生化方法学及仪器应用.docx

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生化方法学及仪器应用

生化方法学及仪器应用

生化检测方法及仪器应用

两点法：

测定酶反应开始后某一时间内（t1到t2）产物或底物浓度的总变化量以求取酶反应初速度的方法。

终点法：

通过测定酶反应开始到反应达到平衡时产物或底物浓度总变化量，以求出酶活力的方法，亦称平衡法。

速率法：

是指连续测定（每15秒~1分钟监测一次）酶反应过程中某一反应产物或底物的浓度随时间的变化来求出酶反应的初速度的方法，即连续监测法。

一、常用生化检测项目分析方法举例

1．终点法检测常用的有总胆红素（氧化法或重氮法）、结合胆红素（氧化法或重氮法）、血清总蛋白（双缩脲法）、血清白蛋白（溴甲酚氯法）、总胆汁酸（酶法）、葡萄糖（葡萄糖氧化酶法）、尿酸（尿酸酶法）、总胆固醇（胆固醇氧化酶法）、甘油三酯（磷酸甘油氧化酶酶法）、高密度脂蛋白胆固醇（直接测定法）、钙（偶氮砷Ⅲ法）、磷（紫外法）、镁（二甲苯胺蓝法）等。

以上项目中，除钙、磷和镁基本上还使用单试剂方式分析因而采用一点终点法外，其它测定项目都可使用双试剂故能选用两点终点法，包括总蛋白、白蛋白测定均已有双试剂可用。

2．固定时间法苦味酸法测定肌酐采用此法。

（两点法）

3．连续监测法（速率法）对于酶活性测定一般应选用连续监测法，如丙氨酸氨基转移酶、天冬氨酸氨基转移酶、乳酸脱氢酶、碱性磷酸酶、γ谷氨氨酰基转移酶、淀粉酶和肌酸激酶等。

一些代谢物酶法测定的项目如己糖激酶法测定葡萄糖、脲酶偶联法测定尿素等，也可用连续监测法。

4．透射比浊法透射比浊法可用于测定产生浊度反应的项目，多数属免疫比浊法，载脂蛋白、免疫球蛋白、补体、抗"O"、类风湿因子，以及血清中的其他蛋白质如前白蛋白、结合珠蛋白、转铁蛋白等均可用此法。

二、分析参数设置

分析仪的一些通用操作步骤如取样、冲洗、吸光度检测、数据处理等，其程序均已经固化在存储器里，用户不能修改。

各种测定项目的分析参数（analysisparamete）大部分也已设计好，存于磁盘中，供用户使用；目前大多数生化分析仪为开放式，用户可以更改这些参数。

生化分析仪一般另外留一些检测项目的空白通道，由用户自己设定分析参数。

因此必须理解各参数的确切意义。

一、分析参数介绍

（一）必选分析参数这类参数是分析仪检测的前提条件，没有这些参数无法进行检测。

1．试验名称试验名称（testcode）是指测定项目的标示符，常以项目的英文缩写来表示。

2．方法类型（也称反应模式）方法类型（assay）有终点法、两点法、连续监测法等，根据被检物质的检测方法原理选择其中一种反应类型。

3．反应温度一般有30℃、37℃可供选择，通常固定为37℃。

4．主波长主波长（primarywavelength）是指定一个与被测物质反应产物的光吸收有关的波长。

5．次波长次波长（secondarywavelength）是在使用双波长时，要指定一个与主波长、干扰物质光吸收有关的波长。

6．反应方向 反应方向（response direction）有正向反应和负向反应两种，吸光度增加为正向反应，吸光度下降为负向反应。

7．样品量 样品量（sampling volum）一般是2μl～35μl，以0.1μl步进，个别分析仪最少能达到1.6μl。

可设置常量、减量和增量。

8． 第一试剂量 第一试剂量（first regengt volum）一般是20～300μl，以1μl步进。

9． 第二试剂量 第二试剂量（second regengt volum）一般也是20～300μl，以1μl步进。

10．总反应容量 总反应容量（total reacting volum）在不同的分析仪有一个不同的规定范围，一般是180～350μl，个别仪器能减少至120μl。

总反应容量太少无法进行吸光度测定。

11．孵育时间 孵育时间（incubate time）在终点法是样品与试剂混匀开始至反应终点为止的时间，在两点法是第一个吸光度选择点开始至第二个吸光度选择点为止的时间。

12．延迟时间 延迟时间（delay time）在连续监测法中样品与反应试剂（第二试剂）混匀开始至连续监测期第一个吸光度选择点之间的时间。

13．连续监测时间 连续监测时间（continuous monitoring time）在延迟时间之后即开始，一般为60～120s，不少于4个吸光度检测点（3个吸光度变化值）。

14．校准液个数及浓度 校准曲线线性好并通过坐标零点的，可采用一个校准液（calibrator）；线性好但不通过坐标零点，应使用两个校准液；对于校准曲线呈非线性者，必须使用两个以上校准液。

每一个校准液都要有一个合适的浓度。

15．校准K值或理论K值 通过校准得到的K值为校准K值（calibrate coefficient）或由计算得出的K值为理论K值。

16．线性范围 即方法的线性范围（linearity range），超过此范围应增加样品量或减少样品量重测。

与试剂/样品比值有关。

17．小数点位数 检测结果的小数点位数（decimal point digit）。

（二）备选分析参数 

这类分析参数与检测结果的准确性有关，一般来说不设置这类分析参数，分析仪也能检测出结果，但若样品中待测物浓度太高等，检测结果可能不准确。

1．样品预稀释 设置样品量、稀释剂量和稀释后样品量三个数值，便可在分析前自动对样品进行高倍稀释。

2．底物耗尽值 底物耗尽值（substrate exhaust limit）在负反应的酶活性测定中，可设置此参数，以规定一个吸光度下降限。

若低于此限时底物已太少，不足以维持零级反应而导致检测结果不准确。

3．前区检查 免疫比浊法中应用，以判断是否有抗原过剩。

将终点法最后两个吸光度值的差别（ΔA）设置一个限值，如果后一点的吸光度比前一点低，表示已有抗原过剩，应稀释样品后重测。

4．试剂空白吸光度范围 超过此设定范围表示试剂已变质，应更换合格试剂。

5．试剂空白速率 连续监测法中使用，是试剂本身在监测过程中没有化学反应时的变化速率。

6．方法学补偿系数 用于校准不同分析方法间测定结果的一致性，有斜率和截距两个参数。

7．参考值范围 对超过此范围的测定结果，仪器会打印出提示。

（三）某些参数的特殊意义  

1．最小样品量 最小样品量是指分析仪进样针能在规定的误差范围内吸取的最小样品量。

一般分析仪的最小样品量是2μl，目前也有小至1.6μl的。

在样品含高浓度代谢产物或高活性酶浓度的情况下往往需采用分析仪的最小样品量作为减量参数，从而使分析仪检测范围（与线性范围不同）的上限得以扩大。

2．最大试剂量 方法灵敏度很高而线性上限低的检测项目，如血清白蛋白的溴甲酚氯法测定，以往手工法操作时样品量10μl，试剂量4ml，这样试剂量/样品量比例（R/S）为200，线性上限则为60g/L。

此法移植到分析仪上后，R/S却很难达到200，致使线性上限变低。

因此对这类检测项目最大试剂量非常重要。

3．弹性速率 在酶活性测定中，当酶活性太高，在连续监测期中已不呈线性反应时，有些仪器具有弹性速率（flexrate）功能，能自动选择反应曲线上连续监测期中仍呈线性的吸光度数据计算结果，使酶活性测定的线性范围得以扩大。

如AST可从1000U/L扩展至4000U/L，从而减少稀释及重测次数、降低成本。

4．试剂空白速率 当样品中存在胆红素时，胆红素对碱性苦味酸速率法或两点法测定肌酐有负干扰。

因为胆红素在肌酐检测的波长505nm有较高光吸收，而且胆红素在碱性环境中可被氧化转变，因而在肌酐反应过程中胆红素的光吸收呈下降趋势。

若在加入第一试剂后一段时间内设置试剂空白速率，因为此段中苦味酸尚未与肌酐反应，而胆红素在第一试剂的碱性环境中已同样被氧化转变，因而以第二试剂加入后的速率变化，减去试剂空白速率变化，便可消除胆红素的负干扰，见图7-8。

二、单波长和双波长方式 

（一）概念 

采用一个波长检测物质的光吸收强度的方式称为单波长（mono-wavelength）方式。

当反应液中含有一种组分，或在混合反应液中待测组分的吸收峰与其它共存物质的吸收波长无重叠时，可以选用。

在吸光度检测中，使用一个主波长和一个次波长的称双波长方式。

当反应液中存在干扰物的较大吸收、从而影响测定结果的准确性时，采用双波长方式更好。

（二）双波长的作用 

双波长（di-wavelength）测定优点是①消除噪音干扰;②减少杂散光影响;③减少样品本身光吸收的干扰。

从光源，到比色杯、单色器、检测器的整个光路系统中，均存在着随时间发生变化的不稳定的检测信号，即噪音，而双波长检测是同时进行的，两种波长检测产生的噪音基本上相同，因而能消除噪音干扰。

当样品中存在非化学反应的干扰物如甘油三酯、血红蛋白、胆红素等时，会产生非特异性的光吸收，而干扰测定结果的准确性。

采用双波长方式测定可以部分消除这类干扰，提高检测的准确性。

（三）次波长的确定方法 

当被测物的主波长确定之后，再选择次波长。

如根据甘油三酯等干扰物吸收光谱特征，选择次波长，使干扰物在主、次波长处有尽可能相同的光吸收值，而被测物在主、次波长处的光吸收值应有较大的差异。

一般来说，次波长应大于主波长100nm。

以主波长与次波长吸光度差来计算结果。

（四）双波长的具体应用

对于某些反应速度快且无法设置为两点终点法的分析项目，尤其是单试剂分析中，可以利用双波长的方式来部分消除样品本身的光吸收干扰。

目前用单试剂法测定的项目应用双波长的为血清总蛋白（双缩脲法）主波长500nm，次波长576nm；血清白蛋白（溴甲酚氯法）主、次波长分别为600和700nm；钙（偶氮砷Ⅲ法）主、次波长分别为 660、770nm；磷（紫外比色法）主、次波长为340、405nm，镁（二甲苯胺蓝法）主、次波长为505和 600nm。

三、单试剂和双试剂方式 

反应过程中只加一次试剂称单试剂方式，加两次试剂便为双试剂方式。

目前的生化分析仪大多可用双试剂方式分析，其优点是：

①可提高试剂的稳定性，多数双试剂混合成单一工作试剂时，其稳定时间缩短；②能设置两点终点法，来消除来自样品本身的光吸收干扰；③在某些项目检测时能消除非特异性化学反应的干扰。

如血清ALT测定，血清中的内源性丙酮酸及其它酮酸也可与试剂中的指示酶（乳酸脱氢酶）起反应，使结果偏高。

若先加入缺乏α-酮戊二酸的第一试剂，使其它酮酸与指示酶反应之后再加入含有α-酮戊二酸的第二试剂，启动真正的ALT酶促反应生成丙酮酸，而丙酮酸与乳酸脱氢酶的反应消耗的NAD＋能真正反映ALT的活性，从而消除以上副反应的影响。

四、测定过程的自动监测 

各种自动生化分析仪或多或少都具有对测定过程进行各种监测的功能，以便在没有人"监督"化学反应的情况下提高检测的准确性。

高档分析仪的监测功能更强。

1．试剂空白监测 每种试剂都有一定的空白吸光度范围，试剂空白吸光度的改变往往提示着该试剂的变质：

如利用Trinder反应为原理的检测试剂会因酚被氧化为醌而变为红色；碱性磷酸酶、γ－谷氨酰转移酶、淀粉酶等检测试剂会因基质分解出硝基酚或硝基苯胺而变黄；有些试剂久置后变浑浊。

这些情况均可使空白吸光度升高。

丙氨酸氨基转移酶、天冬氨酸氨基转移酶等负反应检测项目，其试剂在放置过程中空白吸光度会因NADH自行氧化为NAD+而下降等。

 试剂空白的测定方法有两种：

①每瓶试剂在使用前通过对试剂空白校准来确定试剂空白吸光度，这种方式适用于先取样品后加试剂的分析仪。

②每个样品测定前均检测试剂空白吸光度，适用于先加试剂后取样品的分析仪。

2．试剂空白变化速率监测 一些酶试剂在反应温度下不稳定，其空白吸光度可随着时间逐渐发生变化，这种变化的主要原因与工具酶或辅酶的纯度有关，且因试剂的组成和生产厂家的不同而不同。

这种变化会影响测定结果的准确性，一般使结果偏高。

如果设置此项监测，分析仪在结果计