温度对黑线仓鼠氧化应激抗氧化水平和解偶联蛋白表达的影响本科毕业论文.docx
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温度对黑线仓鼠氧化应激抗氧化水平和解偶联蛋白表达的影响本科毕业论文
温度对黑线仓鼠氧化应激、抗氧化水平和解偶联蛋白表达的影响
作者：
周思思导师：
赵志军教授
（温州大学生命与环境科学学院，浙江温州，325027）
摘要：
根据自由基的假说，高代谢率应该会增加活性氧（ROS）的产生。
然而，“解偶联生存”假说认为解偶联蛋白（UCPs）可以通过降低线粒体内膜的势能减少ROS的产生，在这种情况下，代谢速率和ROS的产生之间的关系将是负相关而不是正相关。
在本研究中，我们研究黑线仓鼠能量摄入、氧化应激水平、抗氧化活性，以及褐色脂肪组织（BAT）、肝脏、心脏、骨骼肌和大脑解偶联蛋白的表达。
将黑线仓鼠驯化于5℃和32.5℃的环境，而对照组饲养在室温下（21°C）。
相对于对照组，在5°C环境中驯化的黑线仓鼠能量摄入增加了70.7%，而在32.5°C环境中驯化的黑线仓鼠能量摄入减少31.3%。
相对于对照组，在5°C环境中驯化的黑线仓鼠的丙二醛（MDA）水平、总抗氧化能力（T-AOC）和谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-PX）在BAT中显著降低。
相对于对照组，在5°C环境中驯化的黑线仓鼠的UCP1在BAT中的表达显著上升，而在32.5°C环境中显著下降。
在5°C环境中驯化的黑线仓鼠其UCP3在骨骼肌的表达也大幅上升。
这些结果表明，活性氧的产生和代谢率之间的关系是负相关，而不是正相关。
关键词：
抗氧化剂；褐色脂肪组织（BAT）；氧化应激；黑线仓鼠；温度；解偶联蛋白
Effectoftemperatureonoxidativestress,antioxidantlevelsanduncouplingproteinexpressioninstripedhamsters
Author:
ZhouSisiTutor:
ZhaoZhijun
（CollegeofLifeandEnvironmentalSciences,WenzhouUniversity,WenzhouZhejiang,325027）
Abstract:
Inlinewithliving-freeradicalhypothesis,highermetabolicratesshouldsubjoinreactiveoxygenspecies（ROS）production.But,the“uncouplingsurvival”hypothesispostulatesthatuncouplingproteins（UCPs）bydecreasingmitochondrialmembranepotentialtoreducetheproductionofROS,inthiscase,therelationshipbetweenmetabolicrateandROSproductionwillbeanegativecorrelationbetweenratherthanpositive.Inthisresearch,weinvestigatedenergyintake,theexpressionlevelsofoxidativestress,antioxidantactivity,andbrownadiposetissue（BAT）,liver,heart,skeletalmuscleandbrainuncouplingprotein.
Keywords:
Antioxidants;Brownadiposetissue（BAT）;Oxidativestress;Stripedhamster;Temperature;Uncouplingproteins
一、背景介绍
自由基理论认为细胞的代谢过程离不开氧的存在，生物氧化的过程是细胞获得能量的过程。
自由基理论把衰老与代谢联系起来，并认为呼吸代谢氧化磷酸化过程中产生过多的自由基对生物体大分子物质的氧化损伤会加速衰老的进程，从而减短了寿命。
其中最主要的是活性氧（ROS）水平。
因为高ROS水平会增强氧化来损伤生物大分子如蛋白质、脂质及DNA，因此高ROS水平被认为是减少预期寿命的原因。
然而有关对鸟类的研究表明，有些物种的代谢率越高其寿命反而越长。
此外，与保持在室温下的小鼠相比，暴露在相对低温情况下的小鼠其代谢较高并且寿命也较长。
对于代谢率与ROS产生的关系，在一些研究中发现这两者之间是存在着明显的负相关，对其的一个可能的解释是“解偶联求生存”假说。
该假说提出，解偶联蛋白降低ROS的产生，通过降低线粒体内膜的电位来实现的。
UCPs是线粒体膜上的转运蛋白，迄今为止，在哺乳动物体内已发现5种UCPs：
UCP1主要分布在褐色脂肪组织中；UCP2能在白色脂肪组织、骨骼肌和免疫系统等多种组织中出现；UCP3主要存在于骨骼肌和脂肪组织里。
UCP4和UCP5主要在大脑和肝脏中出现。
UCP1调节机体产热，可介导任意食物诱导的产热。
UCP2因为具有质子漏功能，而减少了线粒体ROS（活性氧）产物的产生。
UCP3有较强的减少ROS的产生和从线粒体基质中输出脂肪酸阴离子或脂质过氧化产物的能力，这样可以进一步减少氧化应激等。
总的来说，UCPs能控制线粒体内ROS生成，与氧化应激等过程也有密切联系。
“解偶联求生存”假说预测，暴露在寒冷环境下动物的组织应该会降低ROS的产生而解偶联蛋白的表达量会增高。
但是一些研究结果并不符合解偶联生存假说，比如暴露在寒冷环境下大鼠的肝脏、心脏和骨骼肌中过氧化氢（H2O2）水平增加，暴露在寒冷环境下短尾田鼠的肝脏和肌肉组织蛋白质羰基水平显著增加。
我们设计实验来测定温度对黑线仓鼠的代谢率、氧化应激、抗氧化水平和mRNA的表达的影响。
先前的一个研究发现，暴露在适度寒冷或气温相对温和的环境中，对黑线仓鼠氧化应激和抗氧化水平并没有造成显著变化。
当前研究的目的是测定温度对黑线仓鼠代谢率、氧化应激和抗氧化水平的影响，以及与“解偶联求生存”假说关系。
二、实验材料
本实验所使用的黑线仓鼠来自于河北省的农田（115°13’E,38°12’S），被饲养于温州大学。
黑线仓鼠被单独安置在装有适量锯末的塑料笼子里（29×15×18cm），定期更换干净的锯末并且清理笼子；保证黑线仓鼠有充足的食物（北京科奥饲料有限公司的标准啮齿动物食物）和水。
实验前所有动物都安置在21±1°C温度的环境中。
成年仓鼠3.5到4.5个月的年龄，随机分成3组，低温驯化组5±1°C（n=9）和温暖气温驯化组32.5±1°C（n=8），对照组保存在室温下（21±1°C）（n=8），分别饲养6周。
所有动物的体重和食物摄入量是每两天测量一次并且及时记录数据。
温度处理结束后，对各个组的组织样品进行收集与保存。
三、实验方法
3.1总能量摄入（GEI），消化能量摄入（DEI）和消化率
在实验的最后两天对总能量摄入，消化能量摄入进行测定。
将每个笼子中剩下的食物以及从木榍中挑出黑线仓鼠的粪便分别装好，并且将黑线仓鼠的粪便置于60°C的烘箱中烘干并且测量记录数据。
食物和粪便的总能量用氧弹量热计测定。
总能量摄入（GEI），消化能量摄入（DEI）和消化率计算使用以下方程：
总能量摄入（kJ/d）=[食物摄入量（g/d）×饲料的干物质含量（%）–食物碎屑]×食物总能量含量（kJ/g）；
消化能量摄入（kJ/d）=总能量摄入–[粪便干质量（g/d）×粪便的总能量含量（kJ/g）]；
消化率（%）=消化能量摄入/总能量摄入×100%
3.2氧化应激标记物和抗氧化酶
实验材料的提取，采用断颈法取血，将黑线仓鼠处死，快速取其肩胛间的褐色脂肪组织（BAT），腿部骨骼肌、肝脏、心脏和大脑，并且将这些实验材料储在液态氮中迅速冷冻，以保证实验材料的活性。
组织的处理方式：
按照一定的质量配比将组织放置到冰冷的0.9%的氯化钠溶液中进行匀浆，然后再放到离心机中用3000转的转速对其进行离心，15分钟后取其上清液保存在适宜的环境中待后续实验分析。
用Lowry法测定蛋白质浓度。
使用（南京建成生物工程研究所）生产的试剂测定过氧化氢（H2O2）水平，并通过对过氧化氢水平的测定来分析分析黑线仓鼠的氧化应激水平。
过氧化氢（405nm）的水平表示为毫摩尔/克蛋白质（mmol/gprotein）。
丙二醛（MDA）作为脂质过氧化反应的指标。
MDA是脂质过氧化反应的最终产物，用硫代巴比妥酸（TBA）在532nm波长进行测定，并且产生具有粉红色的产物。
组织MDA水平表示为纳摩尔/克蛋白质（nmol/mgprotein）。
3.3总抗氧化能力（T-AOC）和谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-PX）活性
使用（南京建成生物工程研究所）生产的试剂测定T-AOC和GSH-活性。
在之前的大量预实验研究中证实这些试剂都适用于黑线仓鼠。
黑线仓鼠机体中有许多抗氧化物质，能使3价的Fe还原成2价的Fe，后者可与菲啉类物质形成稳固的络和物，通过比色可测出其抗氧化能力的高低。
在测定过程中，将待测液按一定要求处理后用双蒸水调零1cm光径，520nm测各种管吸光度。
定义：
在37℃时，每分钟每毫克待测液，使反应体系的吸光度（OD）值每增加0.01时，为一个总抗氧化能力单位。
在GSH-PX活性测定的基础上还原谷胱甘肽（GSH），过氧化氢产生氧化型谷胱甘肽（GSSG）和H2O反应。
GSH与二硫化碳代2硝基苯甲酸（DTNB）反应产生2-硝基-5-硫代苯甲酸，可以在412nm处被检测的黄色化合物反应。
谷胱甘肽过氧化物酶活性的一个单位，在37℃下限定为1微摩尔GSH消耗/分钟/毫克蛋白质。
3.4实时RT-qPCR的分析
荧光定量PCR分析使用Trizol试剂（TAKARA，中国大连）。
提取褐色脂肪组织、肝、心脏、骨骼肌和脑组织总RNA，用分光光度计测定的吸光度值确定RNA样品浓度，然后调节到一致水平。
取用调整过浓度的总RNA样品2μL，用MLV反转录酶（TAKARA）和oligo（dT18）引物进行cDNA的合成，反应体系为50μL。
用2μL的cDNA样品作为模板，使用解偶联蛋白目的基因的特定引物进行PCR反应（表1）。
表1：
用基因特异性引物序列测定实时RT-QPCR来分析解偶联蛋白在黑线仓鼠中的表达。
Table1.Gene-specificprimersequencesusedforReal-timeRT-QPCRanalysisofuncouplingprotein（UCP）expressioninthestripedhamster.
Gene
Primers（5’to3’）
Size（bp）
UCP1（forward）
GGGACCATCACCACCCTGGCAAAAA
330
UCP1（reverse）
GGCTTTCTGTTGTGGCTAT
UCP2（forward）
GCTGGCGGTGGTAGGAGAT
208
UCP2（reverse）
TGAAGTGGCAAGGGAGGT
UCP3（forward）
ATGGATGCCTACAGAACC
90
UCP3（reverse）
GACAATGGCGTTTCTCGT
UCP4（forward）
GCCGAATAATGAACCAAC
150
UCP4（reverse）
ACCAAGGGGTCATTCTCA
UCP5（forward）
TGCCTTGTTCCGAATCTA
191
UCP5（reverse）
AATCACTCCTGACACTACCC
Actin（forward）
AAAGACCTCTATGCCAACA
196
Actin（reverse）
ACATCTGCTGGAAGGTGG
3.5统计数据
数据都表示为平均值±标准误差，在SPSS13.0统计软件进行统计分析。
体重和食物摄入量的变化检测使用重复测量方差分析。
采用皮尔森相关系数分析来检验H2O2和MDA水平并T-AOC和GSH-Px活性之间的关系。
P<0.05被认为是具有统计学的显著意义。
四、试验结果
4.1体重和食物摄入量
3个小组黑线仓鼠的体重在实验开始前并没有显著的区别（d0，F2,22=0.11，P>0.05，图1A），并且经过六个星期的驯化后，3个小组黑线仓鼠的体重也没有显著的差别（d2，F2,22=0.45，P>0.05；d42，F2,22=0.94，P>0.05）。
3个小组黑线仓鼠的食物摄入量在第一天的时候没有显著的差别（d0，F2,22=0.13，P>0.05，图1B），但从第二天开始一直到42天，相对于对照组，在5°C环境中驯化的黑线仓鼠其食物摄入量明显增加，而在32.5°C环境中驯化的黑线仓鼠则明显减少（d2，F2,22=16.43，P<0.01，d42，F2,22=25.38，P<0.01，图1B）。
Days
图1在不同温度（5°C，21°C，32.5°C）驯化下黑线仓鼠的体重变化（A）和食物摄入量（B）。
数据平均值±SE,**P<0.01。
Figure1.Effectoftemperatureonbodymass（A）andfoodintake（B）instripedhamstersacclimatedto5°C,21°Cand32.5°C.Dataaremeans±SE,**P<0.01.
4.2总能量摄入与消化率
总能量摄入受温度的影响，相对于对照组在5°C环境中驯化的黑线仓鼠其总能量摄入增加，而在32.5°C环境中驯化的黑线仓鼠其总能量摄入则减少（F2,22=26.13，P<0.01，posthoc，P<0.05，图2A）。
相对于对照组，在5°C环境中驯化的黑线仓鼠产生的粪便较多，而在32.5°C环境中驯化的黑线仓鼠则反之（F2,22=35.90，P<0.01，posthoc，P<0.05，图2B）。
3个小组的消化能量摄入存在着差异，相对于对照组在5°C环境中驯化的黑线仓鼠其消化能量摄入提高了68.9%，而在32.5°C环境中驯化的黑线仓鼠则降低了37.2%（F2,22=20.58，P<0.01，posthoc，P<0.05，图2C）。
然而3个小组之间的消化率并没有明显的差别（F2,22=0.16，P>0.05，图2D）。
**
图2温度对黑线仓鼠总能量摄入（GEI，A），粪便的总能量（GE）（B），消化能量摄入（DEI，C）和消化率（D）的影响。
数据平均值±SE,**P<0.01。
Figure2.Effectoftemperatureongrossenergyintake（GEI,A）,grossenergy（GE）offeces（B）,digestiveenergyintake（DEI,C）anddigestibility（D）instripedhamsters.Dataaremeans±SE,**P<0.01.Differentlettersabovecolumnsindicatesignificant（P<0.05）differencesamonggroups.
4.3褐色脂肪组织（BAT）蛋白质含量
如表2所示，在5°C环境中驯化的黑线仓鼠的褐色脂肪组织（BAT）蛋白质含量明显高于对照组以及在32.5°C环境中驯化的黑线仓鼠。
肝脏、心脏、肌肉以及大脑中的蛋白质都不受温度的影响。
表二：
黑线仓鼠不同组织适应不同温度对蛋白质浓度的影响。
Table2.Effectofacclimationtodifferenttemperaturesonproteinconcentrationindifferenttissuesinthestripedhamster.
a
5°C
21°C
32.5°C
P
Liver
204.2±10.5
183.0±7.0
182.5±7.7
ns
Heart
143.7±5.2
131.4±4.1
133.6±5.0
ns
Muscle
44.1±2.6
50.5±4.1
45.4±2.0
ns
Brain
110.3±3.5
111.0±4.2
113.2±1.9
ns
BAT，褐色脂肪组织。
数据平均值±SE,**P<0.01；ns，非显著（P>0.05）。
BAT,brownadiposetissue.Dataaremeans±SE,**P<0.01,ns,non-significant（P>0.05）.
4.4氧化应激
在这3个小组之间,肌肉的过氧化氢（H2O2）的水平都比较低，然而大脑和褐色脂肪组织（BAT）中的过氧化氢（H2O2）水平比较高。
无论是在褐色脂肪组织（BAT）（F2,22=2.14，P>0.05）还是肝脏（F2,22=1.50，P>0.05）、心脏（F2,22=1.50，P>0.05）、肌肉（F2,22=1.09，P>0.05）、大脑（F2,22=2.60，P>0.05，图3A），温度对于过氧化氢（H2O2）的水平的表达几乎没有影响。
这3个小组之间，在肝脏（F2,22=0.77，P>0.05）、心脏（F2,22=0.17，P>0.05）、肌肉（F2,22=1.50，P>0.05）和大脑（F2,22=0.67，P>0.05），温度对于丙二醛（MDA）的水平的表达并没有明显的差别。
然而在褐色脂肪组织（BAT）中温度对于丙二醛（MDA）水平的表达有明显的影响；相对于对照组在5°C环境中驯化的黑线仓鼠其BAT中丙二醛（MDA）的水平降低了41.4%，而在32.5°C环境中驯化的黑线仓鼠则升高了196.4%（F2,22=10.40，P<0.01，posthoc，P<0.05，图3B）。
B
图3温度对H2O2（A）和黑仓鼠丙二醛（MDA）含量（B）的影响。
数据平均值±SE,**P<0.01。
Figure3.EffectoftemperatureonH2O2（A）andmalonaldehyde（MDA）levels（B）instripedhamsters.Dataaremeans±SE,**P<0.01.Differentlettersabovecolumnsindicatesignificant（P<0.05）differencesamonggroups.
4.5抗氧化水平
在这3个小组之间，总抗氧化能力（T-AOC）的水平在肝脏、心脏、肌肉、大脑中并没有明显的差别（liver，F2,22=0.42，P>0.05；heart，F2,22=0.15，P>0.05；muscle，F2,22=1.43，P>0.05；braintissue，F2,22=0.38，P>0.05；图4A）。
然而在黑线仓鼠的褐色脂肪组织（BAT）中温度对于总抗氧化能力（T-AOC）水平有明显影响；相对于对照组，在5°C环境中驯化的黑线仓鼠的总抗氧化能力（T-AOC）的水平降低了46.6%，而在32.5°C环境中驯化的黑线仓鼠则升高了33.4%（F2,22=3.19，P=0.06）。
与其他组织相比较，大脑和心脏的总抗氧化能力（T-AOC）较低。
在黑线仓鼠的肝脏（F2,22=0.52，P>0.05）、心脏（F2,22=2.37，P>0.05）和肌肉（F2,22=0.92，P>0.05，图4B）中谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-PX）水平并没有受温度的影响。
B
图4温度对黑线仓鼠T-AOC（A）和GSH-Px活性（B）的影响。
数据平均值±S,E,**P<0.01。
Figure4.EffectoftemperatureonT-AOC（A）andGSH-PXactivity（B）instripedhamsters.Dataaremeans±SE,*P<0.05.Differentlettersabovecolumnsindicatesignificant（P<0.05）differencesamonggroups.
但是在黑线仓鼠的褐色脂肪组织（BAT）中温度对谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-PX）水平有显著的影响；相对于对照组在5°C环境中驯化的黑线仓鼠的总抗氧化能力（T-AOC）的水平降低了39.4%，而在32.5°C环境中驯化的黑线仓鼠则升高了41.8%（F2,22=4.87，P<0.05，posthoc，P<0.05）。
与对照组和在5°C环境中驯化的黑线仓鼠相比，在32.5°C环境中驯化的黑线仓鼠的总抗氧化能力（T-AOC）水平大概降低了40%；但这种差距在统计学上并不是很显著（F2,22=3.31，P=0.06）。
虽然在肝脏中过氧化氢（H2O2）、丙二醛（MDA）、总抗氧化能力（T-AOC）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-PX）存在明显的相关性，但是在褐色脂肪组织（BAT）、心脏、肌肉和大脑中并没有发现显著的相关性（表3）。
表3黑线仓鼠不同组织的H2O2和MDA水平，以及T-AOC和GSH-PX活性的相关性
Table3Pearson’sCorrelationCoefficientsoftherelationshipbetweenH2O2andMDAlevelsandofT-AOCandGSH-PXactivityindifferenttissuesinthestripedhamster
H2O2
MDA
T-AOC
GSH-PX
BAT
H2O2
1
MDA
-0.11
1
T-AOC
2.16
0.40*
1
GSH-PX
-2.48
0.59**
0.31
1
Liver
H2O2
1
MDA
0.64**
1
T-AOC
0.55**
0.58**
1
GSH-PX
0.69**
0.41*
0.57**
1
Heart
H2O2
1
MDA
0.32
1
T-AOC
-0.03
-0.05
1
GSH-PX
-0.07
0.04
0.09
1
SM
H2O2
1
MDA
0.22
1
T-AOC
-0.37
-0.36
1
GSH-PX
-0.40*
-0.13
0.22
1
Brain
H2O2
1
MDA
0.42*
1
T-AOC
0.12
0.01
1
GSH-PX
0.19
0.01
0.44*
1
BAT，褐色脂肪组织，SM=骨骼肌。
*P<0.05；**P<0.01。
BAT,brownadiposetissue,SM,skeletalmuscle.*P<0.05;**P<0.01.
4.6UCPmRNA的表达
在褐色脂肪组织（BAT）
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