分子生物设计性实验ars307完成内科大.docx

1、分子生物设计性实验ars307完成内科大分子生物学设计性实验设计人:温鑫 史客松学院：数量与生物工程学院专业：13生物工程1班设计的总体思想目的基因的查找 设计引物 PCR扩增目的DNA 片段 双酶切 重组序列 准备载体 双酶切 转化或转染 繁殖筛选 感受态细胞的制备 一：puc18载体自身带有抗氨苄青霉素基因，而外源片段不具有，这样只有带有puc18的转化子的菌株才能在氨苄青霉素平板上存活，而外源片段自身环化的不能存活。二：pUC18 上带有-半乳糖苷酶基因(lacZ)的调控序列和-半乳糖苷酶N 端146 个氨基酸的编码序列，在这个编码区中插有一个多克隆位点，且不影响正常功能，DH5感受态菌

2、株带有-半乳糖苷酶C 端部分序列的编码信息，当puc18载体在正常情况下同感受态菌株融合后，互补表达有活性的-半乳糖苷酶，当有外源片段插入多克隆位点后，不能产生互补，即细菌不能产生-半乳糖苷酶活性。在呈色底物X-gal（5-溴-4-氯-3-吲哚-半乳糖苷酶）和诱导物IPTG（异丙基-D-硫代半乳糖苷）的存在下，互补产物菌落呈现蓝色，不互补产物菌落呈白色，很容易鉴别，这种筛选方法称为-互补现象筛选(蓝白斑筛选)。我们根据以上Puc18特点设置此实验，预计实验结果一目的基因的查找4二设计引物8三PCR扩增目的基因及产物纯化 10四Puc18载体的准备 12五限制性内切酶和酶切buffer的选择 1

3、9六Puc18载体和目的基因双酶切 20七、琼脂糖凝胶电泳检测DNA 21八目的基因和Puc18酶连 22九大肠杆菌感受态细胞制备 22十大肠杆菌感受态细胞转化宿主细胞及其筛选鉴定 24一、目的基因的查找1.查找过程ARS在第三号染色体的位置2.搜索结果：ARS307 Chr 3LOCUS AF087952 654 bp DNA linear PLN 12-NOV-1999DEFINITION Saccharomyces pastorianus ARS307-like genomic sequence, including putative phosphatidylserine synthas

4、e gene, partial cds; and unknown gene.ACCESSION AF087952VERSION AF087952.1 GI:3695283KEYWORDS .SOURCE Saccharomyces pastorianus ORGANISM Saccharomyces pastorianus Eukaryota; Fungi; Dikarya; Ascomycota; Saccharomycotina; Saccharomycetes; Saccharomycetales; Saccharomycetaceae; Saccharomyces.REFERENCE

5、1 (bases 1 to 654) AUTHORS Theis,J.F., Yang,C., Schaefer,C.B. and Newlon,C.S. TITLE DNA sequence and functional analysis of homologous ARS elements of Saccharomyces cerevisiae and S. carlsbergensis JOURNAL Genetics 152 (3), 943-952 (1999) PUBMED 10388814REFERENCE 2 (bases 1 to 654) AUTHORS Yang,C.,

6、Theis,J.F. and Newlon,C.S. TITLE Conservation of ARS elements and chromosomal DNA replication origins on chromosomes III of Saccharomyces cerevisiae and S. carlsbergensis JOURNAL UnpublishedREFERENCE 3 (bases 1 to 654) AUTHORS Yang,C., Theis,J.F. and Newlon,C.S. TITLE Direct Submission JOURNAL Submi

7、tted (31-AUG-1998) Micro. & Mol. Genet., UMDNJ-New Jersey Medical School, 185 South Orange Ave., Newark, NJ 07103, USAFEATURES Location/Qualifiers source 1.654 /organism=Saccharomyces pastorianus /mol_type=genomic DNA /strain=244 /db_xref=taxon:27292 /chromosome=III /note=Carlsberg lager production

8、strain misc_feature 1.654 /note=similar to Saccharomyces cerevisiae ARS307 CDS 654 /gene=similar to Saccharomyces cerevisiae PEL1 CDS 421.654 /gene=similar to Saccharomyces cerevisiae PEL1 /note=similar to Saccharomyces cerevisiae Pel1p /codon_start=1 /product=putative phosphatidylserine synthase /p

9、rotein_id=AAC62759.1 /db_xref=GI:3695285 /translation=MTTRLLQLTRPHYRLLSSPFRKSSIIQRQMSASSPSPANSYLNM ITKSLQHNLQTWFHFEPNEIDIIESPSHFYDLLKORIGIN 1 ccaccaacga gaccctaatg tctctttcca atagagccaa ccttcgaaga aatgtgagtg 61 atgccgacat cgttaatatc aaggctttaa gaagaaattc aagatgaaac ggccattact 121 tcttcacatt cactaata

10、aa taataatcga gatggtaaat aattaattag ttacataggc 181 tccgcattat actctttagc atattcttcc cttttcttct cttcccttca tgtttcgttt 241 tgtaacttga atatcaagaa gaaaacatta aaaagaaaaa gcaatagcgg aactacaaat 301 tgaaaagatt agtgttcaat ttcccctaaa aagtaacata cctaaaaata gcaaagaaat 361 agcccttcct accttactca ttcatagttg ctaata

11、gcac atccaggacc acgaatattc 421 atgacgactc gtttgctcca acttactcgt cctcattata gattattatc ctcacctttc 481 cgcaaaagct ccatcataca aaggcaaatg tctgcttcaa gcccttctcc agccaatagc 541 tatttgaaca tgattactaa gtctctacaa cataatctac agacatggtt ccatttcgaa 601 ccaaacgaaa tcgacatcat tgaatcaccc tcacattttt acgaccttct aaaa

12、/二、设计引物1引物的搜索2：引物的结果：三PCR扩增目的基因及产物纯化1.实验设备及器材：2. 设计原则：（1）、引物长度约为16-30bp （2）、引物中G+C含量通常为40%-60%，粗略估计引物的解链温度Tm4(G+C)+2(A+T)，且接近72最好。 (3）、四种碱基应随机分布，在3端不存在连续3个G或C，因这样会使引物在G+C富集序列区引发错误。(4)PCR过程 (5)PCR产物的纯化纯化后就得到比较纯的扩增的目的基因四：Puc18载体的准备1.查找过程：2.搜索结果： pUC18TCGCGCGTTTCGGTGATGACGGTGAAAACCTCTGACACATGCAGCTCCCGG

13、AGACGGTCACAGCTTGTCTGTAAGCGGATGCCGGGAGCAGACAAGCCCGTCAGGGCGCGTCAGCGGGTGTTGGCGGGTGTCGGGGCTGGCTTAACTATGCGGCATCAGAGCAGATTGTACTGAGAGTGCACCATATGCGGTGTGAAATACCGCACAGATGCGTAAGGAGAAAATACCGCATCAGGCGCCATTCGCCATTCAGGCTGCGCAACTGTTGGGAAGGGCGATCGGTGCGGGCCTCTTCGCTATTACGCCAGCTAGAGGACCAGCCGCGTAACCTGGCAAAATCGGTTACGGTTG

14、AGTAATAAATGGATGCCCTGCGTAAGCGGGTGTGGGCGGACAATAAAGTCTTAAACTGAACAAAATAGATCTAAACTATGACAATAAAGTCTTAAACTAGACAGAATAGTTGTAAACTGAAATCAGTCCAGTTATGCTGTGAAAAAGCATACTGGACTTTTGTTATGGCTAAAGCAAACTCTTCATTTTCTGAAGTGCAAATTGCCCGTCGTATTAAAGAGGGGCGTGGGGTTCGAGGTCGACGGTATCGATAAGCTAGCTTAATTAGCTGAGCTTGGACTCCTGTTGATAGATCCAGTA

15、ATGACCTCAGAACTCCATCTGGATTTGTTCAGAACGCTCGGTTGCCGCCGGGCGTTTTTTATTGGTGAGAATCCAAGCTAGACTGCGATGAGTGGCAGGGCGGGGCGTAATTTTTTTAAGGCAGTTATTGGTGCCCTTAAACGCCTGGGGTAATGACTCTCTAGCTTGAGGCATCAAATAAAACGAAAGGCTCAGTCGAAAGACTGGGCCTTTCGTTTTATCTGTTGTTTGTCGGTGAACGCTCTCCTGAGTAGGACAAATCCGCCGCTAGGAGCTTGCGGCCCGGACGATATCATGCAT

16、GAGCTCACTAGTGGATCCCCCGGGCTGCAGGAATTCCTCGAGAAGCTTGGGCCCGGTACCTCGCGAAGGCCTTGCAGGCCAACCAGATAAGTGAAATCTAGTTCCAAACTATTTTGTCATTTTTAATTTTCGTATTAGCTTACGACGCTACACCCAGTTCCCATCTATTTTGTCACTCTTCCCTAAATAATCCTTAAAAACTCCATTTCCACCCCTCCCAGTTCCCAACTATTTTGTCCGCCCACAGCGGGGCATTTTTCTTCCTGTTATGTTTGGGCGCTGCATTAATGAATCGGCCAA

17、CGCGCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTATTGGGCGCTCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACCCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCGAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCT

18、CCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAAC

19、TACGGCTACACTAGAAGGACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGATTATCAAAAAGGATCTTCACCTAGATCCTTTTAAATTAAAAATGAAGTTTTAAATCA

20、ATCTAAAGTATATATGAGTAAACTTGGTCTGACAGTTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCACCTATCTCAGCGATCTGTCTATTTCGTTCATCCATAGTTGCCTGACTCCCCGTCGTGTAGATAACTACGATACGGGAGGGCTTACCATCTGGCCCCAGTGCTGCAATGATACCGCGAGACCCACGCTCACCGGCTCCAGATTTATCAGCAATAAACCAGCCAGCCGGAAGGGCCGAGCGCAGAAGTGGTCCTGCAACTTTATCCGCCTCCATCCAGTCTATTAATTGTTGCCGGGAAGCT

21、AGAGTAAGTAGTTCGCCAGTTAATAGTTTGCGCAACGTTGTTGCCATTGCTACAGGCATCGTGGTGTCACGCTCGTCGTTTGGTATGGCTTCATTCAGCTCCGGTTCCCAACGATCAAGGCGAGTTACATGATCCCCCATGTTGTGCAAAAAAGCGGTTAGCTCCTTCGGTCCTCCGATCGTTGTCAGAAGTAAGTTGGCCGCAGTGTTATCACTCATGGTTATGGCAGCACTGCATAATTCTCTTACTGTCATGCCATCCGTAAGATGCTTTTCTGTGACTGGTGAGTACTCAACCAAG

22、TCATTCTGAGAATAGTGTATGCGGCGACCGAGTTGCTCTTGCCCGGCGTCAATACGGGATAATACCGCGCCACATAGCAGAACTTTAAAAGTGCTCATCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGAAAACTCTCAAGGATCTTACCGCTGTTGAGATCCAGTTCGATGTAACCCACTCGTGCACCCAACTGATCTTCAGCATCTTTTACTTTCACCAGCGTTTCTGGGTGAGCAAAAACAGGAAGGCAAAATGCCGCAAAAAAGGGAATAAGGGCGACACGGAAATGTTGAATACTCATACTC

23、TTCCTTTTTCAATATTATTGAAGCATTTATCAGGGTTATTGTCTCATGAGCGGATACATATTTGAATGTATTTAGAAAAATAAACAAATAGGGGTTCCGCGCACATTTCCCCGAAAAGTGCCACCTGACGTCTAAGAAACCATTATTATCATGACATTAACCTATAAAAATAGGCGTATCACGAGGCCCTTTCGTC3.载体的制备 实验设备及器材：（1） 仪器 微量移液器、微量离心管（又称Eppendorf管）、常用玻璃器皿、台式高速离心机、分光光度计（2） 材料 含有质粒的大肠杆菌DH5a（3） 试剂及溶液 LB培养基

24、、葡萄糖 （4） 用于碱法提取质粒DNA的溶液溶液I :50 mmol/L 葡萄糖 25 mmol/L 三羟甲基氨基甲烷(Tris)Tris.HCl(pH 8.0) ，10 mmol/L 乙二胺四乙酸(EDTA)(pH 8.0) 溶液II : O.4 mol/L NaOH，2% SDS，用前等体积混合 溶液III : 5 mol/L 乙酸钾 60 mL 冰乙酸 11.5 mL 水 28.5 mL (5)缓冲液: TBE缓冲液(10)：称取Tris 108g，硼酸55g，0.5mol/L EDTA（Ph8.0）40ML，用H2O定容到1000mL高压灭菌作为10贮藏，稀释10倍后作为工作液使用。

25、 TE缓冲液：10mmol/L Tris-HCl，1mmol/L EDTA pH8.0, 其中含有RNase20g/Ml(6)其他试剂:异丙醇,70%乙醇等(7)实验内容：用碱裂解法提取DNA1.将2 mL含相应抗生素(Amp：50g/mL)的LB液体培养基加入到试管中，接入含pUCl9质粒的大肠杆菌，37振荡培养过夜。 2取1.5 mL培养物倒入微量离心管中，4 000 r/min离心2 min。 3吸去培养液，使细胞沉淀尽可能干燥。 4将细菌沉淀悬浮于100L溶液I中，充分轻柔混匀。 5加200L溶液II(新鲜配制)，盖紧管，混匀内容物，将离心管放冰上5 min。 6加入150L溶液III

26、(冰上预冷)，盖紧管口，颠倒数次使混匀。冰上放置10 min。 712 000 r/min，离心15 min，将上清转至另一离心管中。 8向上清中加入等体积酚：氯仿(1:1)(去蛋白)，反复混匀，12 000 r/min，离心5 min，将上清转移到另一离心管中。 9向上清加入2倍体积无水乙醇，混匀后，室温放置5-10 min。12 000 r/min离心5 min。倒去上清液，把离心管倒扣在吸水纸上，吸干液体。 10.用1 mL 70% 乙醇洗涤质粒DNA沉淀，振荡并离心，倒去上清液，真空抽干或空气中干燥。 11加20LTE缓冲液，其中含有20g/mL的胰RNA酶，使DNA完全溶解，-20C

27、 保存。五限制性内切酶和酶切buffer的选择1.限制性内切酶选择的依据： 我们在查找载体的时找到其酶切位图2.选择的结果：由上图中我们知道pUC18存在EcoRI识别位点和 HindIII识别位点且可以获取比较大的基因序列。EcoRI识别位点 HindIII识别位点 3.酶切buffer的选择：注：只要其中一种酶需要添加BSA，则应在双酶切反应体系中加入BSA。BSA不会影响任何内切酶的活性。注意将甘油的终浓度控制在10%以下，以避免出现星号活性，可通过增加反应体系的总体积的方法实现这一要求。所以我们选择：1XM+BSA（附带测定buffer的活性）咪唑 68.08 50mmol/L 3.4

28、0g（缓冲剂EGTA 和EDTA螯合 Ca离子）KCl 74.55 50mmol/L 3.73g，MgCl2 6H2O 203.30 0.5mmol/L 0.1gEGTA 380.40 1.0mmol/L 0.38g，EDTA 2H2O 372.24 0.1mmol/L 0.04gB-巯基乙醇 78.13 1.0 mmol/L 70ul，甘油 92.09 4.0mmol/L 294.8ul加水定容至1L，PH调至7.2六Puc18载体和目的基因双酶切1实验设备及器材：（1）仪器 ， 微量移液器 ， 常用玻璃器皿 ， 电泳仪， 电泳槽 ， 凝胶成像系。（2）.材料 实验一中提纯得到的质粒DNA以

29、及标准DNA（3）.试剂 EcoR酶解缓冲液（10）：1mol/LpH 7.5 Tris .HCl,0.5mol/L NaCl,0.1mol/LMgCl2， Hind酶解缓冲液（10）：0.1mol/LpH 7.4 Tris .HCl,1mol/L，NaCl,0.07mol/LMgCl2.2.实验内容：（1）将上一试验提纯并溶于20L TE的质粒DNA以及标准DNA用于酶切，按下表分别加入所需试剂. 质粒样品 酶解缓冲液酶液 自提质粒16L 2L2L 标准质粒16L 2L2L加样后小心混匀，置于37水浴中酶解半小时（有时可以长一点，数小时或过夜），然后向管中加入上样液4L后等待电泳分析。（2）加样 用移液枪将已加入上样缓冲液的DNA样品加入加样孔(记录点样顺序及点样量)。 （3）电泳 1. 接通电泳槽与电泳仪的电源(注意正负极，DNA片段从负极向正极移动)。DNA的迁移速度与电压成正比，最高电压不超过5 V/cm。 2. 当溴酚蓝染料移动到距凝胶前沿1-2 cm处，停止电泳。 （4）染色 将电泳后的凝胶浸入溴化乙锭染色液中，染色(15 min)以观察在琼脂糖凝胶中的带(戴手套操作)。