氟尿嘧啶聚丙交酯乙交酯聚乙二醇单甲基醚纳米粒的制备及体外释解析.docx

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氟尿嘧啶聚丙交酯乙交酯聚乙二醇单甲基醚纳米粒的制备及体外释解析

基金项目：

黑龙江省青年科学基金项目（QC2011C104）；黑龙江省卫生厅科研课题（No．2009-136）；哈尔滨医科大学附属第二医院院青年基金项目（QN2009-03）作者简介：

纪宏宇，女，硕士，主管药师研究方向：

药物新剂型与新技术

*

通讯作者：

吴琳华，女，教授，硕士生导师研究方向：

药物

新剂型与新技术Tel：

（0451）86665559

E-mail：

jihongyu1979@126.com

氟尿嘧啶聚丙交酯乙交酯-聚乙二醇单甲基醚纳米粒的制备及体外释放的研究

纪宏宇

1，2，3

，谷宏伟1，3，唐景玲3，刘红梅1，2，3，于明涛1，3，吴琳华

1，2，3*

（1．哈尔滨医科大学第二附属医院药学部，哈尔滨

150086；2．黑龙江省高校重点实验室，哈尔滨150086；3．哈尔滨医科大学药学院，哈尔滨150086）

摘要：

目的制备氟尿嘧啶聚丙交酯乙交酯-聚乙二醇单甲基醚（PLGA-mPEG）纳米粒，并对其体外释放特性进行研究。

方法

采用纳米沉淀法制备氟尿嘧啶PLGA-mPEG纳米粒，采用高效液相色谱法进行包封率的测定。

在单因素实验的基础上，通过正交实验优化处方和制备工艺。

采用动态膜透析法对纳米粒子的体外释药特性进行研究。

结果制备的纳米粒为较均匀

的类球形粒子，平均粒径约124.3nm，Zeta电位－20.6mV，平均包封率为（44.72ʃ0.38）%。

体外释药实验研究表明，粒子在

2h的突释量小于30%，在突释后的48h内药物缓慢释放。

结论纳米沉淀法操作简单，制备的氟尿嘧啶PLGA-

mPEG纳米粒粒径小，体外药物释放具有良好的缓释效果。

关键词：

氟尿嘧啶；纳米粒；纳米沉淀法；体外释放中图分类号：

R944

文献标志码：

A

文章编号：

1001－2494（2011）23－1814－05

StudyonPreparationandinVitroReleaseCharacteristicsof5-FluorouracilLoadedPLGA-mPEGNanop-articles

JIHong-yu1，2，3，GUHong-wei1，3，TANGJing-ling3，LIUHong-mei1，2，3，YUMing-tao1，3，WULin-hua1，2，3*

（1.De-

partmentofPharmacy，TheSecondAffiliatedHospitalofHarbinMedicalUniversity，Harbin150086，China；2.KeyLaboratoryofMedi-cationsResearch，CollegeofHeilongjiangProvince，Harbin150086，China；3.CollegeofPharmacy，HarbinMedicalUniversity，Har-bin150086，China）ABSTRACT：

OBJECTIVEToprepare5-fluorouracilloadedPLGA-mPEGnanoparticles（5-FPN）andstudyitsreleaseprofile

invitro.METHODS

5-FPNwaspreparedbynano-precipitationmethod.Areversed-phasehighperformanceliquidchromatog-raphy（RP-HPLC）methodwasusedtodeterminetheentrapmentefficiencyof5-FPN.Basedonthesingle-factorexperiment，theformulationandpreparationprocessof5-FPNwasoptimizedusingorthogonaldesign.RESULTS

5-FPNhadregularspherical

appearancewithameandiameterof124.3nmandZetapotentialof－20.6mV，andentrapmentefficiencyof（44.72ʃ0.38）%.Inthereleaseinvitro，thecumulativepercentageofabruptlyreleaseddrugfromPLGA-mPEGnanoparticleswaslowerthan30%in2h.The5-FPNshoweddelayedreleasein48hafterthedrugdumping.CONCLUSIONThenano-precipitation

methodisconvenient.The5-FPNpreparedbynano-precipitationmethodhassmallerparticlesizeandpossessesgoodsustainedre-

leasecharacteristicsinvitro.

KEYWORDS：

5-fluorouracil；nanoparticles；nano-precipitation；releaseinvitro

氟尿嘧啶（5-fluorouracil，5-Fu）是抗代谢类的抗肿瘤药物，对增殖性细胞有较强的杀伤作用。

它是一种临床应用广泛的广谱抗肿瘤药物，在临床上

用于多种肿瘤的治疗，对消化道癌症以及卵巢癌、宫

颈癌、膀胱癌等多种肿瘤有明显疗效［1］。

目前临床

使用的大多是5-Fu普通注射液，由于5-

Fu注射液对肿瘤细胞的选择性低，在体内分布较广，故其对正

常细胞的毒性较大，易产生很多不良反应如骨髓抑

制、白细胞减少、血小板减少等［2］

。

因此为提高5-Fu的靶向性、降低不良反应、延长药物作用时间，研究开发5-Fu新型药物传递系统已成为近些年的研究热点。

纳米粒是近年来发展起来的一种新型药物传递系统，其在抗肿瘤药物中的应用受到广泛的关注。

·

4181·ChinPharmJ，2011December，Vol.46No.23

中国药学杂志2011年12月第46卷第23期

由于肿瘤组织血管丰富，纳米级粒子易穿透肿瘤部

位的血管并滞留于其中，

具有高通透性和滞留效应（enhancedpermeationandretention，EPR），故纳米粒

本身具有一定的肿瘤靶向性，

同时纳米粒还具有提高药物稳定性、

延长药物作用时间、提高药物的生物利用度等优点［3-4］

。

聚丙交酯乙交酯-聚乙二醇单甲基醚（PLGA-mPEG）作为一种新型载体材料具有良好的生物相容性和生物可降解性［5-6］

，有文献报道将抗肿瘤药物顺铂制备成PLGA-mPEG纳米粒，能够

减少药物的毒性，增强药物的被动靶向性，延长药物在体内的循环时间，进而明显的提高顺铂的治疗效果［7］

。

本实验即采用PLGA-mPEG，通过纳米沉淀法制备5-Fu纳米粒，并对其质量及释药特性进行研

究，为进一步研制开发高效、低毒、长效的新型5-Fu纳米粒制剂奠定实验基础。

1

仪器与试药

AEU－210精密电子天平（日本岛津公司）；CL－2磁力搅拌器（巩义市予华仪器有限责任公

司）；RE－52C旋转蒸发仪（巩义市英峪予华仪器

厂）；SHB－D型微型循环水真空泵（郑州长城科工贸有限公司）；TGL－16高速台式离心机（上海医药器械六厂）；高效液相色谱仪（美国Waters公司）；KQ3200E医用超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；Zetasizer3000HS激光粒径分析仪（英国Malvern公司）；TecnaiG2透射电镜（荷兰Philips公司）。

PLGA-mPEG（相对分子质量1200，山东济南岱

罡生物科技有限公司）；5-Fu（含量≥99.5%）（上海森灏精细化工有限公司，

批号：

20081030）；泊洛沙姆188、泊洛沙姆407（德国巴斯夫公司）；甲醇为色谱

纯；丙酮、

乙醇等其他试剂均为分析纯；蒸馏水（哈医大二院药学部自制）。

2方法与结果2.1处方和工艺筛选

2.1.1

单因素实验通过单因素实验分别考察了

有机溶剂的种类、水相温度、表面活性剂的种类和浓

度、药量、聚合物的质量、有机相的加入方式及搅拌时间对包封率的影响。

2.1.2

正交实验优化工艺处方在单因素实验的

基础上，对显著影响药物包封率的4个因素，即有机相组成、

水浴温度、药载比、表面活性剂的浓度，采用正交设计法进行处方优化。

每个因素选择3个水

平，按照L9（34

）进行实验，以包封率为主要评价指标确定最佳处方。

正交实验设计方案与结果见表

1，正交统计分析结果见表2。

由表2可知，此实验校正模型P＜0.05，具有统

计学意义。

由表1、2的结果进行综合分析，各指标因素的主次顺序为A＞B＞C＞D，其中A、

B两因素具有统计学意义（P＜0.05）。

A因素中kⅠ＞kⅡ＞kⅢ，B因素中kⅡ＞kⅢ＞kⅠ，C因素中kⅡ＞kⅠ＞kⅢ，D因素中kⅡ＞kⅢ＞kⅠ，因此得到的最佳处方为A1B2C2D2。

2.2氟尿嘧啶聚丙交酯乙交酯-聚乙二醇单甲基醚纳米粒（5-

FPN）的制备方法表1确定最佳处方的正交实验方案和结果Tab.1

Programandresultoforthogonaldesign

No.

Factor

Theratiooforganicphase

（V/V）（A）

Temperatureofwaterphase

/ħ（B）Theratioof5-FuandPLGA-mPEG（C）

Surfactantconcentration

/%（D）Entrapmentefficiency

/%16ʒ0301ʒ20.532.7526ʒ0401ʒ2.5144.6836ʒ0501ʒ31.534.3544ʒ2301ʒ2.51.529.3754ʒ2401ʒ30.531.9964ʒ2501ʒ2127.6373ʒ3301ʒ3122.6083ʒ3401ʒ21.529.119

3ʒ3501ʒ2.50.525.73

kⅠ37.2728.2429.8330.16kⅡ29.6635.2633.2631.64kⅢ25.8129.2429.6530.94R

11.47

7.02

3.61

1.48

·

5181·中国药学杂志2011年12月第46卷第23期ChinPharmJ，2011December，Vol.46No.23

本实验以PLGA-mPEG为载体材料，采用纳米沉淀

法制备纳米粒。

室温下称取20mg5-Fu与50mgPLGA-mPEG溶于6mL有机溶剂丙酮中作为有机

相，

将有机相以恒定速率滴入到40mL温度为40ħ搅拌的1%的泊洛沙姆188溶液中，得到有淡蓝色

乳光的纳米粒溶液，在1400r·min－1

的搅拌速度下搅拌20min，在35ħ减压条件下除去有机溶剂，所得溶液用0.8μm的微孔滤膜过滤，将滤液离心40min（20000r·min－1，4ħ）后收集纳米粒子即

得5-Fu纳米粒。

2.35-FPN包封率的测定

2.3.1

色谱条件色谱柱：

DiamonsilTM

C18（4.6

mmˑ250mm，5μm）；流动相：

甲醇-水（1ʒ9）；流速：

1.0mL·min－1；柱温：

30ħ；检测波长：

265nm；进

样量：

10μL。

在该条件下5-Fu的保留时间约为4.8min。

5-Fu与纳米粒辅料分离良好，辅料不干扰5-Fu的测定。

2.3.2

标准曲线的测定精密称取5-Fu约10mg置于100mL量瓶中，用流动相溶解后稀释至刻度，

混匀，制得100μg·mL－1

的贮备液。

分别精密吸取

贮备液1.0、3.0、4.0、5.0、6.0和8.0mL，置于10

mL量瓶中，用流动相稀释至刻度，得一定浓度的系列标准液。

以峰面积（A）为纵坐标，以质量浓度ρ

（μg·mL－1）为横坐标进行线性回归，得回归方程：

A=3.5570ˑ104ρ+1.9415ˑ104（r=0.9995）。

5-Fu在10100μg·mL－1线性关系良好。

2.3.3精密度实验分别取40、50、60μg·mL－1的低、中、高3种质量浓度的对照品溶液，于1d内

测定5次，

计算日内精密度；每1d进样1次，连续测定5d，计算日间精密度。

日内精密度和日间精密

度（RSD）均小于2%，符合要求。

2.3.4

回收率实验分别称取一定质量的空白纳

米粒制剂9份，加至40、50、60μg·mL－1的低、中、高3个质量浓度的对照品溶液中，每个浓度各制备3

份，将其完全分散后，离心取上清液进样测定，计算回

收率。

平均回收率为100.09%，

RSD为0.94%。

2.3.5包封率的测定采用高速离心法分离游离药物与纳米粒粒子，高效液相色谱法测定游离药物的含量。

载药纳米粒溶液离心40min（20000r·min－1，4ħ）后，收集上清液，进样10μL，记录峰面积，计算包封率。

测定了3批最佳处方工艺的5-FPN的包封率，结果平均包封率为（44.72ʃ0.38）%。

2.4

纳米粒的质量评价2.4.1纳米粒粒径、电位的测定

取载药纳米

粒，用蒸馏水稀释到适当的浓度，经激光粒度分

析仪测定，纳米粒的平均粒径为124.3nm，Zeta电位为－20.6mV。

粒度分布和Zeta电位分布分

别见图1，2。

2.4.2

形态观察将样品用蒸馏水适量稀释，采用

磷钨酸复染法，

通过透射电镜，观察纳米粒的粒子形态，透射电镜照片见图3。

从图3中可以看出，纳米

粒为较均匀的类球形粒子。

2.4.3

体外释药特性研究采用动态膜透析法进

行纳米粒体外释药实验。

分别精密量取3份处方量的冻干纳米粒约2mg，置于经处理过的透析袋内，加入1mL磷酸盐缓冲液（pH7.4）混匀，将袋口扎紧。

以100mL磷酸缓冲液（pH7.4）为释放介质，

转速为100r·min－1

，温度为（37ʃ0.5）ħ，在0.25、0.5、1、2、4、6、8、10、12、24、36、48h分别取样1mL，经0.8μm微孔滤膜过滤后，取10μL进样。

取样同时向体系中补充1mL释放介质。

通过下式计算纳米粒的累积释放百分率（Q）。

结果见图4。

Q%=

v0ˑρt+vˑ∑t－1

n=1ρn

W

ˑ100%

ρt－t时间点测得释放介质中的药物质量浓度（μg·mL－1）；v－每次取样体积（mL）；v0－释放介质的总体积（mL）；W－纳米粒的载药量（μg）；ρn－

各取样时间点的质量浓度（μg·mL－1

）。

表2正交实验结果方差分析表

Tab.2

Thestatisticanalysisoforthogonaldesign

Source

TypeIIISumofSquares

dfMeanSquareFPCorrectedModel312.8201）652.137

42.4770.0238503.29918503.2996927.8330.000A

204.8012102.40083.4280.012B82.799241.39933.7290.029C25.220212.61010.274

0.089

Error2.45521.227

Total

8818.5749Correctedtotal

315.275

8

·

6181·ChinPharmJ，2011December，Vol.46No.23中国药学杂志2011年12月第46卷第23期

如图4释放曲线所示，纳米粒子在2h时发

生突释现象，释放量小于30%。

在12h时，载体纳米粒的药物累积释放百分率达到50%左右。

在48h时，载体纳米粒的累积药物释放百分率达

到80%以上，

药物释放较完全。

体外释药实验结果表明，以PLGA-mPEG为载体的纳米粒具有明显的缓释特性。

3讨

论

3.1

目前常用于纳米粒的生物可降解载体材料有

聚氰基丙烯酸酯、聚酯、聚酰胺、聚酸酐等［8］

，其中应用最广泛的是聚乳酸（PLA）、聚羟基乙酸及乳酸/

羟基乙酸共聚物（PLGA）。

有报道称用PLA、PLGA作为载药微球、纳米粒的载体，可以起到保护药物、增溶、提高生物利用度及靶向释药等作用［9］

。

但是这两种材料具有严重的疏水性，限制了其在药物载

体领域中的应用。

本实验采用PLGA-

mPEG为载体材料，

PLGA连接亲水段mPEG后，增加了材料的亲水性，使材料具有两亲性。

同时由于亲水性PEG链的引入，能够抵制和逃逸网状内皮系统的吞噬，延缓粒子在体内循环系统的滞留时间，更有利于药物向有血管缺陷的肿瘤组织的渗透，进一步提高纳米粒的靶向性。

此外，本实验制备的纳米粒具有一定缓释特性，有效地降低了纳米粒中药物在浓集于肿瘤组织之前的大量释放，从而避免由此产生的全身毒副作用及药效降低的现象。

3.2

纳米粒的制备方法有乳化溶剂挥发法［10］

、纳米沉淀法［11］、高压均质法［12］

等。

本实验采用简单

易行、

操作安全的纳米沉淀法制备5-Fu纳米粒。

此方法中使用的有机溶剂毒性较低、易除去，避免了二氯甲烷等毒性大的有机溶剂的使用。

此方法制备的

粒子粒径较小，分散性和重现性较好。

3.3

本实验曾做过粒径为50nm左右的纳米粒，但

是其释放曲线的突释现象严重。

在3h左右药物累积释放量就达到了80%。

而由粒径为120nm左右的纳米粒的释放曲线可知，粒径为120nm左右的纳米粒子在48h时累积药量达到80%以上，具有很好的缓释特性。

由此可知，粒径的大小影响纳米粒的药物释放。

粒径较大的纳米粒的药物释放时间长，能够达到很好的缓释效果。

3.4

测定药物包封率时，需要将游离药物与包封药

物分离。

常见的方法有透析法、

凝胶柱层析法、超滤法等。

透析法耗时长、凝胶柱层析法设备复杂、超滤

法材料昂贵，而低温超速离心的方法设备操作简单

且分离效率高，因此本实验采用低温超速离心的方

法分离游离药物与纳米粒粒子，回收率实验结果表明，该方法可靠。

·

7181·中国药学杂志2011年12月第46卷第23期

ChinPharmJ，2011December，Vol.46No.23

3.5

对处方工艺影响因素的考察可知，有机相组成、

温度、水相浓度、药量与聚合物量的比例、有机相加入方法等因素对5-FPN的包封率有影响，前4个因素影响较显著。

在本实验中，通过验证实验结果表明最优处方的重现性好。

5-Fu微溶于水中，这可能是包封率不高的原因。

通过实验可知，粒子形成的搅拌时间和旋转蒸发时间过长都会使粒子的包封率下降，因此本实验拟进一步

采用冷冻干燥技术，将纳米粒子制备成冻干粉末，以提高粒子的稳定性。

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