细胞生物学实验指导书09年.docx

1、细胞生物学实验指导书09年实验一 普通光学显微镜的构造和使用一、目的要求1了解显微镜的基本构造和使用方法2 掌握油镜的原理和使用方法二、显微镜的基本结构及油镜的工作原理1显微镜的基本构造光学部分：接目镜、接物镜、照明装置（聚光镜、虹彩光圈、反光镜等）。机械部分：镜座、镜臂、镜筒、物镜转换器、载物台、载物台转移器、粗调节器、细调节器等部件。2显微镜的放大倍数和分辨率放大倍数=接物镜放大倍数接目镜放大倍数显微镜的分辨率：表示显微镜辨析物体（两端）两点之间距离的能力3油镜的使用原理 当光线由反光镜通过玻片与镜头之间的空气时，由于空气与玻片的密度不同，使光线受到曲折，发生散射，降低了视野的照明度。若中

2、间的介质是一层油（其折射率与玻片的相近），则几乎不发生折射，增加了视野的进光量，从而使物象更加清晰。三、器材1永久切片2. 溶液或试剂：香柏油、二甲苯。3. 仪器或其他用具：显微镜、擦镜纸等。四、操作步骤1观察前的准备（1）显微镜的安置，检查零件是否齐全，镜头是否清洁。（2）调节光源2显微镜观察（1）低倍镜观察（2）高倍镜观察（3）油镜观察：高倍镜下找到清晰的物象后，提升聚光镜，在标本中央滴一滴香柏油，使油镜镜头浸入香柏油中，细调至看清物象为止。 3显微镜用毕后的处理观察完毕，上升镜筒，用擦镜纸和二甲苯清洗镜头，后将镜体全部复原。五、思考题1用油镜观察时应注意哪些问题？在载玻片和镜头之间滴加什

3、么油？起什么作用？2为什么在使用高倍镜及油镜时应特别注意避免粗调节器的误操作？实验二 胞间连丝的观察一、实验目的观察植物细胞的胞间连丝，加深对胞间连丝功能的认识二、实验原理植物细胞的细胞壁上有许多原生质的细丝，称胞间连丝。相邻细胞的胞间连丝相互联接，在细胞间的物质运输与信息传递中起桥粱作用，并使细胞的各种生理活动协调一致，使植物体成为统一的有机体。用合适的植物细胞为材料，经简单处理，即能方便地看到胞间连丝。三、实验材料红辣椒表皮细胞临时装片、柿胚乳细胞间胞间连丝切片四、实验步骤1.剪取一小块红辣椒用小刀小心刮除果肉2.将上述刮除果肉后极薄的表皮放在载玻片上，滴一滴水，盖上盖玻片，即可往显微镜下

4、观察。镜检时光线宜稍暗。五、实验报告绘图：胞间连丝图实验三 密度梯度提取叶绿体一、实验目的：了解密度梯度提取叶绿体的方法。二、实验原理：在不同的密度梯度条件下离心，叶绿体和沉降系数比它小的物质会停留在不同梯度的交界处，而其它细胞组分怎会沉淀咋离心管的底部。三、实验试剂：15%蔗糖溶液；1000ml50%蔗糖溶液；1000ml匀浆介质； 1000ml四、实验步骤：1.选取新鲜的嫩菠菜叶片，洗净擦干后去除叶梗和粗脉，撕成小碎块，称5g放于研钵中，加入10ml匀浆介质，迅速研磨。 2.匀浆液用2层纱布过滤于50ml烧杯中。 3.将滤液平分到2个离心管中，天平配平，1000r/min下离心2min。弃

5、去沉淀。 4.取新的离心管分别加入15%和50%蔗糖溶液各1.5ml形成梯度，在加入2ml的上清液5.在5000r/min下离心20min。弃去上清，沉淀即为叶绿体。 6.取一滴叶绿体悬液滴于载片上，加盖片观察：五、作业1.叶绿体是否分离纯净？分析原因？2.整个实验要在低温下迅速完成是何道理？实验四 PEG诱导动物细胞融合一、实验目的了解细胞融合的基本原理,并掌握PEG诱导动物细胞融合的方法。二、实验原理PEG是乙二醇的多聚物, 存在不同分子量的多聚体,它可改变各类细胞的膜结构, 使两细胞相互接触部位的膜脂双层中脂类分子发生疏散和重组,此时相互接触的两细胞的胞质沟通成为可能,从而造成细胞之间发

6、生融合.。三、实验试剂生理盐水；GKN 液；Alsver 液；50%聚乙二醇四、实验步骤 采取鸡血加入Alsver 液取混合液1ml加入4ml生理盐水混合液1200r/min，离心三次，5min,5min,10min取血细胞沉淀加入适量GKN 液稀释取适量稀释液滴于载玻片滴加PEG（稀释液的1/2）静置3min镜检五 作业图绘所观察到的细胞融合。实验五 植物细胞骨架的光学显微镜观察一、 实验目的：掌握植物细胞骨架处理及染色方法。二、 实验原理：用适当浓度的TritonX-100处理时，可将细胞内蛋白质破坏，但细胞骨架系统的蛋白质却被保存，后者用考马斯亮兰R250染色，可在光学显微镜下观察到细胞

7、骨架的网状结构。三、 实验试剂：1、M-缓冲液；2、pH6.8磷酸缓冲液；3、1% TritonX-100，用M-缓冲液配制；4、0.2%考马斯亮兰R250；5、3%戊二醛，用pH6.8磷酸缓冲液；四、 实验步骤：1、 撕取洋葱鳞茎内表皮细胞（约1cm2大小若干片）置于装有pH6.8磷酸缓冲液的50ml烧杯中，使其下沉；2、 吸去pH6.8磷酸缓冲液，用1% TritonX-100处理20min；3、 吸去1% TritonX-100，用M-缓冲液洗三次，每次8min；4、 3%戊二醛固定30min；5、 pH6.8磷酸缓冲液洗三次，每次8min；6、 0.2%考马斯亮兰R250染色20min

8、；7、 用蒸馏水洗1-2次，将内表皮细胞平铺子载玻片上，加盖玻片，于显微镜下观察。五、 实验作业：1、 绘制你所观察到的植物细胞骨架图象；2、 戊二醛、考马斯亮兰R250、TritonX-100是什么？在本实验中各起什么作用？实验六 X染色质标本的制备和观察一、目的1.通过实验明确X染色质的形态、数量、分布特点。2.通过实验掌握X染色质标本制作方法。3.通过实验认识X染色质与X染色体之间的数量关系，学会核性别的判断方法。二、材料1.器械：显微镜、盖玻片、载玻片、消毒牙签、染色缸、试剂瓶-染色和固定、天平、量筒、恒温水浴箱、白绸2.试剂 乙醇、龙胆紫、硫瑾、巴比妥钠、HCL、冰醋酸、醋酸钠、蒸馏

9、水三、方法和步骤1.人口腔粘膜上皮细胞X染色质标本制备涂片：簌口后用清洁的消毒牙签，从颊部内侧轻轻刮取少许口腔黏膜上皮细胞，均匀涂布于洁净的载玻片上。固定：在涂片未干燥时用95%酒精固定15分钟蒸馏水冲洗。染色：龙胆紫染色法：1-2分钟，用水冲洗，油镜观察。硫瑾染色法：5N Hcl（220C）中10分钟蒸馏水冲洗染色30分钟用水冲洗油镜观察。2.人口腔粘膜上皮细胞X染色质标本观察油镜观察50个可数细胞X染色质出现率正常值：男性，低于1%；女性，高于10%。四、注意事项1.刮取口腔粘膜上皮细胞时不宜用力过大，涂片时尽量使其均匀，最好能使细胞成单层分散平铺。2.Hcl水解掌握好时间和温度。3.染色

10、时间需掌握好，必要时可分别不同时间染色。4.计数细胞时，细胞核必须完整无缺，无皱褶，染色均匀。五、染液配制方法(学生不做)1.龙胆紫染液配制法：冰醋酸30ml、龙胆紫0.75g、蒸馏水70ml。先加温使龙胆紫溶于冰醋酸中，晾凉后再加蒸馏水。2.硫瑾原液配制法：硫瑾4g、50%酒精100ml。配制成100ml硫瑾液。在与缓冲液混合前过滤。3.缓冲液配制：醋酸钠1.94g、巴比妥钠2.94g、加蒸馏水至100ml冰箱保存。4.硫瑾工作液配制法：按下列顺序混合，饱和硫瑾100ml、0.1NHCl70ml、缓冲液60ml。调至PH5.7冰箱保存。六、实验报告1.绘出细胞X染色质图，表明细胞膜、细胞质、

11、细胞核、X染色质四部分。2.写出男女X染色质正常值。实验七 光学显微镜下的细胞和细胞器及其显微测量一、 目的与要求1、判断和识别光学显微镜下各种细胞器的形态，大小和数目；2掌握普通光学显微镜及测微尺的使用方法。二、 实验原理细胞器往往由特殊物质组成，因而可通过对特异物质的区别染色把各种结构区分开束，每种细胞器都有特殊的形态、大小、分布位置及数目，这也是我们判断。识别细咆器的依据。而每种细胞器在不同细胞、不同发育时期和不同生理状态下的形态大小会有所不同。所以细胞器的观察可用来判断细胞的生理状和发育情况。细胞的大小和形态依细胞种类不同各异，因此，测量细胞体积首先要用测微尺测出细胞的长半径和短半径。

12、常用的测微尺有目镜测微尺和物镜测微尺两种。目镜测微尺为一块圆形的薄玻璃片，直径2021mm，正好能放入目镜的镜筒内，其上面刻有不同形式的标尺。标尺有直线式和网格式两种，直线式又分为“十”字形和“一”字形两种。直线式测微尺总长10mm，分为10大格，其上有数字指示，每一大格又分10小格，共100小格。网格式测微尺常用来测量面积或计数。物镜测微尺是一种特制的载玻片，其中央有一个圆圈，圈内具有一个有刻度的标尺，为直线式标尺，全长1mm，分为10大格，每大格又分10小格，共100小格，每小格长度为0.01mm。由于目镜测微尺刻度的长度随物镜放大倍数不同而有改变，所以用目镜测微尺测量细胞前，首先要测定目

13、镜测微尺的长度，即使用物镜测微尺来确定目镜测微尺刻度的长度，然后再以目镜测微尺上的刻度作为测量细胞时的度量单位。三、 材料和用具显微镜、载玻片、盖玻片、干消毒棉球、试管、滴管、目镜测微尺、物镜测微尺、75乙醇、红细胞稀释液、苔藓、洋葱根尖切片。四、 操作与观察：1、用目镜测微尺分别在高倍镜下和油镜下测量镜台测微尺，从而算出称所用显微镜中目镜测微尺每格所代表的实际长度。2、用高倍镜及油镜检测各种切片，并且用目镜测微尺测量细胞和细胞核的长、短径的长度。3选取细胞膜和核膜界限清晰的切片或涂片测量。测量时可旋转目镜（测微尺)及移动载玻片，置被测细胞于测微尺轴线上。4根据测量结果计算各种细胞及细胞核的体

14、积。5将苔藓洗净撕取一小块置于滴有清水的载玻片上，盖上盖玻片，观察细胞形态结构，并测量细胞及细胞器的大小。为减少误差，同一标本需测5个细胞的数据，取其平均值计算体积。五、 作业1 你所测量的各种血细胞的大小各是多少？2 绘制细胞显微结构图，把你所见到的各种细胞器绘制在一个细胞内。注意细胞器外形特点、大小、分布位置、数目。实验八 细胞膜的渗透性一、实验目的了解细胞膜的渗透性及各类物质进入细胞的速度。二、实验原理 当红细胞置于不同等渗溶液中时，由于对各种溶质的通透性不同，因此有的溶质分子可透入，有的溶质分子则不能透入，能透人的溶质分 子的速度也不同。当溶质分子进入红细胞使细胞 内溶质浓度增加时，导

15、致水的摄人。红细胞膨胀 到一定程度时，细胞膜破裂，血红素溢出即红细 胞发生溶血.由于溶质透人速度不同，溶血时间 也不同. 三、实验材料材料：鸡血试剂：0.17 molL氯化钠，0.17 molL 氯化铵，0.17 molL硝酸钠，0.12 molL硫酸 钠，0.10 molL草酸钠，0.10molL醋酸钠， 0.32 molL葡萄糖，0.32 molL甘油，0.32 molL乙醇，0.32molL丙醇。 仪器：显微镜、载玻片、盖玻片、吸管、小烧杯、试管、秒表。四、实验步骤1.鸡用注射器耳静脉取血，取小烧杯2只，分别加1份经肝素抗凝的鸡血和10份0.17molL氯化钠， 成为一种不透明的红色液体

16、，此即稀释的鸡血。 2.取试管1支，加入10mL蒸馏水，然后再加入1 mL稀释的鸡血，注意观察溶液的颜色变化，溶液由不透明的红色变为红色透明，红细胞发生破裂，造成所有红细胞溶血，使光线容易通过。显微镜下观察溶血前后红细胞的形态。 3.观察红细胞对各类物质的渗透性:取试管10支，分别加入上述10种溶液各5 mL，再 加入0.5mL稀释的鸡血，记下时间，轻轻摇动使混匀，注意是否发生溶血；若发生溶血，记录溶血过程所需的时间。 五、实验报告试管编号 溶液种类 是否溶血 溶血所需时间 结果分析12345678910实验九DNA的Feulgen染色法一、实验目的观察蚕豆、洋葱根尖细胞或其他根尖细胞内的染色

17、体，以及染色体在有丝分裂中的行为，掌握Feulgen染色方法。二、实验原理这是Feulgen于1924年提出的一种鉴别细胞中DNA组织的化学方法。细胞中的DNA在60下用1mol/L HC1酸解，使脱氧核糖与嘌呤碱之间的糖苷键破坏，嘌呤碱脱掉，从而使脱氧核糖中潜在的醛基游离。游离的醛基与Schiff试剂结合，形成一种紫色的复合物。酸解的条件很重要。若温度低、酸度不够，醛基暴露不充分，染色会过浅；相反，若酸解过分，会造成DNA完全解聚，从而使水解液中Schiff反应增强，而染色体的染色反应减弱。由于RNA在酸的作用下比DNA稳定，醛基难以被游离，所以，不能被着色。这就是孚尔根反应对DNA有特异性

18、染色的原因。三、实验仪器、材料和试剂 （一） 仪器、用具显微镜、恒温水浴箱、温度计、解剖针、酒精灯、试管、烧杯、载玻片、盖玻片、吸水纸。（二 ）材料洋葱鳞茎或根尖（三）试剂11MHCl的配制取82.5ml比重1.19的浓HCl加蒸馏水至1000ml 。2Schiff试剂的配制及保存称取0.5g碱性品红加入到100ml煮沸的蒸馏水中（用三角烧瓶），时时振荡，继续煮 5分钟（勿使之沸腾），使之充分溶解。然后冷却至50时用滤纸过滤，滤液中加入10ml 1MHCl，冷却至25时，加入0.5g Na2S2O5（偏重亚硫酸钠或钾），充分振荡后，塞紧瓶塞，在室温暗处静置至少24小时（有时需23天），使其颜色

19、退至淡黄色，然后加入0.5g活性炭，用力振荡1分钟，最后用粗滤纸过滤于棕色瓶中，封严瓶塞，外包黑纸。滤液应为无色也无沉淀，贮于4冰箱中备用。如有白色沉淀，就不能再使用，如颜色变红，可加入少许偏重亚硫酸钠或钾，使之再转变为无色时，仍可再用。3亚硫酸水取200ml自来水，加10ml 10%偏重亚硫酸钠（或偏重亚硫酸钾）水溶液和10ml 1M HCl，三者于使用前混匀。四、实验步骤切去根尖长度0.30.5cmCarnoy固定剂固定1030min95%酒精10min70%酒精10min蒸馏水（对照）5%三氯醋酸 9015min1mol/LHCL 蒸馏水室温15min1mol/LHCL608minSchiff试剂4060min亚硫酸水3次每次5min自来水将染色后的根尖漂洗干净，选着色效果好的材料10min蒸馏水10min压片镜检五、作业1、简述Feulgen反应的原理和实验的关键步骤。 2、绘图示洋葱根尖细胞或鳞茎表皮细胞DNA的分布部位。