菌丙酮酸脱氢酶复合体。
二、酶作为催化剂的显著特点
催化能力（效率高）；专一性；调节性；不稳定性
催化能力（效率高）：
（催化转换数：
每个酶分子每分钟催化底物转化的分子数。
）一般为103min-1，碳酸酐酶最高为3.6*107min-1；有酶加入比无酶参加反应速度一般要高107-1013。
每个碳酸酐酶（红细胞、肺泡细胞、肾小管细胞）分子1s内可以催化6×105个CO2水合，比非催化反应高107倍。
20℃脲酶（尿素酶）的催化常数为3×104s-1，比非催化反应大1014倍。
一餐饭在37℃下的消化，无催化剂时需要50年，消化酶消化3-4小时。
无催化剂时活化能为75.5kJ/mol；液态钯催化时活化能为48.9kJ/mol；过氧化氢酶催化时为8.4kJ/mol。
无催化剂时活化能为1339.8kJ/mol；H+（酸）催化时活化能为104.7kJ/mol；蔗糖酶催化时为39.4kJ/mol。
专一性（specificity）
酶的专一性：
也称为酶的特异性，它是指酶对所作用底物（substrate）的选择性。
根据酶对底物的选择方式不同，酶的专一性分为：
绝对专一性和相对专一性。
绝对专一性（absolutespecificity）：
指一种酶只选择一种底物作用，如脲酶。
相对专一性（relativespecificity）：
指一种酶选择一类底物作用。
根据酶选择的对象不同又分为：
键专一性（bondspecificity）：
指酶对所作用键的选择性，如脂肪酶。
基团专一性（族专一性,groupspeicificity）：
指酶对所作用的键及键一侧的基团的选择性，如α-D-葡萄糖苷酶，胰蛋白酶。
天然葡萄糖为D型（D/L型一般取决于非羰基端第二个C的手性结构），α/β是指通过半缩醛形成六元环的结构时羟基的相对位置。
如果是葡萄糖溶液的话α/β构象是混合在一起的。
胰蛋白酶选择性的水解含有赖氨酸或精氨酸的羰基的键,所以,凡是含有赖氨酸或精氨酸的物质,不管是酰胺、酯或多肽、蛋白质都能该酶迅速水解。
三、酶的分类和命名
1961年国际酶学委员会（EnzymeCommittee,EC）根据酶所催化的反应类型和机理，把酶分成6大类。
（1）氧化还原酶（Oxidoreductase）：
氧化-还原酶催化氧化-还原反应。
主要包括脱氢酶（dehydrogenase）和氧化酶（Oxidase）。
如乳酸（Lactate）脱氢酶催化乳酸的脱氢反应。
（2）转移酶（Transferase）：
转移酶催化基团转移反应，即将一个底物分子的基团或原子转移到另一个底物的分子上。
例如，谷丙转氨酶催化的氨基转移反应。
（3）水解酶（hydrolase）：
水解酶催化底物的加水分解反应。
主要包括淀粉酶、蛋白酶、核酸酶及脂酶等。
如，脂肪酶（Lipase）催化的脂的水解反应。
（4）裂合酶（Lyase）：
裂合酶催化从底物分子中移去一个基团或原子形成双键的反应及其逆反应。
主要包括醛缩酶、水化酶及脱氨酶等。
例如，延胡索酸水合酶催化的反应。
（5）异构酶（Isomerase）：
异构酶催化各种同分异构体的相互转化，即底物分子内基团或原子的重排过程。
例如，6-磷酸葡萄糖异构酶催化的反应。
（6）合成酶（LigaseorSynthetase）：
合成酶，又称为连接酶，能够催化C-C、C-O、C-N以及C-S键的形成反应。
这类反应必须与ATP分解反应相互偶联。
A+B+ATP+H-O-H===AB+ADP+Pi
例如，丙酮酸羧化酶催化的反应。
丙酮酸+CO2草酰乙酸
酶的命名有两种方法：
系统名、惯用名。
系统名：
包括所有底物的名称和反应类型。
惯用名：
只取一个较重要的底物名称和反应类型。
乳酸脱氢酶EC1.1.1.27
精氨酸酶是产尿素生物体（尿素代谢）肝脏中的水解酶。
它催化反应：
这个酶的标准EC名称为L-精氨酸-脒基水解酶，它催化在C-N之间加入水分子而导致脒基（方程式中的圈内部分）从精氨酸上裂解下来的反应。
在这个反应中，它断裂了一个非肽键C-N，所以，精氨酸酶的第二个EC编号的数字为5，其完整EC编号为EC3.5.3.1
各大类酶用于生物催化的比例怎样，利用率情况怎样？
各大类酶用于生物催化的概况
类别
占总酶比例%
利用率%
水解酶hydrolases
26
65
氧化还原酶oxidoreductases
27
25
转移酶transferases
24
5
裂合酶lyases
12
~5
异构酶isomerases
5
~1
连接酶ligases
6
~1
四、酶催化作用的机制
锁和钥匙模型（LockandkeyHypothesis）
1890年EmilFischerasagreatorganicchemistledtothenotionofanenzymeresemblinga“lock”anditsparticularsubstratethe“key”.
此学说很好地解释了酶的立体异构专一性，但不能解释酶的活性中心既适合于可逆反应的底物，又适合于产物，也不能解释酶专一性中的所有现象。
诱导锲合模型（InducedfitHypothesis）
1958年D.E.Koshland提出：
酶分子活性中心的结构原来并非和底物的结构互相吻合，但酶的活性中心是柔性的而非刚性的。
当底物与酶相遇时，可诱导酶活性中心的构象发生相应的变化，其上有关的各个基团达到正确的排列和定向，因而使底物和酶能完全契合。
当反应结束产物从酶分子上脱落下来后，酶的活性中心又恢复成原来的构象。
中间产物学说
酶与底物通过形成中间产物使反应沿一个低活化能的途径进行。
底物S与酶结合形成中间产物ES；S与E的结合导致分子中某些化学键发生变化，呈不稳定状态，亦即活化态，使反应活化能降低；复合物ES转变成酶与产物的复合物EP；EP裂解，生成产物
以上是酶催化专一性的机制；下面的是酶催化高效性的机制——
酸碱催化
酶活性部位上的某些基团可以作为质子供体（或质子受体）对底物进行酸或碱催化——酸碱催化。
在酶的活性中心上，有些基团是质子供体（酸催化基团），可以向底物分子提供质子，称为酸催化；有些催化基团是质子受体（碱催化基团），可以从底物分子上接受质子，称为碱催化。
有时，酶活性部位上有几个基团分别作为质子的供体和受体，同时进行酸碱催化——酸碱共同催化，如His的咪唑基；在中性条件下，有一半是酸形式、一半是碱形式。
因此既可进行酸催化，又可进行碱催化。
所以咪唑基是酶分子最有效、最活泼的一个功能基团。
共价催化
某些酶在催化反应时，本身能放出或吸取电子并作用于底物的缺电子或负电子中心，并与底物形成共价连结的共价中间物，使反应活化能大大降低。
按照酶对底物所攻击的基团的不同，该催化方式又分为亲核催化（nucleophiliccatalysis）和亲电子催化（cetecrophiliccatalysis）。
前者是指酶攻击底物的基团是富电子的，这些基团首先攻击底物的亲电子基团（亦称缺电子基团）而形成酶—底物的共价复合物。
反之，酶的缺电子基团攻击底物分子上富电子基团而形成酶—底物共价中间产物。
在酶的共价催化中，亲核催化较为常见。
【例题】羧肽酶A（EC3.4.17.1）是一个含307个氨基酸残基的单一多肽链组成的胰消化酶。
它催化多肽链C端氨基酸残基的断裂。
更重要的是，在其催化过程中，它的活性位点有一个Zn2+。
它的活性位点和催化序列的氨基酸侧链如下：
问：
羧肽酶属于哪一类酶？
Zn2+在催化机制中起到什么基本作用？
催化属于哪一类型？
用文字描述上图中的系列反应。
Zn2+作为亲电体在酶的Glu270的γ羧基与羰基氧之间酯键的形成之前将羰基氧进一步极化。
这个酯键为共价键，所以这个反应是共价催化的例子。
A、肽链底物与酶的活性位点结合；酶的活性位点包括Arg145、Zn2+和含有芳香族和脂肪族氨基酸侧链的疏水袋。
B、Glu270对肽键的亲核性攻击伴随着Glu270从Tyr248吸收一个H+。
C、肽键的断裂和C端游离氨基酸的脱离。
D、通过水分子对Glu270的酸酐键的亲核性攻击，使共价结合肽链释放，从而使自由酶再生，这个过程伴随Tyr248的重新质子化。
邻近效应和定向效应
对于双分子反应，底物结合到酶的活性中心好象：
两个底物分子相邻近，大大提高了底物的有效浓度——邻近效应；底物分子还在活性中心“定向”排布，有利于原子轨道的重叠——轨道定向，使分子间反应近似于分子内反应。
“张力”和“形变”
活性中心是低介电区
某些酶的活性中心穴内是非极性的，这种低介电环境甚至还可能排除水分子。
这样，底物分子的敏感键和酶的催化基团之间就会有很大的反应力，加速反应的进行。
酶活性中心多半靠近位于疏水微环境地凹陷中，疏水环境中介电常数较低，故在疏水环境中两个带电物（底物、酶中心）之间的作用力显著增加，从而使反应速度加快。
五、酶促反应动力学
酶促反应动力学（kineticsofenzyme-catalyzedreactions）是研究酶促反应速度及其影响因素的科学。
酶促反应的影响因素主要包括酶的浓度、底物的浓度、pH、温度、抑制剂和激活剂等。
底物浓度对反应速度的影响
（1）单底物的酶促反应动力学
1902年，Henri用蔗糖酶水解蔗糖的实验中观察到：
在蔗糖酶的浓度一定的条件下测定底物（蔗糖）浓度对酶反应速度的影响,它们之间的关系呈现矩形双曲线（rectangularhyperbola）。
如下图所示：
为解释酶被底物饱和现象，1913年Michaelis和Menten做了大量的定量研究，积累了足够的实验数据，提出了酶促反应的动力学方程：
Vmax指该酶促反应的最大速度，[S]为底物浓度，Km是米氏常数，V是在某一底物浓度时相应的反应速度。
从米氏方程可知：
当底物浓度很低时[S]<当底物浓度很高时，[S]>>Km，此时V≌Vmax，反应速度达最大速度，底物浓度再增高也不影响反应速度。
米氏常数的意义
（1）物理意义：
Km值等于酶反应速度为最大速度一半时的底物浓度。
（2）Km值愈大，酶与底物的亲和力愈小；Km值愈小，酶与底物亲和力愈大。
酶与底物亲和力大，表示不需要很高的底物浓度，便可容易地达到最大反应速度。
（3）Km值是酶的特征性常数，只与酶的性质，酶所催化的底物和酶促反应条件（如温度、pH、有无抑制剂等）有关，与酶的浓度无关。
酶的种类不同，Km值不同，同一种酶与不同底物作用时，Km值也不同。
各种酶的Km值范围很广，大致在10-3～102M之间。
酶浓度的影响
在一定温度和pH下，酶促反应在底物浓度大大超过酶浓度时，速度与酶的浓度呈正比。
酶浓度对速度的影响机理：
酶浓度增加，[ES]也增加，而V0=k3[ES]，故反应速度增加。
温度对酶促反应速度的影响
酶促反应与其它化学反应一样，随温度的增加，反应速度加快。
化学反应中温度每增加10℃反应速度增加的倍数称为温度系数Q10。
一般的化学反应的Q10为2～3，而酶促反应的Q10为1～2。
在一定范围内，反应速度达到最大时对应的温度称为该酶促反应的最适温度（optimumtemperatureTm）.一般动物组织中的酶其最适温度为35～40℃，植物与微生物中的酶其最适温度为30～60℃，少数酶可达60℃以上，如细菌淀粉水解酶的最适温度90℃以上。
温度对酶促反应速度的影响机理：
1.温度影响反应体系中的活化分子数：
温度增加，活化分子数增加，反应速度增加。
2.温度影响酶的活性：
过高的温度使酶变性失活，反应速度下降。
最适温度不是酶的特征常数，因为一种酶的最适温度不是一成不变的，它要受到酶的纯度、底物、激活剂、抑制剂、酶反应时间等因素的影响。
因此，酶的最适温度与其它反应条件有关。
pH对酶促反应速度的影响
大多数酶的活性受pH影响显著，在某一pH下表现最大活力，高于或低于此pH，酶活力显著下降。
酶表现最大活力的pH称为酶的最适pH。
典型的酶速度-pH曲线是较窄的钟罩型曲线，但有的酶的速度-pH曲线并非一定呈钟罩型。
如胃蛋白酶和木瓜蛋白酶的速度-pH曲线。
胃蛋白酶的速度-pH曲线如下图：
pH对酶促反应速度的影响机理：
1、pH影响酶和底物的解离:
酶的活性基团的解离受pH影响，底物有的也能解离，其解离状态也受pH的影响，在某一反应pH下，二者的解离状态最有利于它们的结合，酶促反应表现出最大活力，此pH称为酶的最适pH；当反应pH偏离最适pH时，酶促反应速度显著下降。
2、pH影响酶分子的构象：
过高或过低pH都会影响酶分子活性中心的构象，或引起酶的变性失活。
动物体内多数酶的最适pH值接近中性，但也有例外，如胃蛋白酶的最适pH约1.8，肝精氨酸酶最适pH约为9.8（见下表）。
激活剂对酶反应速度的影响
能使酶活性提高或使酶的催化活性显示出来的物质，都称为激活剂（activator），其中大部分是离子或简单的有机化合物。
如Mg2+是多种激酶和合成酶的激活剂，动物唾液中的α-淀粉酶则受Cl-的激活。
通常，酶对激活剂有一定的选择性，且有一定的浓度要求，一种酶的激活剂对另一种酶来说可能是抑制剂，当激活剂的浓度超过一定的范围时，它就成为抑制剂。
抑制剂对反应速度的影响
凡能使酶的活性下降或者丧失而不引起酶蛋白变性的物质称为酶的抑制剂（inhibitor）。
使酶变性失活（称为酶的钝化）的因素如强酸、强碱等，不属于抑制剂。
通常抑制作用分为可逆性抑制和不可逆性抑制两类。
例如，银（Ag+）、汞（Hg2+）、铅（Pb2+）等重金属离子对许多酶均有抑制作用，抗坏血酸（Vit.C）抑制蔗糖酶的活性，胰蛋白酶抑制剂抑制胰蛋白酶的活性等等。
有些酶抑制剂是一类有重要应用价值的药物，例如，胰蛋白酶抑制剂治疗胰腺炎，胆碱酯酶抑制剂治疗血管疾病等。
六、酶抑制作用的概念和分类
抑制作用是指在酶不变性的情况下，由于必需基团或活性中心化学性质的改变而引起的酶活性的降低或丧失。
抑制剂与酶的必需基团以共价键结合而引起酶活性丧失，不能用透析，超滤或凝胶过滤等物理方法去除抑制剂而使酶复活者，称为不可逆抑制作用。
抑制剂与酶以非共价键结合而引起酶活性的降低或丧失，能用物理的方法除去抑制剂而使酶复活者称为可逆抑制作用。
6.1竞争性抑制作用
抑制剂I和底物S对游离酶E的结合有竞争作用，互相排斥，已结合底物的ES复合体，不能再结合I。
同样已结合抑制剂的EI复合体，不能再结合S。
特点：
①抑制剂I与底物S在化学结构上相似，能与底物S竞争酶E分子活性中心的结合基团。
例如，丙二酸、苹果酸及草酰乙酸皆和琥珀酸的结构相似，是琥珀酸脱氢酶的竞争性抑制剂。
②抑制程度取决于抑制剂与底物的浓度比、〔ES〕和〔EI〕的相对稳定性；
③加大底物浓度，可使抑制作用减弱甚至消除。
竞争性抑制剂双倒数曲线，如下图所示：
有竞争性抑制剂存在的曲线与无抑制剂的曲线相交于纵坐标I/Vmax处，但横坐标的截距，因竞争性抑制存在变小，说明该抑制作用，并不影响酶促反应的最大速度Vmax，而使Km值变大。
竞争性抑制作用的机理：
抑制剂与底物在结构上有类似之处；可能结合在底物所结合的位点（如结合基团）上，从而阻断了底物和酶的结合；降低酶和底物的亲和力。
很多药物都是酶的竞争性抑制剂。
例如磺胺药与对氨基苯甲酸具有类似的结构，而对氨基苯甲酸、二氢喋呤及谷氨酸是某些细菌合成二氢叶酸的原料，后者能转变为四氢叶酸，它是细菌合成核酸不可缺少的辅酶。
由于磺胺药是二氢叶酸合成酶的竞争性抑制剂，进而减少细菌体内四氢叶酸的合成，使核酸合成障碍，导致细菌死亡。
抗菌增效剂-甲氧苄氨嘧啶（TMP）能特异地抑制细菌的二氢叶酸还原为四氢叶酸，故能增强磺胺药的作用。
6.2非竞争性抑制作用
抑制剂I和底物S与酶E的结合完全互不相关，既不排斥，也不促进结合，抑制剂I可以和酶E结合生成EI，也可以和ES复合物结合生成ESI。
底物S和酶E结合成ES后，仍可与I结合生成ESI，但一旦形成ESI复合物，再不能释放形成产物P。
特点：
①I和S在结构上一般无相似之处，I常与酶分子上结合基团以外的化学基团结合，这种结合并不影响底物和酶的结合，增加底物浓度并不能减少I对酶的抑制。
②非竞争性抑制剂的双倒数曲线：
有非竞争性抑制剂存在的曲线与无抑制剂的曲线相交于横坐标-1/Km处，但纵坐标的截距，因竞争性抑制存在变大，说明该抑制作用，并不影响酶促反应的Km值，而使Vmax值变小，如下图所示：
6.3反竞争性抑制作用
反竞争性抑制剂必须在酶结合了底物之后才能与酶与底物的中间产物结合，该抑制剂与单独的酶不结合。
反竞争性抑制剂存在下，Km、Vmax都变小。
反竞争性抑制举例：
单底物酶：
如芳香基硫酸基的肼解；氰化物抑制芳香硫酸酯酶的作用。
多底物：
如双底物乒乓机制中，任何一个底物的竞争性抑制剂也是另一底物的反竞争性抑制剂。
七、不可逆性抑制作用（irreversibleinhibition）
不可逆性抑制作用的抑制剂，通常以共价键方式与酶的必需基团进行不可逆结合而使酶丧失活性。
常见的不可逆抑制剂如下图所示。
按其作用特点，又分专一性及非专一性两种。
7.1非专一性的不可逆抑制作用
概念：
抑制剂能和酶上的一类或几类基团反应。
类型：
：
酰化剂、烃基化剂、含活泼双键的试剂、亲电试剂、氧化剂、还原剂
抑制剂与酶分子中一类或几类基团作用，不论是必需基团与否，皆可共价结合，由于其中必需基团也被抑制剂结合，从而导致酶的抑制失活。
某些重金属（Pb++、Cu++、Hg++）及对氯汞苯甲酸等，能与酶分子的巯基进行不可逆适合，许多以巯基作为必需基团的酶（通称巯基酶），会因此而遭受抑制，属于此种类型。
用二巯基丙醇（britishantilewisite,BAL）或二巯基丁二酸钠等含巯基的化合物可使酶复活。
7.2专一性不可逆抑制剂
此属抑制剂专一地作用于酶的活性中心或其必需基团，进行共价结合，从而抑制酶的活性。
有机磷杀虫剂能专一作用于胆碱酯酶活性中心的丝氨酸残基，使其磷酰化而不可逆抑制酶的活性。
当胆碱酯酶被有机磷杀虫剂抑制后，乙酰胆碱不能及时分解成乙酸和胆碱，引起乙酰胆碱的积累，使一些以乙酰胆碱为传导介质的神经系统处于过度兴奋状态，引起神经中毒症状。
解磷定等药物可与有机磷杀虫剂结合，使酶和有机磷杀虫剂分离而复活。
专一性不可逆抑制剂的类型:
1．Ks型结合型不可逆抑制剂
2．Kcat型催化型不可逆抑制剂（自杀底物）
Ks型结合型专一性不可逆抑制剂
抑制剂只能专一地与某种酶结合而引起的不可逆抑制作用。
举例：
1对甲苯磺酰-L-苯丙氨酰氯甲酮抑制胰凝乳蛋白酶
2对甲苯磺酰-L-赖氨酰氯甲酮抑制胰蛋白酶
Kcat型催化型不可逆抑制剂（自杀底物）
抑制剂能专一地与某种酶结合并发生催化反应，而反应的产物中含有一个基团可以与酶分子活性中心的基团共价结合，导致酶分子不可逆地丧失催化活性。
Kcat型不可逆抑制剂（自杀底物）
（1）天然酶的自杀底物
（2）治疗用人工合成的酶自杀底物
八、酶活力的测定
定性鉴定提取物中某一酶是否存在，一般是根据此酶引起的化学反应来判断，如检验在提取物中是否存在淀粉酶。
则用提取物与淀粉反应，一段时间以后，用碘-碘化钾与反应液反应，若变蓝，说明提取物无淀粉酶活力；反之，提取物有淀粉酶的活力。
酶活力的测定：
实际上是酶定量测定的方法，酶制剂因含杂质多易失活等原因，故不能用称重或测量体积来定量。
（一）酶活力的概念：
指酶催化特定化学反应的能力。
其大小通常用在一定条件下酶催化某一特定化学反应的速度来表示。
一定量的酶制剂催化某一化学反应速度快，活力大；反之，活力小。
速度表示法常用-dS/dt或dP/dt，测初速度，多用后者。
因为反应初期底物过量，底物的减少量不容易测定，而产物从无到有，易测定。
（二）酶的活力单位：
1961年国际生化协会酶学委员会统一规定，酶的国际单位（IU）规定为：
在最适反应条件（温度25℃）下，每分钟内催化1微摩尔（μmol）底物转化为产物所需的酶量（或1分钟内转化底物生成1微摩尔产物的酶量）称为1标准单位。
1972年国际生化协会又推荐一种新单位，即Katal（Kat）单位。
规定：
在最适温度下，每秒钟能催化1摩尔底物转化为产物所需要的酶量定义为1Kat。
1Kat=60×106IU.
（三）酶的比活力：
每单位酶蛋白所含的活力单位数。
对固体酶：
用活力单位/mg酶蛋白；
对液体酶：
用活力单位/ml酶液来表示。
很明显，比活力越大，酶的活力越大。
■比活力是酶的生产和酶学研究过程中经常使用的基本数据,可以用来比较每单位质量蛋白的催化能力。
■比活力也是表示酶制剂纯度的一个重要指标。
对同一种酶来说，比活力越高，表示酶越纯。
■对于不纯的酶，特别是含有大量的盐类或其他非蛋白物质的商品酶制剂，单位质量酶制剂中酶活力只能表示单位质量制剂的酶含量，不是比活力，比活力必须测定酶制剂中的蛋白质含量才能确定。
（四）酶活力的测定方法
1、分光光度法：
产物与适当的化学试剂生成有色物质或产物有紫外吸收的能力可采用此法。
2、测压法：
产物中有气体，测气压增加量。
3、滴定法：
产物中有酸生成，用碱滴定。
4、荧光法：
产物中有荧光物质生成或产物与荧光试剂反应生成荧光产物可用此法。
5、旋光法：
产物中有旋光物质可采用此法。
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