艾滋病初筛中心实验室标准操作程序SOP.docx

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艾滋病初筛中心实验室标准操作程序SOP

艾滋病初筛中心实验室

标准操作程序

（SOP）

编号：

TJKHIV001

机构名称：

亭湖区疾病预防控制中心

实验室名称：

亭湖区疾控中心艾滋病初筛实验室

实施日期：

2010年1月6日

前言

本标准操作程序（SOP）根据《全国艾滋病检测技术规范2009》的要求，由亭湖区疾病预防控制中心实验室全体人员参与编写。

主要起草人：

张贵马，审核人：

花长庚。

根据《全国艾滋病检测技术规范2009》的要求，实验室编写了相关的SOP文件，以适应HIV抗体检测的相关需要。

为全社会的艾滋病检测工作提供科学的、准确的检测服务。

一些相关的制度及规范，可以为实验提供准确的结果并为实验人员及环境提供良好的保护作用。

本标准操作程序（SOP）覆盖了实验室全部工作内容，主要包含以下内容：

一、样品的采集、运输、接收、登记、保存、处理（编号：

TJKHIV001-01）

二、检测方法和步骤（编号：

TJKHIV001-02）

三、仪器的使用、维护、校准（编号：

TJKHIV001-03）

四、实验中的质量控制（编号：

TJKHIV001-04）

五、结果解释与报告（编号：

TJKHIV001-05）

六、保密程序（编号：

TJKHIV001-06）

七、检测数据的记录与保存（编号：

TJKHIV001-07）

八、追踪与处理（编号：

TJKHIV001-08）

九、实验室的清理与消毒（编号：

TJKHIV001-09）

一十、实验室的安全防护（编号：

TJKHIV001-10）

本标准操作程序（SOP）至编写完成并审核通过之日起开始实施，每年由实验室主管负责组织岗位人员进行修订。

所有岗位人员要在所从事工作的SOP文件上签名并认真阅读掌握相关内容。

审核人（签字）：

____________

一、样品的采集、运输、接收、登记、保存、处理…………………………………4

1样品接收、登记、运输及处理办法……………………………………………4

2样品采集…………………………………………………………………………5

二、检测方法和步骤…………………………………………………………………７

1检测程序………………………………………………………………………７

2艾滋病抗体初筛检测常用的方法………………………………………………8

3丽珠试剂检测方法和步骤………………………………………………………8

4万泰试剂检测方法和步骤………………………………………………………9

三、仪器的使用、维护、校准…………………………………………………………10

1仪器使用制度……………………………………………………………………10

2仪器设备的管理、使用、维修、报废制度……………………………………11

3仪器的使用、维护及校准方法与记录表样……………………………………12

4仪器档案………………………………………………………………………14

四、实验中的质量控制………………………………………………………………15

1质控血清的制备和保存………………………………………………………15

2质控图的建立与应用…………………………………………………………16

五、结果解释与报告…………………………………………………………………19

1HIV抗体筛查报告……………………………………………………………19

2HIV抗体阳性送检单…………………………………………………………19

3自愿咨询检测报告单…………………………………………………………19

六、保密程序……………………………………………………………………………20

七、检测数据的记录与保存……………………………………………………………21

1原始记录………………………………………………………………………21

2结果登记表样…………………………………………………………………21

3数据记录的保存………………………………………………………………21

八、追踪与处理………………………………………………………………………221

九、实验室的清理与消毒……………………………………………………………23

1HIV实验室消毒方法…………………………………………………………23

2HIV实验室消毒规范…………………………………………………………23

3HIV实验室废弃物处理规范…………………………………………………24

4HIV实验室废弃物处理登记表样……………………………………………25

十、实验室的安全防护……………………………………………………………26

1实验室安全制度……………………………………………………………26

2实验室分区…………………………………………………………………27

3实验人员安全防护…………………………………………………………27

4标本的安全防护……………………………………………………………29

附表

SOP文件

共2页

一

岗位人员

签字

编写

杨远锋

样品的接收、登记、处理

编写日期

2007-1-4

修订

张贵马

编号：

TJKHIV001-01

修订日期

2007-1-5

目的

掌握样品接收、运送及处理

应用范围

样品接收、运送及处理

1.样品接收、运送及处理办法

1.1样品接收

1.1.1由经过培训的、穿戴防护衣的实验人员在具有处理感染源设备的实验室内接收。

装标本的包裹或容器须消毒。

1.1.2核对样品与送检单，检查样品管有无破损或溢漏。

若发现有破损或溢漏的应立即将尚存的标本移入新管中，对破损或溢漏的样品管进行消毒，同时报告有关领导。

1.1.3检查样品的状况，记录有无严重溶血、微生物污染、血脂过多以及黄疸等情况。

如果污染过重或者认为样品不能被接受，则应将样品安全废弃。

并要将样品情况立即通知送样人。

1.1.4打开标本容器时要小心，以防内容物泼溅。

样品处理时若内容物有可能溅出，则应在生物安全柜中戴手套进行。

同时应戴口罩、防护眼镜，以防皮肤或粘膜污染。

1.1.5接收样品时应填写样品接收单。

样品接收登记表样（见附件1）

1.2样品运送

1.2.1实验室间传递的样品应为血清或血浆，除特殊情况外一般不运送全血。

1.2.2应采用WHO提出的三级包装系统 第一层容器：

装样品，要求防渗漏。

样品应置于带盖的试管内，试管上应有明显的标记，标明样品的编号或受检者姓名、种类和采集时间。

在试管的周围应垫有缓冲吸水材料，以免碰碎。

随样品应附有送检单，送检单应与样品分开放置。

  第二层容器：

要求耐受性好、防渗漏、容纳并保护第一层容器，可以装若干个第一层容器。

将试管装入专用带盖的容器内，容器的材料要易于消毒处理。

第三层容器：

放在一个运输用外层包装内，应易于消毒。

在第三层容器外面要贴标签（数量，收、发件人）。

1.2.3血清和血浆样品应在2-8℃条件下由专人运送。

用于CD4+/CD8+T淋巴细胞测定的样品应在室温下18-23℃运送。

每一包装的体积以不超过50ml为宜。

1.2.4运送感染性材料必须有记录。

1.2.5如分离血浆仍有困难，可直接将抗凝血-20℃以下冻存，采用冰壶冷藏运输，避免冻融。

1.2.6特殊情况下如需对个别样品进行复测，可以用特快专递形式投寄，但必须按三级包装系统将盛样品的试管包扎好，避免使用玻璃容器，以保证不会破碎和溢漏。

1.3处理:

血清、血浆标本在检测前或运送前需离心（3000转/min15min）、灭活（56℃30min）。

保存期限已过的标本，需经过焚烧处理并有处理记录。

1.3.1保存

1.3.1.1用于抗体检测的血清或血浆样品，应存放于-20℃以下，短期（1周）内进行检测的样品可存放于2-8℃。

1.3.1.2用于抗原和核酸检测的血浆和血细胞样品应冻存于-20℃以下，进行病毒RNA检测的样品如需保存3个月以上应置于-80℃。

1.3.1.3用于CD4+/CD8+T淋巴细胞测定的样品不能长期保存，样品采集时间超过48h则不可检测。

1.3.2废弃处理

标本一般保存1年以上，过期后进行处理。

采用焚烧法，有处理记录。

2.样品的采集

艾滋病检测最常用的样品是血液，包括血清、血浆和全血。

唾液或尿液有时也可作为测试样品。

常用的血液样品的采集和处理方法如下：

２.1.1血清样品采集和处理

２.1.1.1用一次性注射器（或真空采血管）抽取一定量静脉血，室温下自然放置1~2h，待血液凝固、血块收缩后再用3、000r/min离心15min，吸出血清备用。

２.1.1.2如用滤纸片采样，则手指或耳垂局部严格按常规进行消毒，在刺破皮肤后，迅速把滤纸片沾上，切勿让血液滴落在其它物体表面造成污染。

采血后要待血样干燥后再包装送检。

２.1.2抗凝血样品采集和处理

２.1.2.1用加有抗凝剂的真空采血管（或一次性注射器抽取静脉血，转移至加有抗凝剂的试管），反复轻摇，分离血浆和血细胞备用。

２.1.2.2应根据实验要求选用适当的抗凝剂，如CD4+/CD8+T淋巴细胞测定可选用K3EDTA或肝素或枸橼酸钠，HIV病毒分离、核酸定性/定量检测可选用K3EDTA或枸橼酸钠。

２.1.2.3用于核酸定性检测时，采集的抗凝全血应在4~8h内分离PBMC和血浆，否则应在24~48h内分离血浆和血细胞。

２.1.3采集样品注意事项

２.1.3.1采集样品原则上应按临床采血技术规范操作（试剂盒说明书有特殊要求除外）。

２.1.3.1采集样品时应注意安全，建议采用真空采血管及蝶形针具，以避免直接接触血液；直接接触HIV感染者/艾滋病（AIDS）病人血液/体液的操作,应戴双层手套。

SOP文件

共3页

二

岗位人员

签字

编写

杨远锋

检测方法和步骤

编写日期

2007-1-4

修订

张贵马

编号：

TJKHIV001-02

修订日期

2007-1-5

目的

熟练掌握检测方法、步骤

适用范围

HIV抗体检测

1.检测程序

样品

ELISA-1阴性

阳性

ELISA-1+ELISA-2

两种均阴性

两种均阳性

一阴一阳

2.艾滋病抗体初筛检测常用的方法

HIV抗体检测分为筛查试验（包括初筛和复检）和确认试验。

筛查试剂：

必须是经国家食品药品监督管理局注册批准、由临检中心批批检合格、在有效期内的试剂。

筛查方法：

（一）常用的筛查方法是酶联免疫试验（ELISA）：

目前国内外主要使用第三代（双抗原夹心法）试剂，少数使用第二代试剂。

我实验室使用第三代ELISA试剂，目前主要使用丽珠、万泰试剂（国家下拨）。

（二）快速检测（RT）及其它检测：

1、明胶颗粒凝集试验（PA）；2、斑点EIA或称斑点ELISA（dot—EIA）；3、斑点免疫胶体金（或胶体硒）快速试验；4、艾滋病唾液检测卡；5、其它快速筛查试验方法：

家庭HIV检测、尿液检测等。

我实验室主要有PA试剂、胶体硒快速试剂（国家下拨）。

3.丽珠试剂检测方法和步骤

方法：

酶联免疫吸附（ELISA）

步骤:

1．样品、试剂、酶标板条室温平衡30分钟。

2．温育期间配制洗涤液：

取20×洗涤液ml，加蒸馏水ml。

3.将酶联反应板从密封袋中取出，取下条板条，放在板架上。

按顺序编号，设一个空白对照孔，两个阳性对照孔，三个阴性对照孔。

4．取阳性对照和阴性对照分别充分混匀后各50µl加入对照孔中，空白孔不加液，其余每个孔加待检血清50µl，轻轻振荡，充分混匀。

并填写加样顺序表。

5．用不干胶封片封盖反应板，置37℃温育30分钟。

6．撕去贴膜，用洗涤液洗5次（洗板机洗，程序已编好），然后在吸水纸上拍干。

7．除空白孔外每孔加酶标抗原50µl，用不干胶片封盖反应板。

37℃温育30分钟。

8.撕去贴膜，用洗涤液洗5次（洗板机洗，程序已编好），然后在吸水纸上拍干。

9．每孔加底物缓冲液50µl，底物液50µl，轻轻振荡后置37℃避光显色30分钟。

10.每孔加终止剂50µl。

混匀。

11．选择酶标仪450nm和620nm双波长测定，用空白孔调零点，测定各孔的吸光度。

并打印结果。

符合以下条件的实验成立：

阴性对照平均值≤0.12阳性对照平均值﹥0.80

临界值=阴性对照平均值+0.15当阴性对照平均值≤0.08时，按0.08计算。

4.万泰试剂检测方法和步骤

方法：

酶联免疫（ELISA）

步骤:

1.样品、试剂、酶标板条室温平衡30分钟。

2.配制洗涤液，取Ⅹ浓缩洗涤液ml，加去离子水ml（稀释）备用。

3.取条板条，放在板架上，撕去板条上的封条。

4.在确定的板孔中加入100µl的标本或阴阳性对照，震荡混匀。

设1个空白对照，3个阴性对照和及1个HIV-Ⅱ阳性对照，并填写加样顺序表。

5.在微板上盖上贴膜（洗板前撕去贴膜），37℃孵育30±2分钟。

6.用洗板机洗板，每孔5次（程序已编好）。

最后拍干。

7.在每孔中加入100µl酶标试剂，空白孔除外。

37℃孵育30±2分钟。

8.用洗板机洗板，每孔5次（程序已编好）。

最后拍干。

9.每孔加入显色剂A、B各50µl，轻轻振荡混匀。

10.封板膜封板后37℃闭光显色15±1分钟。

11.每孔加入50µl终止液，轻轻振荡混匀，终止反应。

12.在450nm和620nm双波长读取每孔的吸光度，并打印结果。

分析：

符合以下条件的实验成立：

阴性对照平均值≤0.10阳性对照平均值≥0.80

结果分析：

结果临界值=阴性对照平均OD值+0.12

SOP文件

共3页

三

岗位人员

签字

编写

杨远锋

仪器的使用、维护、校准

编写日期

2007-1-4

修订

张贵马

编号：

TJKHIV001-03

修订日期

2007-1-5

目的

对仪器的正确管理

适用范围

HIV抗体检测的所有仪器设备

1.仪器使用制度

　　仪器设备是实验室检测工作的物质基础和技术条件，是国有资产的组成部分，是重要的卫生资源。

仪器贴有红、黄、绿三色标识，有唯一编号。

（1）、用仪器前必须熟读使用说明书或实验指导，熟练掌握仪器性能和使用方法，并在仪器负责人或教师的同意和指导下，才能开启仪器。

（2）、仪器使用过程中必须严格遵守仪器的具体操作程序，不得擅自做与实验无关的内容。

操作前要熟知使用注意事项。

使用后，操作人应认真检查仪器状态，擦净仪器，断电后方可离去，如有损坏要及时上报，检修。

（3）、对仪器要经常性的保养，定期检查，认真填写实验记录及仪器使用记录。

（4）、实验仪器不准随便乱动，否则造成仪器设备损坏者，要追究其责任，认真处理。

1.1安图2010型酶标仪操作程序

1.1.1检测读数前接通电源，打开电脑、打印机、酶标仪。

1.1.2打开酶标仪工作站，输入密码，选定检测项目（若需重新设定检测条件，要由仪器管理员设定）。

1.1.3放入待测酶标板，开始检测（酶标板放置要正确）。

1.1.4保存、打印检测数据。

1.1.5检测完毕后，关机，切掉电源。

用75%的乙醇对仪器表面擦拭消毒。

1.2安图2010型洗板机操作程序

1.2.1洗板前接通电源。

1.2.2开机，选择清洗程序及所需通道，用50mL洗液灌洗管路。

1.2.3灌洗完毕后，选择洗板程序（提前由管理员设置完成）洗板。

1.2.4整个实验洗板完毕后，选择清洗程序选蒸馏水清洗，用50mL蒸馏水清洗管路。

1.2.5清洗完后，关机。

切掉电源。

用75%的乙醇对仪器表面擦拭消毒。

1.3水浴锅操作程序

1.3.1开机准备

1.3.2使用前检查水浴锅中是否有水，水浴锅加水应高于隔板，锅内放入被

处理样品不至于水溢出锅体。

1.3.3接通电源，打开水浴锅体开关，把控温设定数码调至所需要的温度上（37℃）。

1.3.4使用

1.3.5用温度计测定锅内温度（与电子显示比较），当温度上升到设定的温度值时开始计时，进行恒温水浴加热。

1.3.6使用完毕，应及时关闭锅体开关，断开电源。

1.3.7注意及维护：

1.3.7.1必须安装地线。

1.3.7.2禁止无水或水低于锅内隔板时加热。

1.3.7.3长期不使用最好把锅内水放掉，擦净。

1.3.7.4水浴锅内不得有杂物，保持锅体内外洁净。

1.3.7.5每周两次更换锅内水，以保持水的洁净。

2.仪器设备的管理、使用、维修、报废制度

2.1计划添置必要的仪器设备，按规定手续验收、登记，并经计量部门检定发证后才能使用，并建立仪器台帐。

2.2使用大型仪器设备的检定人员必须熟悉使用仪器的使用保养方法，并持有操作合格证；

2.3使用仪器时先检查仪器是否完好正常，按操作规程使用后进行登记，并注意做好仪器的清洁、保养工作；

2.4每台精密仪器必须按规定定期检查，检验合格后才能继续使用；

2.5仪器不得“带病”工作，发现故障应及时报告以便组织维修；

2.6精密仪器建专人保管使用制度，外来人员未经批准和考核不得单独操作使用；

2.7仪器确已损坏，无法修复时，邀请有关专家报废鉴定，填写仪器报废单，经主任批准后，按资产管理权限上报。

2.8.仪器管理人员职责

2.8.1 仪器管理人员应熟悉仪器、设备的使用方法及特性，做好仪器设备的管理。

2.8.2爱护仪器设备，正确使用，做好经常性的维护保养工作。

2.8.3定期对仪器进行检测，发现故障及时安排维修，提高设备完好率。

2.8.4严格遵守各项规章制度和工作流程，按照标准操作规程操作仪器。

2.8.5努力学习业务知识，提高技术水平。

2.8.6对新来实验室的人员进行如何正确使用仪器的指导。

2.8.7保持实验室的整齐清洁、防火、防盗，保证仪器设备正常运转。

2.8.8保持实验室的清洁卫生，实验室内不得任意堆放杂物，废物要及时清除，临时有用的物品要堆放整齐。

3.仪器的使用、维护及校准方法与记录表样（附件2）。

详见记录。

3.1ELISA洗板机与酶标仪维护、校准

每天：

每次操作要按要求设立对照。

核对酶标仪滤光片波长，检查洗板机管道是否通畅，是否有漏液现象。

每周：

清洁仪器表面，保护光学零件，不沾灰尘。

每月：

洗涤时检查各孔是否与相应的冲洗头对位良好，负压是否符合规定要求，这是保证各孔洗涤均衡一致的前提。

每年：

检查、清洗滤光片，如果滤光片出现破裂或霉点则要更换，根据仪器内具有

的校准程序或使用校准板，对滤光片的所用波长光密度的精密度进行校验，测定20次，计算精密度。

精密度应该控制在厂家说明书中所规定的范围（建议请厂方代表校验）。

校验结果要有记录，保留测定原始结果。

根据实际使用情况更换主要设备（如洗板机、全自动免疫分析系统）内的所有液体装置和管子（要求厂方代表维修）

3.2移液器（包括单头和多头移液器）维护、校准

是实验室中重要的基本器具，一年至少应该标定或校准二次，若发现移液器有异常情况，应该立即进行标定。

移液器标定方法包括吸取有色溶液进行光谱分析、吸取蒸馏水称量校准、吸取放射性同位素计数校准，以及使用配套校准盒等等。

特别要注意使用多头移液器时，必须保证每一个加样头都能够连续和准确的加样。

移液器的精密度可根据生产移液器厂家说明书中所规定的范围进行校准。

推荐在检测过程中，每个加样工序使用专用的移液器。

用蒸馏水称量标定移液器方法（参考芬兰Labsystems移液器标定方案）

在一室温为22℃的小型工作室（无风）中，在万分之一级别天平上放置一个小三角烧瓶，用待标定的移液器吸取蒸馏水（隔夜存放）加入小三角烧瓶内底部，每次称重后计量，去皮重后再加蒸馏水，连续加蒸馏水10次。

加蒸馏水的量根据待标定的移液器不同规格而不同，见下表。

移液器标定合格后，在移液器上贴上合格标签，标明日期。

在移液器标定记录中填写移液器规格、编码、10次标定称量、标定日期和标定人签名。

移液器10次标定称量在所要求的重量范围内为合格移液器；不合格移液器要根据移液器生产厂家所推荐的方法进行校准。

称重法校准移液器方案

移液器规格

蒸馏水量

要求重量范围

0.5~10μl

2μl

1.75~2.25mg

5~40μl

10μl

9.8~10.2mg

40~200μl

70μl

69.4~70.6mg

200~1000μl

300μl

298.0~302.0mg

1~5ml

2000μl

1990.0~2010.0mg

2~10ml

3500μl

3485.0~3515.0mg

4.仪器档案

仪器档案包括前期资料（仪器设备购置申请表、技术调研论证报告、招投标文件、订货合同、验收记录、装箱单、仪器使用说明书、操作手册等）；

使用资料（仪器操作作业指导书、历年的使用记录、历年的检定证书、历年维护维修、故障、改装记录、期间核查记录等）.

SOP文件

共4页

四

岗位人员

签字

编写

杨远锋

实验中的质量控制

编写日期

2007-1-4

修订

张贵马

编号：

TJKHIV001-04

修订日期

2007-1-5

目的

保证实验正确性

适用范围

HIV抗体检测质量控制

1.质控血清的制备和保存

1.1在每次实验中必须包含有内部对照质控血清和外部对照质控血清。

内部对照质控血清指试剂盒内提供的阳性和阴性对照血清。

内部对照是质量控制的基础。

每一次检测必须使用内部对照，而且只能在同批号的试剂盒中使用。

外部对照质控血清是为了监控检测的重复性和稳定性以及试剂盒批间或孔间差异而由实验室设置的一套对照血清，包括强阳性、弱阳性和阴性对照血清。

也可以只设置一个弱阳性对照，以该试剂盒临界值（Cut-off）的2-3倍为宜。

1.2外部对照质控血清的制备HIV抗体阳性和阴性血清，56℃30min灭活，3000r/min，离心15min。

弱阳性对照可以用HIV抗体阴性血清梯度稀释HIV抗体强阳性血清并标定后得到。

按一年使用量配制（可加入不影响检测结果的防腐剂）用0.2μm滤膜过滤除菌。

1.3外部对照质控血清的保存按一周实验用量分装、分类、标记、封口、-20℃冻存于非自动除霜冰箱中。

外部对照血清不可反复冻融，一旦融化后应该存放2-8℃，供一周内使用。

1.4外部对照质控血清的使用每一次实验必须使用外部对照质控血清，以便监控实验的重复性和稳定性。

同时可以了解各批试剂盒的批间或孔间差异，绘制质量控制图。

1.5外部对照质控物的质量要求质控物的管间或瓶间变异必须小于监测系统预期的变异（cv＜20%），并且质控物的成分应在稳定状态中。

质控物应无菌，并不含有影响ELISA反应的防腐剂。

2.质控图的建立与应用

最常用的质控图是Levey-Jennings质控图，使用累计和技术或趋势分析技术的图形可提供系统偏移和漂移的状况。

2.1建立质控图参数

2.1.1外部对照质控物的平均值和标准差应建立在实验室常规使用方法对质控物重复测定的基础上。

一般采用在不同批次检测取得至少20个数据；如果仅做少量批次的检测，也至少做5个批次的检测，每个批次中不少于4个质控物测定结果，以建立一个临时性的平均值和标准差，当达到20批次数据后，替代临时性的平均值和标准差。

2.1.2算术平均