细胞生物学实验指导书09年.docx
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细胞生物学实验指导书09年
实验一普通光学显微镜的构造和使用
一、目的要求
1了解显微镜的基本构造和使用方法
2掌握油镜的原理和使用方法
二、显微镜的基本结构及油镜的工作原理
1．显微镜的基本构造
光学部分：
接目镜、接物镜、照明装置（聚光镜、虹彩光圈、反光镜等）。
机械部分：
镜座、镜臂、镜筒、物镜转换器、载物台、载物台转移器、粗调节器、细调节器等部件。
2．显微镜的放大倍数和分辨率
放大倍数=接物镜放大倍数×接目镜放大倍数
显微镜的分辨率：
表示显微镜辨析物体（两端）两点之间距离的能力
3．油镜的使用原理
当光线由反光镜通过玻片与镜头之间的空气时，由于空气与玻片的密度不同，使光线受到曲折，发生散射，降低了视野的照明度。
若中间的介质是一层油（其折射率与玻片的相近），则几乎不发生折射，增加了视野的进光量，从而使物象更加清晰。
三、器材
1．永久切片
2.溶液或试剂：
香柏油、二甲苯。
3.仪器或其他用具：
显微镜、擦镜纸等。
四、操作步骤
1．观察前的准备
（1）显微镜的安置，检查零件是否齐全，镜头是否清洁。
（2）调节光源
2．显微镜观察
（1）低倍镜观察
（2）高倍镜观察
（3）油镜观察：
高倍镜下找到清晰的物象后，提升聚光镜，在标本中央滴一滴香柏油，使油镜镜头浸入香柏油中，细调至看清物象为止。
3．显微镜用毕后的处理
观察完毕，上升镜筒，用擦镜纸和二甲苯清洗镜头，后将镜体全部复原。
五、思考题
1．用油镜观察时应注意哪些问题？
在载玻片和镜头之间滴加什么油？
起什么作用？
2．为什么在使用高倍镜及油镜时应特别注意避免粗调节器的误操作？
实验二胞间连丝的观察
一、实验目的
观察植物细胞的胞间连丝，加深对胞间连丝功能的认识．
二、实验原理
植物细胞的细胞壁上有许多原生质的细丝，称胞间连丝。
相邻细胞的胞间连丝相互联接，在细胞间的物质运输与信息传递中起桥粱作用，并使细胞的各种生理活动协调一致，使植物体成为统一的有机体。
用合适的植物细胞为材料，经简单处理，即能方便地看到胞间连丝。
三、实验材料
红辣椒表皮细胞临时装片、柿胚乳细胞间胞间连丝切片
四、实验步骤
1.剪取一小块红辣椒．用小刀小心刮除果肉．
2.将上述刮除果肉后极薄的表皮放在载玻片上，滴一滴水，盖上盖玻片，即可往显微镜下观察。
镜检时光线宜稍暗。
五、实验报告
绘图：
胞间连丝图
实验三密度梯度提取叶绿体
一、实验目的：
了解密度梯度提取叶绿体的方法。
二、实验原理：
在不同的密度梯度条件下离心，叶绿体和沉降系数比它小的物质会停留在不同梯度的交界处，而其它细胞组分怎会沉淀咋离心管的底部。
三、实验试剂：
15%蔗糖溶液；1000ml
50%蔗糖溶液；1000ml
匀浆介质；1000ml
四、实验步骤：
1.选取新鲜的嫩菠菜叶片，洗净擦干后去除叶梗和粗脉，撕成小碎块，称5g放于研钵中，加入10ml匀浆介质，迅速研磨。
2.匀浆液用2层纱布过滤于50ml烧杯中。
3.将滤液平分到2个离心管中，天平配平，1000r/min下离心2min。
弃去沉淀。
4.取新的离心管分别加入15%和50%蔗糖溶液各1.5ml形成梯度，在加入2ml的上清液
5.在5000r/min下离心20min。
弃去上清，沉淀即为叶绿体。
6.取一滴叶绿体悬液滴于载片上，加盖片观察：
五、作业
1.叶绿体是否分离纯净？
分析原因？
2.整个实验要在低温下迅速完成是何道理？
实验四PEG诱导动物细胞融合
一、实验目的
了解细胞融合的基本原理,并掌握PEG诱导动物细胞融合的方法。
二、实验原理
PEG是乙二醇的多聚物,存在不同分子量的多聚体,它可改变各类细胞的膜结构,使两细胞相互接触部位的膜脂双层中脂类分子发生疏散和重组,此时相互接触的两细胞的胞质沟通成为可能,从而造成细胞之间发生融合.。
三、实验试剂
生理盐水；GKN液；Alsver液；50%聚乙二醇
四、实验步骤
采取鸡血
↓加入Alsver液
取混合液1ml
↓加入4ml生理盐水
混合液
↓1200r/min，离心三次，5min,5min,10min
取血细胞沉淀
↓加入适量GKN液稀释
取适量稀释液滴于载玻片
↓滴加PEG（稀释液的1/2）静置3min
镜检
五作业
图绘所观察到的细胞融合。
实验五植物细胞骨架的光学显微镜观察
一、实验目的：
掌握植物细胞骨架处理及染色方法。
二、实验原理：
用适当浓度的TritonX-100处理时，可将细胞内蛋白质破坏，但细胞骨架系统的蛋白质却被保存，后者用考马斯亮兰R250染色，可在光学显微镜下观察到细胞骨架的网状结构。
三、实验试剂：
1、M-缓冲液；
2、pH6.8磷酸缓冲液；
3、1%TritonX-100，用M-缓冲液配制；
4、0.2%考马斯亮兰R250；
5、3%戊二醛，用pH6.8磷酸缓冲液；
四、实验步骤：
1、撕取洋葱鳞茎内表皮细胞（约1cm2大小若干片）置于装有pH6.8磷酸缓冲液的50ml烧杯中，使其下沉；
2、吸去pH6.8磷酸缓冲液，用1%TritonX-100处理20min；
3、吸去1%TritonX-100，用M-缓冲液洗三次，每次8min；
4、3%戊二醛固定30min；
5、pH6.8磷酸缓冲液洗三次，每次8min；
6、0.2%考马斯亮兰R250染色20min；
7、用蒸馏水洗1-2次，将内表皮细胞平铺子载玻片上，加盖玻片，于显微镜下观察。
五、实验作业：
1、绘制你所观察到的植物细胞骨架图象；
2、戊二醛、考马斯亮兰R250、TritonX-100是什么？
在本实验中各起什么作用？
实验六X染色质标本的制备和观察
一、目的
1.通过实验明确X染色质的形态、数量、分布特点。
2.通过实验掌握X染色质标本制作方法。
3.通过实验认识X染色质与X染色体之间的数量关系，学会核性别的判断方法。
二、材料
1.器械：
显微镜、盖玻片、载玻片、消毒牙签、染色缸、试剂瓶-染色和固定、天平、量筒、恒温水浴箱、白绸
2.试剂乙醇、龙胆紫、硫瑾、巴比妥钠、HCL、冰醋酸、醋酸钠、蒸馏水
三、方法和步骤
1.人口腔粘膜上皮细胞X染色质标本制备
涂片：
簌口后用清洁的消毒牙签，从颊部内侧轻轻刮取少许口腔黏膜上皮细胞，均匀涂布于洁净的载玻片上。
固定：
在涂片未干燥时用95%酒精固定15分钟蒸馏水冲洗。
染色：
龙胆紫染色法：
1-2分钟，用水冲洗，油镜观察。
硫瑾染色法：
5NHcl（220C）中10分钟蒸馏水冲洗染色30分钟用水冲洗油镜观察。
2.人口腔粘膜上皮细胞X染色质标本观察
油镜观察50个可数细胞X染色质出现率
正常值：
男性，低于1%；女性，高于10%。
四、注意事项
1.刮取口腔粘膜上皮细胞时不宜用力过大，涂片时尽量使其均匀，最好能使细胞成单层分散平铺。
2.Hcl水解掌握好时间和温度。
3.染色时间需掌握好，必要时可分别不同时间染色。
4.计数细胞时，细胞核必须完整无缺，无皱褶，染色均匀。
五、染液配制方法（学生不做）
1.龙胆紫染液配制法：
冰醋酸30ml、龙胆紫0.75g、蒸馏水70ml。
先加温使龙胆紫溶于冰醋酸中，晾凉后再加蒸馏水。
2.硫瑾原液配制法：
硫瑾4g、50%酒精100ml。
配制成100ml硫瑾液。
在与缓冲液混合前过滤。
3.缓冲液配制：
醋酸钠1.94g、巴比妥钠2.94g、加蒸馏水至100ml冰箱保存。
4.硫瑾工作液配制法：
按下列顺序混合，饱和硫瑾100ml、0.1NHCl70ml、缓冲液60ml。
调至PH5.7冰箱保存。
六、实验报告
1.绘出细胞X染色质图，表明细胞膜、细胞质、细胞核、X染色质四部分。
2.写出男女X染色质正常值。
实验七光学显微镜下的细胞和细胞器及其显微测量
一、目的与要求
1、判断和识别光学显微镜下各种细胞器的形态，大小和数目；
2掌握普通光学显微镜及测微尺的使用方法。
二、实验原理
细胞器往往由特殊物质组成，因而可通过对特异物质的区别染色把各种结构区分开束，每种细胞器都有特殊的形态、大小、分布位置及数目，这也是我们判断。
识别细咆器的依据。
而每种细胞器在不同细胞、不同发育时期和不同生理状态下的形态大小会有所不同。
所以细胞器的观察可用来判断细胞的生理状和发育情况。
细胞的大小和形态依细胞种类不同各异，因此，测量细胞体积首先要用测微尺测出细胞的长半径和短半径。
常用的测微尺有目镜测微尺和物镜测微尺两种。
目镜测微尺为一块圆形的薄玻璃片，直径20～21mm，正好能放入目镜的镜筒内，其上面刻有不同形式的标尺。
标尺有直线式和网格式两种，直线式又分为“十”字形和“一”字形两种。
直线式测微尺总长10mm，分为10大格，其上有数字指示，每一大格又分10小格，共100小格。
网格式测微尺常用来测量面积或计数。
物镜测微尺是一种特制的载玻片，其中央有一个圆圈，圈内具有一个有刻度的标尺，为直线式标尺，全长1mm，分为10大格，每大格又分10小格，共100小格，每小格长度为0.01mm。
由于目镜测微尺刻度的长度随物镜放大倍数不同而有改变，所以用目镜测微尺测量细胞前，首先要测定目镜测微尺的长度，即使用物镜测微尺来确定目镜测微尺刻度的长度，然后再以目镜测微尺上的刻度作为测量细胞时的度量单位。
三、材料和用具
显微镜、载玻片、盖玻片、干消毒棉球、试管、滴管、目镜测微尺、物镜测微尺、75％乙醇、红细胞稀释液、苔藓、洋葱根尖切片。
四、操作与观察：
1、用目镜测微尺分别在高倍镜下和油镜下测量镜台测微尺，从而算出称所用显微镜中目镜测微尺每格所代表的实际长度。
2、用高倍镜及油镜检测各种切片，并且用目镜测微尺测量细胞和细胞核的长、短径的长度。
3．选取细胞膜和核膜界限清晰的切片或涂片测量。
测量时可旋转目镜（测微尺）及移动载玻片，置被测细胞于测微尺轴线上。
4．根据测量结果计算各种细胞及细胞核的体积。
5将苔藓洗净撕取一小块置于滴有清水的载玻片上，盖上盖玻片，观察细胞形态结构，并测量细胞及细胞器的大小。
为减少误差，同一标本需测5个细胞的数据，取其平均值计算体积。
五、作业
1你所测量的各种血细胞的大小各是多少？
2绘制细胞显微结构图，把你所见到的各种细胞器绘制在一个细胞内。
注意细胞器外形特点、大小、分布位置、数目。
实验八细胞膜的渗透性
一、实验目的
了解细胞膜的渗透性及各类物质进入细胞的速度。
二、实验原理
当红细胞置于不同等渗溶液中时，由于对各种溶质的通透性不同，因此有的溶质分子可透入，有的溶质分子则不能透入，能透人的溶质分子的速度也不同。
当溶质分子进入红细胞使细胞内溶质浓度增加时，导致水的摄人。
红细胞膨胀到一定程度时，细胞膜破裂，血红素溢出即红细胞发生溶血.由于溶质透人速度不同，溶血时间也不同.
三、实验材料
材料：
鸡血
试剂：
0.17mol／L氯化钠，0.17mol／L氯化铵，0.17mol／L硝酸钠，0.12mol／L硫酸钠，0.10mol／L草酸钠，0.10mol／L醋酸钠，0.32mol／L葡萄糖，0.32mol／L甘油，0.32mol／L乙醇，0.32mol／L丙醇。
仪器：
显微镜、、载玻片、盖玻片、吸管、小烧杯、试管、秒表。
四、实验步骤
1.鸡用注射器耳静脉取血，取小烧杯2只，分别加1份经肝素抗凝的鸡血和10份0.17mol／L氯化钠，成为一种不透明的红色液体，此即稀释的鸡血。
2.取试管1支，加入10mL蒸馏水，然后再加入1mL稀释的鸡血，注意观察溶液的颜色变化，溶液由不透明的红色变为红色透明，红细胞发生破裂，造成所有红细胞溶血，使光线容易通过。
显微镜下观察溶血前后红细胞的形态。
3.观察红细胞对各类物质的渗透性:
取试管10支，分别加入上述10种溶液各5mL，再加入0.5mL稀释的鸡血，记下时间，轻轻摇动使混匀，注意是否发生溶血；若发生溶血，记录溶血过程所需的时间。
五、实验报告
试管编号
溶液种类
是否溶血
溶血所需时间
结果分析
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
实验九DNA的Feulgen染色法
一、实验目的
观察蚕豆、洋葱根尖细胞或其他根尖细胞内的染色体，以及染色体在有丝分裂中的行为，掌握Feulgen染色方法。
二、实验原理
这是Feulgen于1924年提出的一种鉴别细胞中DNA组织的化学方法。
细胞中的DNA在60℃下用1mol/LHC1酸解，使脱氧核糖与嘌呤碱之间的糖苷键破坏，嘌呤碱脱掉，从而使脱氧核糖中潜在的醛基游离。
游离的醛基与Schiff试剂结合，形成一种紫色的复合物。
酸解的条件很重要。
若温度低、酸度不够，醛基暴露不充分，染色会过浅；相反，若酸解过分，会造成DNA完全解聚，从而使水解液中Schiff反应增强，而染色体的染色反应减弱。
由于RNA在酸的作用下比DNA稳定，醛基难以被游离，所以，不能被着色。
这就是孚尔根反应对DNA有特异性染色的原因。
三、实验仪器、材料和试剂
（一）仪器、用具
显微镜、恒温水浴箱、温度计、解剖针、酒精灯、试管、烧杯、载玻片、盖玻片、吸水纸。
（二）材料
洋葱鳞茎或根尖
（三）试剂
1．1MHCl的配制
取82.5ml比重1.19的浓HCl加蒸馏水至1000ml。
2．Schiff试剂的配制及保存
称取0.5g碱性品红加入到100ml煮沸的蒸馏水中（用三角烧瓶），时时振荡，继续煮5分钟（勿使之沸腾），使之充分溶解。
然后冷却至50℃时用滤纸过滤，滤液中加入10ml1MHCl，冷却至25℃时，加入0.5gNa2S2O5（偏重亚硫酸钠或钾），充分振荡后，塞紧瓶塞，在室温暗处静置至少24小时（有时需2～3天），使其颜色退至淡黄色，然后加入0.5g活性炭，用力振荡1分钟，最后用粗滤纸过滤于棕色瓶中，封严瓶塞，外包黑纸。
滤液应为无色也无沉淀，贮于4℃冰箱中备用。
如有白色沉淀，就不能再使用，如颜色变红，可加入少许偏重亚硫酸钠或钾，使之再转变为无色时，仍可再用。
3．亚硫酸水
取200ml自来水，加10ml10%偏重亚硫酸钠（或偏重亚硫酸钾）水溶液和10ml1MHCl，三者于使用前混匀。
四、实验步骤
切去根尖
↓长度0.3～0.5cm
Carnoy固定剂
↓固定10～30min
95%酒精
↓10min
70%酒精
↓10min
蒸馏水→（对照）5%三氯醋酸
↓↓90℃15min
1mol/LHCL←蒸馏水
↓室温15min
1mol/LHCL
↓60℃8min
Schiff试剂
↓40～60min
亚硫酸水3次
↓每次5min
自来水
↓将染色后的根尖漂洗干净，选着色效果好的材料10min
蒸馏水
↓10min
压片
↓
镜检
五、作业
1、简述Feulgen反应的原理和实验的关键步骤。
2、绘图示洋葱根尖细胞或鳞茎表皮细胞DNA的分布部位。
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