分子生物设计性实验ars307完成内科大.docx

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分子生物设计性实验ars307完成内科大

分子生物学设计性实验

设计人:

温鑫

史客松

学院：

数量与生物工程学院

专业：

13生物工程1班

设计的总体思想

目的基因的查找设计引物

PCR扩增目的DNA片段双酶切

重组序列

准备载体双酶切转化或转染繁殖筛选

感受态细胞的制备

一：

puc18载体自身带有抗氨苄青霉素基因，而外源片段不具有，这样只有带有puc18的转化子的菌株才能在氨苄青霉素平板上存活，而外源片段自身环化的不能存活。

二：

pUC18上带有β-半乳糖苷酶基因（lacZ）的调控序列和β-半乳糖苷酶N端146个氨基酸的编码序列，在这个编码区中插有一个多克隆位点，且不影响正常功能，DH5α感受态菌株带有β-半乳糖苷酶C端部分序列的编码信息，当puc18载体在正常情况下同感受态菌株融合后，互补表达有活性的β-半乳糖苷酶，，当有外源片段插入多克隆位点后，不能产生互补，即细菌不能产生β-半乳糖苷酶活性。

在呈色底物X-gal（5-溴-4-氯-3-吲哚-β-半乳糖苷酶）和诱导物IPTG（异丙基-β-D-硫代半乳糖苷）的存在下，互补产物菌落呈现蓝色，不互补产物菌落呈白色，很容易鉴别，这种筛选方法称为α-互补现象筛选（蓝白斑筛选）。

我们根据以上Puc18特点设置此实验，预计实验结果

一．目的基因的查找………………………………………………4

二．设计引物………………………………………………………8

三．PCR扩增目的基因及产物纯化………………………………10

四．Puc18载体的准备……………………………………………12

五．限制性内切酶和酶切buffer的选择…………………………19

六．Puc18载体和目的基因双酶切………………………………20

七、琼脂糖凝胶电泳检测DNA……………………………………21

八．目的基因和Puc18酶连………………………………………22

九．大肠杆菌感受态细胞制备……………………………………22

十．大肠杆菌感受态细胞转化宿主细胞及其筛选鉴定…………24

一、目的基因的查找

1.查找过程

ARS在第三号染色体的位置

2.搜索结果：

>ARS307Chr3

LOCUSAF087952654bpDNAlinearPLN12-NOV-1999

DEFINITIONSaccharomycespastorianusARS307-likegenomicsequence,including

putativephosphatidylserinesynthasegene,partialcds;andunknown

gene.

ACCESSIONAF087952

VERSIONAF087952.1GI:

3695283

KEYWORDS.

SOURCESaccharomycespastorianus

ORGANISMSaccharomycespastorianus

Eukaryota;Fungi;Dikarya;Ascomycota;Saccharomycotina;

Saccharomycetes;Saccharomycetales;Saccharomycetaceae;

Saccharomyces.

REFERENCE1（bases1to654）

AUTHORSTheis,J.F.,Yang,C.,Schaefer,C.B.andNewlon,C.S.

TITLEDNAsequenceandfunctionalanalysisofhomologousARSelementsof

SaccharomycescerevisiaeandS.carlsbergensis

JOURNALGenetics152（3）,943-952（1999）

PUBMED10388814

REFERENCE2（bases1to654）

AUTHORSYang,C.,Theis,J.F.andNewlon,C.S.

TITLEConservationofARSelementsandchromosomalDNAreplication

originsonchromosomesIIIofSaccharomycescerevisiaeandS.

carlsbergensis

JOURNALUnpublished

REFERENCE3（bases1to654）

AUTHORSYang,C.,Theis,J.F.andNewlon,C.S.

TITLEDirectSubmission

JOURNALSubmitted（31-AUG-1998）Micro.&Mol.Genet.,UMDNJ-NewJersey

MedicalSchool,185SouthOrangeAve.,Newark,NJ07103,USA

FEATURESLocation/Qualifiers

source1..654

/organism="Saccharomycespastorianus"

/mol_type="genomicDNA"

/strain="244"

/db_xref="taxon:

27292"

/chromosome="III"

/note="Carlsberglagerproductionstrain"

misc_feature1..654

/note="similartoSaccharomycescerevisiaeARS307"

CDS<1..107

/note="similartoSaccharomycescerevisiaeYCL005w"

/codon_start=3

/product="unknown"

/protein_id="AAC62758.1"

/db_xref="GI:

3695284"

/translation="TNETLMSLSNRANLRRNVSDADIVNIKALRRNSR"

gene421..>654

/gene="similartoSaccharomycescerevisiaePEL1"

CDS421..>654

/gene="similartoSaccharomycescerevisiaePEL1"

/note="similartoSaccharomycescerevisiaePel1p"

/codon_start=1

/product="putativephosphatidylserinesynthase"

/protein_id="AAC62759.1"

/db_xref="GI:

3695285"

/translation="MTTRLLQLTRPHYRLLSSPFRKSSIIQRQMSASSPSPANSYLNM

ITKSLQHNLQTWFHFEPNEIDIIESPSHFYDLLK"

ORIGIN

1ccaccaacgagaccctaatgtctctttccaatagagccaaccttcgaagaaatgtgagtg

61atgccgacatcgttaatatcaaggctttaagaagaaattcaagatgaaacggccattact

121tcttcacattcactaataaataataatcgagatggtaaataattaattagttacataggc

181tccgcattatactctttagcatattcttcccttttcttctcttcccttcatgtttcgttt

241tgtaacttgaatatcaagaagaaaacattaaaaagaaaaagcaatagcggaactacaaat

301tgaaaagattagtgttcaatttcccctaaaaagtaacatacctaaaaatagcaaagaaat

361agcccttcctaccttactcattcatagttgctaatagcacatccaggaccacgaatattc

421atgacgactcgtttgctccaacttactcgtcctcattatagattattatcctcacctttc

481cgcaaaagctccatcatacaaaggcaaatgtctgcttcaagcccttctccagccaatagc

541tatttgaacatgattactaagtctctacaacataatctacagacatggttccatttcgaa

601ccaaacgaaatcgacatcattgaatcaccctcacatttttacgaccttctaaaa

//

二、设计引物

1引物的搜索

2：

引物的结果：

三．PCR扩增目的基因及产物纯化

1.实验设备及器材：

2.设计原则：

（1）、引物长度约为16-30bp

（2）、引物中G+C含量通常为40%-60%，粗略估计引物的解链温度Tm＝4（G+C）+2（A+T），且接近72℃最好。

（3）、四种碱基应随机分布，在3'端不存在连续3个G或C，因这样会使引物在G+C富集序列区引发错误。

（4）PCR过程

（5）PCR产物的纯化

纯化后就得到比较纯的扩增的目的基因

四：

Puc18载体的准备

1.查找过程：

2.搜索结果：

>pUC18

TCGCGCGTTTCGGTGATGACGGTGAAAACCTCTGACACATGCAGCTCCCGGAGACGGTCACAGCTTGTCTGTAAGCGGAT

GCCGGGAGCAGACAAGCCCGTCAGGGCGCGTCAGCGGGTGTTGGCGGGTGTCGGGGCTGGCTTAACTATGCGGCATCAGA

GCAGATTGTACTGAGAGTGCACCATATGCGGTGTGAAATACCGCACAGATGCGTAAGGAGAAAATACCGCATCAGGCGCC

ATTCGCCATTCAGGCTGCGCAACTGTTGGGAAGGGCGATCGGTGCGGGCCTCTTCGCTATTACGCCAGCTAGAGGACCAG

CCGCGTAACCTGGCAAAATCGGTTACGGTTGAGTAATAAATGGATGCCCTGCGTAAGCGGGTGTGGGCGGACAATAAAGT

CTTAAACTGAACAAAATAGATCTAAACTATGACAATAAAGTCTTAAACTAGACAGAATAGTTGTAAACTGAAATCAGTCC

AGTTATGCTGTGAAAAAGCATACTGGACTTTTGTTATGGCTAAAGCAAACTCTTCATTTTCTGAAGTGCAAATTGCCCGT

CGTATTAAAGAGGGGCGTGGGGTTCGAGGTCGACGGTATCGATAAGCTAGCTTAATTAGCTGAGCTTGGACTCCTGTTGA

TAGATCCAGTAATGACCTCAGAACTCCATCTGGATTTGTTCAGAACGCTCGGTTGCCGCCGGGCGTTTTTTATTGGTGAG

AATCCAAGCTAGACTGCGATGAGTGGCAGGGCGGGGCGTAATTTTTTTAAGGCAGTTATTGGTGCCCTTAAACGCCTGGG

GTAATGACTCTCTAGCTTGAGGCATCAAATAAAACGAAAGGCTCAGTCGAAAGACTGGGCCTTTCGTTTTATCTGTTGTT

TGTCGGTGAACGCTCTCCTGAGTAGGACAAATCCGCCGCTAGGAGCTTGCGGCCCGGACGATATCATGCATGAGCTCACT

AGTGGATCCCCCGGGCTGCAGGAATTCCTCGAGAAGCTTGGGCCCGGTACCTCGCGAAGGCCTTGCAGGCCAACCAGATA

AGTGAAATCTAGTTCCAAACTATTTTGTCATTTTTAATTTTCGTATTAGCTTACGACGCTACACCCAGTTCCCATCTATT

TTGTCACTCTTCCCTAAATAATCCTTAAAAACTCCATTTCCACCCCTCCCAGTTCCCAACTATTTTGTCCGCCCACAGCG

GGGCATTTTTCTTCCTGTTATGTTTGGGCGCTGCATTAATGAATCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTATTGG

GCGCTCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACCCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTGATAACGCAG

GAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTC

CGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCGAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGC

GTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTT

CGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGT

GTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGA

CTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGT

GGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGGACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGA

GTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAG

AAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGA

TTTTGGTCATGAGATTATCAAAAAGGATCTTCACCTAGATCCTTTTAAATTAAAAATGAAGTTTTAAATCAATCTAAAGT

ATATATGAGTAAACTTGGTCTGACAGTTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCACCTATCTCAGCGATCTGTCTATTTCGTTC

ATCCATAGTTGCCTGACTCCCCGTCGTGTAGATAACTACGATACGGGAGGGCTTACCATCTGGCCCCAGTGCTGCAATGA

TACCGCGAGACCCACGCTCACCGGCTCCAGATTTATCAGCAATAAACCAGCCAGCCGGAAGGGCCGAGCGCAGAAGTGGT

CCTGCAACTTTATCCGCCTCCATCCAGTCTATTAATTGTTGCCGGGAAGCTAGAGTAAGTAGTTCGCCAGTTAATAGTTT

GCGCAACGTTGTTGCCATTGCTACAGGCATCGTGGTGTCACGCTCGTCGTTTGGTATGGCTTCATTCAGCTCCGGTTCCC

AACGATCAAGGCGAGTTACATGATCCCCCATGTTGTGCAAAAAAGCGGTTAGCTCCTTCGGTCCTCCGATCGTTGTCAGA

AGTAAGTTGGCCGCAGTGTTATCACTCATGGTTATGGCAGCACTGCATAATTCTCTTACTGTCATGCCATCCGTAAGATG

CTTTTCTGTGACTGGTGAGTACTCAACCAAGTCATTCTGAGAATAGTGTATGCGGCGACCGAGTTGCTCTTGCCCGGCGT

CAATACGGGATAATACCGCGCCACATAGCAGAACTTTAAAAGTGCTCATCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGAAAACTC

TCAAGGATCTTACCGCTGTTGAGATCCAGTTCGATGTAACCCACTCGTGCACCCAACTGATCTTCAGCATCTTTTACTTT

CACCAGCGTTTCTGGGTGAGCAAAAACAGGAAGGCAAAATGCCGCAAAAAAGGGAATAAGGGCGACACGGAAATGTTGAA

TACTCATACTCTTCCTTTTTCAATATTATTGAAGCATTTATCAGGGTTATTGTCTCATGAGCGGATACATATTTGAATGT

ATTTAGAAAAATAAACAAATAGGGGTTCCGCGCACATTTCCCCGAAAAGTGCCACCTGACGTCTAAGAAACCATTATTAT

CATGACATTAACCTATAAAAATAGGCGTATCACGAGGCCCTTTCGTC

3.载体的制备

实验设备及器材：

（1）仪器微量移液器、微量离心管（又称Eppendorf管）、常用玻璃器皿、台式高速离心机、分光光度计

（2）材料含有质粒的大肠杆菌DH5a

（3）试剂及溶液LB培养基、葡萄糖

（4）用于碱法提取质粒DNA的溶液

溶液I:

50mmol/L葡萄糖25mmol/L三羟甲基氨基甲烷（Tris）Tris.HCl（pH8.0），10mmol/L乙二胺四乙酸（EDTA）（pH8.0）

溶液II:

O.4mol/LNaOH，2%SDS，用前等体积混合

溶液III:

5mol/L乙酸钾60mL冰乙酸11.5mL水28.5mL

（5）缓冲液:

TBE缓冲液（10Χ）：

称取Tris108g，硼酸55g，0.5mol/LEDTA（Ph8.0）40ML，用H2O定容到1000mL高压灭菌作为10Χ贮藏，稀释10倍后作为工作液使用。

TE缓冲液：

10mmol/LTris-HCl，1mmol/LEDTApH8.0,其中含有RNase20μg/Ml

（6）其他试剂:

异丙醇,70%乙醇等

（7）实验内容：

用碱裂解法提取DNA

1.将2mL含相应抗生素（Amp：

50μg/mL）的LB液体培养基加入到试管中，接入含pUCl9质粒的大肠杆菌，37℃振荡培养过夜。

2．取1.5mL培养物倒入微量离心管中，4000r/min离心2min。

3．吸去培养液，使细胞沉淀尽可能干燥。

4．将细菌沉淀悬浮于100μL溶液I中，充分轻柔混匀。

5．加200μL溶液II（新鲜配制），盖紧管，混匀内容物，将离心管放冰上5min。

6．加入150μL溶液III（冰上预冷），盖紧管口，颠倒数次使混匀。

冰上放置10min。

7．12000r/min，离心15min，将上清转至另一离心管中。

8．向上清中加入等体积酚：

氯仿（1:

1）（去蛋白），反复混匀，12000r/min，离心5min，将上清转移到另一离心管中。

9．向上清加入2倍体积无水乙醇，混匀后，室温放置5-10min。

12000r/min离心5min。

倒去上清液，把离心管倒扣在吸水纸上，吸干液体。

10.用1mL70%乙醇洗涤质粒DNA沉淀，振荡并离心，倒去上清液，真空抽干或空气中干燥。

11．加20μLTE缓冲液，其中含有20μg/mL的胰RNA酶，使DNA完全溶解，-20°C保存。

五．限制性内切酶和酶切buffer的选择

1.限制性内切酶选择的依据：

我们在查找载体的时找到其酶切位图

2.选择的结果：

由上图中我们知道pUC18存在EcoRI识别位点和HindIII识别位点

且可以获取比较大的基因序列。

EcoRI识别位点HindIII识别位点

3.酶切buffer的选择：

注：

只要其中一种酶需要添加BSA，则应在双酶切反应体系中加入BSA。

BSA不会影响任何内切酶的活性。

注意将甘油的终浓度控制在10%以下，以避免出现星号活性，可通过增加反应体系的总体积的方法实现这一要求。

所以我们选择：

1XM+BSA（附带测定buffer的活性）

咪唑68.0850mmol/L3.40g（缓冲剂EGTA和EDTA螯合Ca离子）

KCl74.5550mmol/L3.73g，MgCl26H2O203.300.5mmol/L0.1g

EGTA380.401.0mmol/L0.38g，EDTA2H2O372.240.1mmol/L0.04g

B-巯基乙醇78.131.0mmol/L70ul，甘油92.094.0mmol/L294.8ul

加水定容至1L，PH调至7.2

六．Puc18载体和目的基因双酶切

1．实验设备及器材：

（1）仪器，微量移液器，常用玻璃器皿，电泳仪，电

泳槽，凝胶成像系。

（2）.材料实验一中提纯得到的质粒DNA以及标准DNA

（3）.试剂EcoRⅠ酶解缓冲液（10×）：

1mol/LpH7.5Tris.HCl,0.5mol/LNaCl,0.1mol/LMgCl2，HindⅢ酶解缓冲液（10×）：

0.1mol/LpH7.4Tris.HCl,1mol/L，NaCl,0.07mol/LMgCl2.

2.实验内容：

（1）将上一试验提纯并溶于20μLTE的质粒DNA以及标准DNA用于酶切，按下表分别加入所需试剂.

质粒

样品

酶解缓冲液

酶液

自提质粒

16μL

2μL

2μL

标准质粒

16μL

2μL

2μL

加样后小心混匀，置于37℃水浴中酶解半小时（有时可以长一点，数小时或过夜），然后向管中加入上样液4μL后等待电泳分析。

（2）加样

用移液枪将已加入上样缓冲液的DNA样品加入加样孔（记录点样顺序

及点样量）。

（3）电泳

1.接通电泳槽与电泳仪的电源（注意正负极，DNA片段从负极向正极移动）。

DNA的迁移速度与电压成正比，最高电压不超过5V/cm。

2.当溴酚蓝染料移动到距凝胶前沿1-2cm处，停止电泳。

（4）染色

将电泳后的凝胶浸入溴化乙锭染色液中，染色（15min）以观察在琼脂糖凝胶中的带（戴手套操作）。