收好这份 Protocol你就是鉴鼠专家.docx

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收好这份Protocol你就是鉴鼠专家

基因型鉴定是应用基因工程小鼠的过程中必不可少的步骤。

此时你的耳边有没有回响起：

啊——怎么又没P出来！

这样的哀嚎呢？

虽然这个工作很基础，但真的常常会遇到问题，并不是几个字——鼠尾DNAPCR——就简单搞定了。

究其原因往往在于你不曾注意的细节哦。

也许很多同学觉得整个基因型鉴定过程就只是PCR反应。

出了问题就拼命回想PCR过程中的操作：

有没有忘加引物、忘加DNA模板、忘加酶，这一类「一不留神」的失误......发现都OK的啊，然后就一脸茫然了......

其实，基因型鉴定中，小鼠基因组DNA的制备也直接决定结果的好坏。

DNA质量不高

为了能快速得到基因型结果，采用碱变性快速抽提DNA的方法，虽然过程很简单，但这样制备的DNA质量较差，很容易发生做不出结果的情况；或者使用直接PCR扩增试剂盒（将鼠尾在试剂中浸泡20分钟后取上清直接作为模板），由于试剂盒选择的种类比较多，不是所有的基因型鉴定方案都适合这种方式，特别是不同厂家的试剂盒扩增效率也不一样，如果发生PCR结果不理想的状况，还是建议用传统的DNA提取方法，先获得高纯度DNA模板，再进行PCR反应。

综合时间成本与成功率两大因素，利用裂解液加蛋白酶K配方裂解鼠尾，释放DNA，并通过酒精沉淀的方法得到纯度较高的DNA，是高效简便的小鼠基因组DNA制备方法。

Protocol如下，收好不谢！

小鼠基因组抽提Protocol

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蛋白酶K贮存液的配制：

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用超纯水彻底溶解蛋白酶K粉剂，使终浓度为10mg/mL，分装成1mL/vial，-20℃保存。

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裂解液的主要成分：

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SDS、EDTA、Tris/HCl、NaCl。

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小鼠尾基因组 DNA提取步骤：

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（1）剪取小鼠尾端约0.5厘米（视鼠龄及鼠尾粗细可调整，尽量使鼠尾体积相互接近），将鼠尾放入已编号1.5mL离心管中并盖好盖子。

（2）每管加0.5mL裂解液和50µL蛋白酶K贮存液并将盖盖紧。

（3）将离心管置于杂交管中并用纸团稍加固定。

（4）将离心管置杂交炉中，56℃转动过夜。

（5）次日将样本于室温，12,000rpm离心10min。

（6）上清倒入1.5mL离心管中，加1mL无水乙醇（约2倍上清体积），盖紧盖子后轻摇，可见絮状沉淀。

13,000rpm，15min，弃上清。

（7）加70%乙醇1mL，洗涤，13,000rpm离心10~15min，弃上清，收集沉淀，室温晾10~15min。

（8）每管加80~100µL灭菌水，盖好后置室温或37℃，1小时充分溶解。

在室温中放置数小时，待DNA全部溶解后-20℃保存，或直接进行PCR或杂交等实验。

如DNA溶解不完全，在37℃水浴中放置30~60min，但不可过夜。

DNA样品的OD260/280在1.8~2.0之间。

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注意：

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裂解鼠尾一定要充分，有条件尽量使用杂交炉。

因为如果裂解过程中组织与裂解液始终保持静止，而没有翻转的过程，这会导致DNA和鼠毛之类的杂质没有完全分开。

离心去除杂质的过程中，DNA就会随着这些杂质一起被抛弃了。

DNA模板浓度过高

做人不能太贪心。

DNA模板不是越多越好的。

一般建议将模板浓度控制在50~100ng/µL进行PCR扩增。

PCR酶不合适

DNA质量很好，浓度也控制在标准浓度，PCR还是做不出来，原因可能是PCR酶没有选择好，不同的PCR产物GC含量不一样，遇见GC含量很高的产物往往常规的PCR酶没法做出很好的结果。

一般在定制的基因工程小鼠鉴定方案中会指出适合的PCR酶的货号，按照已验证的方案以及推荐的酶体系，一般不会出错。

看一看基因工程小鼠的鉴定方案一般长什么样子：

上面的电泳图中你是不是发现了什么？

为什么转基因Cre小鼠的鉴定结果会有两条带？

除了待检测的样品以外，还有两个Control对照孔？

没错！

这里小编要提醒大家，对照Control的设置非常重要！

这恰恰是很多同学所忽略的。

在一般的Genotyping里面，每一次鉴定至少要设置一个 WTControl 和一个 H2O，也就是 BlankControl。

▶WTControl的意义：

1）帮助我们快速判断基因型。

在Flox小鼠或片段knockin小鼠的鉴定中，如果产物条带仅有一条或其中有一条与WTControl一致，那么可以判断该样本为WT或杂合子。

2）帮助我们判断PCR体系是否work。

如果PCR产物在跑电泳的时候连WTControl的样品都没有出条带，那么说明PCR体系有问题，需要做相应的调整，比如考虑更换引物或PCRmix等。

▶ BlankControl的意义：

H2O 对照主要是用来质控PCR体系是否发生了污染。

如果 H2O 对照都有条带，说明整个PCR体系存在污染的问题，这个PCR结果不可信。

▶ InternalPositiveControlPrimers的意义：

InternalPositiveControl一般用在随机插入转基因小鼠的鉴定中。

通常转基因鉴定引物是只针对插入的外源DNA序列的，所以没有发生随机整合的小鼠DNA模板不会有PCR产物产生。

这样一来很容易发生假阴性的问题。

也就是说电泳没有条带，我们无法判断到底是外源基因未整合的阴性结果，还是由于PCR体系本身的问题造成阴性结果。

所以需要另一对在所有小鼠中都能获得PCR产物的阳性对照引物作为内控，即InternalPositiveControl，用于判定PCR体系和模板质量是否合适。

PCR仪

如果PCR仪长期未做温度校准，那么仪器显示的温度和实际温度就存在差异。

即使拿到定制小鼠的鉴定方案，还是建议在自己常用的PCR仪上摸一个退火温度的温度梯度，找到最合适的PCR退火温度再进行整体PCR鉴定。

找不到鉴定方案

如果是从jaxlab购买的小鼠品系，可以从jaxlab的官网上查找对应的鉴定方案。

方法如下：

品系信息页面的「Technicalsupport」菜单，下拉第一栏「GenotypingPortocols」：

跳转到下方链接处，点击即可查看：

有时候jaxlab提供的方法中，退火温度不明确，你会看到一个降落PCR的方法，例如：

如果你觉得降落PCR太麻烦，还是想用一个明确的退火温度进行3步法PCR，那么建议还是先摸一个退火温度的温度梯度，找一个合适的退火温度。

当然，也会有官方提供的引物不适合单一退火温度的情况，那么就可能需要自己重新设计引物、建立PCR鉴定体系了。