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叉鞭金藻多糖的分离纯化及体外抗氧化作用研究
周妍,王凌,孙利芹,王长海
(烟台大学海洋学院,山东烟台264005)
摘要:
叉鞭金藻多糖(DAP)经琼脂糖凝胶柱层析进行分级,得到了DAP一1和DAP一2
2个组分,分别对这2个组分进行了纯度和分子质量的测定,并考察了对羟自由基OH·、
超氧阴离子O·的清除效果,以及对H:
O:
诱发小鼠红细胞氧化溶血的抑制作用和对小
鼠肝匀浆脂质过氧化的抑制作用.结果显示,两个组份的组成相对均一,能显著或极显著
清除OH·、O·,抑制小鼠红细胞溶血,并能显著抑制小鼠肝脂质过氧化的产生,且呈
现剂量依赖性.其中DAP一2的抗氧化活性较DAP—l好,其对OH·、0·的清除率最
高可达85.2%和76.0%,对小鼠红细胞的溶血抑制率和脂质过氧化的抑制率分别可达
83.6%和89.3%.
关键词:
叉鞭金藻;多糖;分离纯化;抗氧化
中图分类号:
Q949.2文献标识码:
A
随着陆地资源的逐渐枯竭,人们逐渐将研究
方向转向海洋,从海洋生物中寻求新的天然抗氧
化剂、新的抗衰老药物等已成为医药、食品等领域
的重要目标.叉鞭金藻(Dicrateriasp.)是一种经
济价值较高的海洋单细胞微藻,广泛用于虾、贻
贝、牡蛎等多种海珍品的人工养殖¨.目前对叉
鞭金藻的研究主要集中在:
(1)高密度培养的研
究,以生物量形式作为饵料的应用;
(2)用作污水
处理中的cu¨、Pb等有害金属离子的生物吸附
剂;(3)有机磷农药对其生长繁殖抑制机制的研
究,从而进一步研究海洋微藻的致毒性J.此外
对于叉鞭金藻活性物质的研究中对其合成不饱和
脂肪酸的研究较多,而对于其多糖研究的报道很
少,多数仅停留在多糖含量的测定上.本文从叉鞭
金藻多糖的提取纯化人手,获得不同组分的多糖
并对其体外抗氧化作用进行研究,以期为叉鞭金
藻多糖作为食品添加剂或海洋药物的开发提供一
定的参考.
1材料与方法
1.1材料与仪器
叉鞭金藻(Dicrateriasp.)原种购于中国海洋
大学种质库,实验用藻种由烟台大学海洋生化研
究所纯化并保存.
药品:
邻苯三酚,国药集团化学试剂有限公
司;邻二氮菲,天津市大茂化学试剂厂;三羟甲基
氨基甲烷(Tris),Sanland—ehemInternationalInc;
HO,天津市大茂化学试剂厂;七水和硫酸亚铁,
烟台三和化学试剂有限公司;硫代巴比妥酸
(TBA),上海试剂二厂.以上试剂均为分析纯.
清洁级昆明种小鼠,雄性,体重20~22g,山
东绿叶制药有限公司(许可证号:
SYXK(鲁)
20030020).
主要仪器:
UV1601紫外可见分光光度计,日
本SHIMAZU公司产品;BSZ一100自动部分收集
器,上海沪西分析仪器厂;HL一2S恒流泵,上海沪
收稿日期:
2009-07—13
资助项目:
山东省自然科学基金资助项目(Y2007D59);烟台大学大学生科技创新基金资助项目(080605).
作者简介:
周妍(1985一),女,山东东营人,硕士研究生,研究方向:
海洋活性物质;通讯联系人:
王长海(chwang2001
@sina.tom),教授,博士生导师.
290烟台大学学报(自然科学与工程版)第23卷
西分析仪器厂;Agilent1100型高效液相色谱仪,
美国安捷伦科技有限公司.
1.2方法
1.2.1叉鞭金藻粗多糖的制备新鲜培养的叉
鞭金藻藻液经离心后,加入5倍体积的去离子水,
置于一4℃冷冻,然后取出融化,如此反复3次获
得水溶性提取物;将冻融后的溶液超声破碎,离心
10rain,取上清液在水浴中加热,浓缩至原体积的
1/3,加人体积分数为3%的三氯乙酸沉淀蛋白,
12000r/min离心10rain,取上清液;加入5倍体
积的95%乙醇,离心取沉淀洗涤、透析、冷冻干燥
得白色粉末为粗多糖DAPL3J.
1.2.2粗多糖的分级与纯化将叉鞭金藻粗多
糖DAP配成5mg/mL的水溶液,上平衡好的
Sepharose6B琼脂糖凝胶层析柱(3.5cm×80
era).用0.O1mol/L的NaC1溶液梯度洗脱,流速
0.6mL/min,按管收集,用硫葸酮法于620nm
处检测糖的吸光度,得到多糖的洗脱曲线.根据洗
脱曲线分段收集,合并相同组分,浓缩,加人5倍
体积的95%乙醇使其完全沉淀,离心收集沉淀,
加蒸馏水,透析脱盐,冷冻干燥即得多糖精品.
1.2.3多糖纯度和分子量检测将DAP制成
0.2%的溶液,经0.22m滤膜过滤后,取滤液20
注入液相色谱仪,色谱柱为TSKGel一4000Pw
凝胶色谱柱(10m,7.5mm×300mm),流动相
为双蒸水,流速为0.5mL/min,示差检测器温度
为35℃,分析时间为40rain.记录色谱图,并根据
标准单糖测定的普适标准曲线计算DAP分子质
量
1.2.4抗氧化活性的检测
(1)羟自由基(OH·)清除实验.取0.75
moL/L邻二氮菲溶液1mL于试管中,加入400
mmoL/LPBS(pH7.4)缓冲液2mL和蒸馏水1
mL,充分混匀后,加2.5mmoL/L硫酸亚铁溶液1
mL,混匀,加20mmoL/LH2O21mL,于37℃水浴
1.5h,在536nm处测其吸光度,记做A;用1mL
蒸馏水代替1mLH:
0,测得的吸光度记做A;用
DAP1mL代替1mL蒸馏水,测得的吸光度记做
A_4J.按下式计算OH·自由基清除率:
A.
(2)超氧阴离子(O·)清除实验.各管分别
加入0.05moL/LTris—HC1(pH8.2)缓冲液4.6
mL,加入1mL多糖溶液,混匀后在25℃水浴保
温10rain,取出后立即加入在25℃预热过的
0.06moL/L邻苯三酚溶液0.3mL(对照管加入
10mmol/1HC10.3mE).各管充分混匀,准确反应
3rain(加入邻苯三酚时开始计时)后加入5%Vc
0.1mL终止反应.10min后,在420llm处测定吸
光度,记做A;对照管以1mL蒸馏水代替待测样
品,记做A:
l5J.按下式计算0·清除率:
A——A
(3)多糖对H0:
诱发小鼠红细胞氧化溶血
的影响.昆明小鼠眼球取血,肝素抗凝,2000r/
min离心6min,弃血浆,所剩红细胞用4倍量生
理盐水洗涤及同法离心,洗3次后用生理盐水悬
浮,调红细胞体积分数为0.5%.取红细胞悬浮液
1mL,加人100mmol/LH20:
(空白管不加H202)
及多糖溶液1mL,37oC温育1h,加入4倍量生理
盐水稀释,3000r/min离心6min,上清液于415
nm处测吸光度].溶血按下式计算抑制率,用线
性回归求算Ic
(4)多糖对小鼠肝匀浆脂质过氧化作用的测
定.小鼠眼球取血后,迅速分离肝组织,将肝组织
用冰冷的Tris—HC1缓冲液(20mmol/L)经研磨棒
制备成20%的肝匀浆.使反应体系中含肝匀浆液
0.2mL,FeSO的终浓度为)l0I~mol/L,Vc的终浓
度为0.1mmol/L,及不同浓度的多糖,在37℃温
浴1h,保温结束后加入20%三氯乙酸(TCA)1.0
mL终止反应,混匀,再加入0.67%硫代巴比妥酸
(TBA)1.5mL,沸水浴加热15rain.离心去除蛋白
质沉淀后,于532nm测定吸光度(以Tris~HC1
缓冲液为空白),按下式计算抑制率:
1.2.5数据处理实验结果以均值4-标准差表
示.采用t检验对实验结果进行分析,P<0.05表
示差异显著,P<0.O1表示差异极显著.
2结果与分析
2.1多糖洗脱级分及洗脱曲线
本实验收集到2个分级产物,分别命名为
第4期周妍,等:
叉鞭金藻多糖的分离纯化及体外抗氧化作用研究291
DAP一1和DAP一2.由图1可见,2种组分的多糖
的洗脱曲线均为窄、锐且形状对称的单峰,表明2
种组分多糖的分子质量范围区间均较小,可看作
均一组分多糖.
图1叉鞭金藻多糖的洗脱曲线
Fig.1ElutioncurveofpolysaccharidefromDicrateriasp.
2.2多糖纯度和分子量测定结果
从图2、3可以看出,DAP一1和DAP一2在
HPLC中均呈现为单一对称尖峰,表明二者均为
均一多糖组分.根据标准曲线可得DAP一1和
DAP一2的平均均分子质量分别为1.86×10。
和
6.9×10.
2.3DAP对羟自由基(OH·)的清除作用
将多糖溶液经稀释后依次得到6个浓度梯度
的样品(2.0,1.0,0.5,0.25,0.125,0.0625mg/
mL),以考察其对羟自由基(OH·)的清除作用.
结果表明低浓度时(终浓度小于0.02mg/mL)
DAP一1和DAP一2对羟自由基的清除作用较差,
随着浓度的增加,对OH·的消除作用逐渐增强,
半数抑制率Ic∞分别为0.102、0.059mmL.经t
检验结果分析可得,终浓度高于0.02mg/mL,
DAP一2对OH·的清除作用与DAP一1相比有显
著性(P<0.05)或极显著性差异(一P<0..01),
表明DAP-2对羟自由基(OH·)的清除作用明显
高于DAP一1.
DAP一1和DAP一2.由图1可见,2种组分的多糖
的洗脱曲线均为窄、锐且形状对称的单峰,表明2
种组分多糖的分子质量范围区间均较小,可看作
均一组分多糖.
图1叉鞭金藻多糖的洗脱曲线
Fig.1ElutioncurveofpolysaccharidefromDicrateriasp.
2.2多糖纯度和分子量测定结果
从图2、3可以看出,DAP一1和DAP一2在
HPLC中均呈现为单一对称尖峰,表明二者均为
均一多糖组分.根据标准曲线可得DAP一1和
DAP一2的平均均分子质量分别为1.86×10。
和
6.9×10.
2.3DAP对羟自由基(OH·)的清除作用
将多糖溶液经稀释后依次得到6个浓度梯度
的样品(2.0,1.0,0.5,0.25,0.125,0.0625mg/
mL),以考察其对羟自由基(OH·)的清除作用.
结果表明低浓度时(终浓度小于0.02mg/mL)
DAP一1和DAP一2对羟自由基的清除作用较差,
随着浓度的增加,对OH·的消除作用逐渐增强,
半数抑制率Ic∞分别为0.102、0.059mmL.经t
检验结果分析可得,终浓度高于0.02mg/mL,
DAP一2对OH·的清除作用与DAP一1相比有显
著性(P<0.05)或极显著性差异(一P<0..01),
表明DAP-2对羟自由基(OH·)的清除作用明显
高于DAP一1.
图2DAP一1的高效液相色谱图
Fig.2High—performanceliquidchromatographyofDAP一1
2.4DAP对超氧阴离子(O·)的清除作用
从图5可知,不同浓度的DAP一1和DAP一2
对超氧阴离子(O·)均有较好的清除作用(一
P<0.01),且随浓度增大,对O·的清除率也
呈上升趋势,在终浓度为0.167mg/mL,清除率分
别达到67.5%和74.4%,高于此浓度,清除率趋
于定值稳定.经t检验分析,各浓度组(终浓度为
0.04mg/mL除外)DAP一2对超氧阴离子(O
·)的清除率均显著或极显著高于DAP一1(