浅论人CD44基因真核表达载体构建及在乳腺癌细胞中的表达.docx

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浅论人CD44基因真核表达载体构建及在乳腺癌细胞中的表达

浅论人CD44基因真核表达载体构建及在乳腺癌细胞中的表达

【摘要】目的：

从人类乳腺癌耐多柔比星细胞株细胞细胞中。

方法：

从MCF7/Adr细胞中提取总RNA进行RTPCR，获得全长的cDNA模板；将含有CD44基因的cDNA模板使用限制性内切酶进行双酶切获得带有酶切位点的CD44基因,再将带有酶切位点的CD44基因经TA克隆后测序验证，然后亚克隆入真核表达载体中，双酶切鉴定后再次测序验证。

脂质体法将CD44质粒转染到MCF7细胞中，48小时后RTPCR和流式细胞术检测转染前后CD44基因、蛋白在MCF7细胞的表达变化。

结果：

成功从人MCF7/Adr细胞中克隆获得CD44基因并构建真核表达载体，转染后在MCF7中检测到CD44基因mRNA和蛋白水平表达上调；将上述表达CD44基因及蛋白的瞬时转染MCF7细胞经G418筛选两周后获得阳性克隆。

结论：

成功克隆和建立人CD44基因真核表达质粒；CD44能在MCF7细胞中表达；在MCF7/Adr中新发现一种CD44基因的变异体（基因库号FJ216964）；这为进一步研究其基因功能打下了基础。

【关键词】CD44；多药耐药；侵袭；乳腺癌

［Abstract］Objective:

TocloneCD44genefrommultidrugresistanthumanmammarycarcinomacells（MCF7/Adr）andconstructitseukaryoticexpressionvector.WhichwastransfectedintoMCF7cellstoobtainposition：

ThefulllengthcDNAencodingCD44wasobtainedbyRTPCRfromthetotalRNAisolatedfromtheMCF7/AdrcellsandclonedintopMD19Tvector.TheCD44genesequenceandreadingframewereconfirmedbytworestrictionenzymesandnucleotidessequencing,theninsertedintheeukaryoticexpressionvector　TherecombinantvectorCD44wastransfectedintoMCF7cells,andtheexpressionchangesofCD44geneandproteinweredetectedat48hourlater,respectively.Results：

CD44genewasclonedfromMCF7/Adrcells,anditseukaryoticexpressionvectorwasconstructedsuccessfully.Aftertheidentificationandsequencing,thereconstructedplasmidwasconfirmedcontainingthesequenceofCD44gene.Aftertransienttransfection,themRNAandproteinlevelofCD44genewereobviouslyupregulatedinMCF7cells.ScreenedwithG418fortwoweeks,positiveclonewasobtainedfromtheabovecells.Conclusion：

TheexpressionvectorCD44wasconstructedsuccessfullyandcouldbeexpressedinhumanmammarycarcinomacells.AnewCD44isoformswasfoundinMCF7/Adrcells（GeneBank）；OurstudymaystartanewapproachtostudythefunctionofCD44geneandprovideamethodofgenetherapy.

［Keywords］CD44；multidrugresistance；invasion；humanmammarycarcinomacells

CD44分子是一类重要的尚未归类的黏附分子,于1980年由Dalchau等［1］用单克隆抗体技术检测并最初发现,而后经过学者认定属于同一CD44家族。

它是一种跨膜糖蛋白并且是透明质酸（HA）的主要受体。

CD44分子的主要功能包括作为导向性受体调节淋巴细胞在血液及淋巴液中运行；促进成纤维与淋巴细胞等与细胞外基质成分HA、硫酸软骨素等的黏附。

最新研究表明CD44分子的异常表达还可显着提高恶性肿瘤细胞的转移能力,与恶性肿瘤的侵袭、转移及耐药密切相关。

Sheridan等［2］认为CD44+/CD24-的乳腺癌细胞亚群表达更高水平侵袭相关基因，因此具有更高的侵袭特性。

然而，对于CD44在肿瘤侵袭中所起的作用目前仍存在争论；Lopez等［3］认为CD44在肿瘤细胞中的表达可以阻止肿瘤细胞的转移。

因此，为了进一步明确CD44在肿瘤侵袭﹑多药耐药（MDR）及肿瘤生长中所起的作用，本实验拟构建表达CD44基因的真核表达载体，为深入研究CD44基因对恶性肿瘤细胞侵袭及耐药特异性的影响奠定基础。

1材料与方法

　实验材料

乳腺癌耐药细胞株（MCF7/Adr）及敏感细胞株（MCF7）购自中国科学院上海细胞库；胎牛血清购自杭州四季青公司；RTPCR试剂盒购自Fergma公司；高保真Taq酶、T4连接酶、pMD19T载体、凝胶回收试剂盒购自TaKaRa公司；质粒小提、大提试剂盒购自艾思进公司；1640培养基（含10％胎牛血清、%碳酸氢钠），％含EDTA的胰蛋白酶，Trizol，OptiMEMⅠ低血清培养基（OptiMEM），Lipofectamine2000转染试剂盒、G418购自Invitrogen公司；限制性内切酶EcoRⅠ，KpnⅠ购自NEB公司；感受态大肠杆菌（DH5α）、真核表达载体由江苏大学基础医学和医学技术学院许文荣教授惠赠；FITC抗人CD44抗体购自eBioscience公司；引物合成及质粒测序均交上海生物工程有限公司完成；细胞培养箱及超低温冰箱（Forma公司）；倒置显微镜（Olympus公司）；PCR仪（ABI公司）；凝胶成像系统（Syngene公司）；流式细胞仪（BD公司）。

　方法

　CD44在人乳腺癌细胞株中表达采用RTPCR鉴定人乳腺癌敏感细胞株MCF7及耐药细胞株MCF7/Adr中CD44基因的表达。

取2×106个处于对数生长期的MCF7及MCF7/Adr细胞消化后离心收集，加入1mlTrizol，按照说明书提取细胞总RNA并逆转录成cDNA。

采用引物设计软件Primer设计人CD44基因（基因库号AJ251595）片段引物（引物序列见表1中CD441）。

PCR反应体系：

H2O　μl，10×缓冲液μl,MgCl2　μl,dNTP　μl,Taq酶μl,上游引物μl,下游引物μl,cDNA　μl。

PCR扩增条件为94℃5min预变性，94℃30s，65℃30s,72℃2min,30个循环；72℃10min延伸结束反应。

同时以β肌动蛋白作为内参。

PCR产物行1％琼脂糖凝胶电泳鉴定。

表1基因引物序列

Tab1Sequencesofgeneprimer

基因名称引物序列产物大小（bp）退火温度（℃）CD441上游引物5′GGATGGACAAGTTTTGGTGGCACG3′102365下游引物5′GGTTACACCCCAATCTTCATGTCC3′CD442上游引物5′GGGAATTCATGGACAAGTTTTGGTGGCACG3′102366下游引物5′GGGGTACCTTACACCCCAATCTTCATGTCC3′β肌动蛋白上游引物5′CTCGCGCTACTCTCTCTTTC3′33058下游引物5′CATGTCTCGATCCCACTTAAC3′

采用流式细胞术检测MCF7及MCF7/Adr细胞中CD44蛋白表达。

取1×106个处于对数生长期的MCF7及MCF7/Adr细胞消化离心并收集，冷PBS洗3次,1500r/min离心5min,弃上清,加入CD44单抗1μl。

避光4℃染色30min后,加PBS洗1次,1000r/min离心5min,弃上清,加mlPBS缓冲液，上机检测，数据用CellQuest软件处理。

　CD44真核表达载体的构建CD44基因克隆：

取×106个处于对数生长期的MCF7/Adr细胞消化离心收集加入1mlTrizol，按照说明书提取细胞总RNA并逆转录成cDNA。

采用引物设计软件Primer在上述上下游引物中分别引入限制性内切酶位点EcoRⅠ和KpnⅠ,并加入2个保护性碱基GG（引物序列见表1中CD442）。

采用高保真Taq酶进行PCR扩增，体系为：

ddH2O　μl，10×缓冲液5μl，dNTP4μl，高保真Taq酶μl，上游引物1μl，下游引物1μl，MCF7/AdrcDNA1μl。

扩增条件为94℃5min预变性；94℃30s，66℃30s，72℃1min,30个循环；72℃10min延伸结束反应。

PCR产物于1％琼脂糖凝胶电泳后切胶回收，并参照胶回收试剂盒说明书对PCR产物进行回收纯化。

TA克隆：

TA克隆体系包括pMD19simplevector　μl，PCR纯化产物2μl，ddH2O　μl，solutionⅠ5μl；16℃连接过夜。

从-70℃冰箱取1支100μlDH5α冰上融化后加入连接产物轻柔混匀，冰上放置30min；42℃水浴热激90s，迅速转移到冰中冷却1～2min；加入800μlLB培养基,37℃﹑摇床200培养45min后，3000r/min离心3min，弃上清。

菌体沉淀均匀涂布于氨苄青霉素平板（50μg/ml），待吸收后置于37℃孵育箱中，培养12～16h。

灭菌枪头挑取3～5个单个菌落，置4mlLB液体培养基温度37℃,摇床200r/min,培养过夜。

提取质粒并测定含量。

EcoRⅠ，KpnⅠ进行双酶切反应验证。

反应体系为:

2μl10×NEB缓冲液,1μl质粒DNA（μg/μl）,　μlEcoRⅠ（10U/μl）,　μlKpnⅠ（10U/μl）,BSA　μl,加灭菌去离子水到20μl，37℃酶切过夜，1%琼脂糖凝胶电泳验证。

将含阳性质粒的转化菌送上海生工生物工程技术服务有限公司测序。

CD44真核表达载体的构建：

KpnⅠ和EcoRⅠ分别双酶切真核表达载体和CD44TA克隆质粒。

反应体系：

缓冲液I5μl,KpnⅠ（10U/μl）1μl,EcoRⅠ（10U/μl）1μl,质粒（或CD44TA克隆质粒）4μg，BSA　μl，加灭菌去离子水到50μl；37℃酶切过夜。

1%琼脂糖凝胶电泳分别回收后进行定向连接反应。

体系为:

0×连接酶缓冲液1μl,载体DNA（约100