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其它分析法

第八章其它分析法

对于体内样品的药物分析除己介绍的光谱分析法、色谱分析法和免疫分析法外，尚有一些其它方法，如生物检定法和电化学分析法等。

这些方法受灵敏度和选择性的限制在体内药物分析中应用有一定局限性，但在特定的分析对象和条件下，仍可得到较好的结果。

本章主要介绍生物检定法中的微生物测定法和电化学方法中的电位法和伏安法。

第一节微生物测定法

一、微生物测定法的定义和特点

生物检定法是利用药物对生物体或其离体组织器官所起的药理作用来检定药物效价的方法，用于无适当理化方法进行检定的药物。

微生物测定法（microbiologicalanalysis）属于生物检定法，它是利用药物（常为抗生素）对于微生物抑制或杀灭作用，通过选择对药物敏感的试验菌，在适当的条件下，根据培养基上所产生的抑菌圈大小来测定药物效价的方法。

微生素测定法历史悠久。

早在1881年，加勒（Garre）就利用琼脂碟法观察微生物的拮抗现象，1942年弗来明（Fleming）采用琼脂扩散测定了青霉素对各种微生物的敏感性，1944年弗洛里（Florey）和福斯特（Foster）曾研究了抑菌圈直径与抗菌素浓度的关系，从而奠定了微生物测定法的基础。

微生物测定法一般用于抗生素，也可用于某些抗癌药物、维生素和氨基酸的测定。

本法具有灵敏度高，需样量较小，无需特殊设备的优点，不但适用于较纯的原料药物、制剂也适用于经过简单提取分离的生物样品的分析。

本法的主要缺点是操作步骤多，测定时间长，误差较大。

目前，微生物测定法己为世界各国所公认，被列入各国药典，中国药典2000年版二部附录XI简述了生物检定的统计方法，附录ⅪA列入了抗生素微生素检定法[1]。

二、方法分类

微生物测定法可分为稀释法、比浊法和扩散法三大类，体内药物分析以扩散法用途最为广泛。

（一）稀释法一般是在一系列的试管中用液体培养基逐管将抗生素作2倍稀释，并于各个试管中加入相同量的对该抗生素有高度敏感性的试验菌液。

将各个试管放置于37℃的培养箱中培养24小时，观察能抑制细菌生长的最低抗生素浓度作为测定终点,再与同法测得的抗生素标准品的终点作比较，按照供试品和标准品的抑菌最大稀释倍数和标准品浓度计算供试品的浓度。

本法是抗生素效价测定最简单的方法，但测定误差较大，一般用于测定抗生素对试验菌的最低抑菌浓度或最低杀菌浓度。

（二）比浊法比浊法与稀释法在操作上类似，将抗生素标准品的稀释液和供试品的稀释液分别加入试管中，加入己接种试验菌的液体培养基，摇匀，置37℃的培养基中培养一定时间，根据抗生素的浓度不同，试验菌受抑制的程度也不同，因而产生不同程度的混浊，根据朗伯-比尔定律测定标准品和供试品的吸收度值，计算出供试品的效价。

本法较稀释法准确，英国药典和美国药典收载了本法。

（三）琼脂扩散法琼脂扩散法是以琼脂作为固体培养基，利用抗生素在琼脂培养基内的扩散作用，将标准溶液与供试品溶液加到接种了敏感试验菌的同一培养基上，培养基恒温培养一定的时间，比较标准品与供试品对试验菌所产生的抑菌圈的大小，计算出供试品的浓度。

琼脂扩散法按加样方法的不同又分为纸片法、打孔法和管碟法三类，其中纸片法、打孔法加样量较小，以管碟法用途较为广泛。

1.纸片法取质地均匀吸水力强的滤纸剪成一定大小的圆形纸片，分装于试管中，120℃干热灭菌2小时，备用。

测定时将标准品与供试品溶液加到每张纸片上，移至培养基表面，置恒温箱培养。

2.打孔法用一定直径的金属管在己制好的检定菌培养基上打孔后，用注射针将孔中培养基挑去，将标准品与供试品溶液注入小孔中，置恒温箱培养。

3.管碟法将不锈钢小管置于接种了特定试验菌的琼脂平板培养基上，从小管上部加入标准品与供试品溶液，将平板培养基放于培养箱中培养。

在培养基上，试验菌开始繁殖，同时抗生素分子随溶剂向培养基内扩散。

抗生素分子在琼脂培养基中的浓度随离开小管的距离增大而降低，当抗生素分子扩散到T时间时，培养基中抗生素的浓度恰高于该抗生素对试验菌的最低抑菌浓度，试验菌的繁殖被抑制而呈现出透明的抑菌圈（图8-1）。

在抑菌圈的边缘处，培养基中所含的抗生素浓度即为该抗生素对试验菌的最低抑菌浓度。

将己知效价的抗生素标准品溶液与待测的供试品溶液在相同的试验条件下进行培养，比较两者抑菌圈的大小，根据同一抗生素对特定试验菌所得的两条剂量反应曲线为平行直线，设计成二剂量法或三剂量法等，计算出供试品的效价。

图8—1管碟法抑菌圈的形成示意图

抗生素在琼脂培养基中的扩散现象，可用下式表示：

lgM=r2+lgC′4πDTH（8-1）

式中：

T为扩散时间，为细菌刚繁殖到显示抑菌圈所需的时间（h）；

M为抗生素在小管中的效价；

r为抑菌圈的半径（mm）；

H为培养基的厚度；

C′为最低抑菌浓度（效价/ml）；

D为扩散系数（mm2/h）。

8-1式表明，当抗生素、试验菌、培养基和试验条件恒定时，抗生素量的对数与抑菌圈半径的平方呈线性关系，抗生素的量可根据抑菌圈的大小来推算（见图8-2）。

由于抗生素所产生的抑菌圈大小不仅与抗生素的量有关，而且也与抗生素在琼脂培养基内的扩散系数（D），琼脂培养值厚度（H）、抗生素的最低抑菌浓度（C′）和试验菌从刚繁殖到显示抑菌圈所需的时间（T）等各种因素有关，因此在测定时，标准品与供试品必须在相同的条件下进行对比试验。

图8—2管碟法测定抗生素的剂量反应线

三、常用的试验菌与菌悬液的制备法[1]

微生物测定法常用的试验菌有枯草芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、藤黄微球菌、大肠杆菌、啤酒酵母菌、肺炎克雷佰氏菌等，其菌悬液的制备方法如下：

1.枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）悬液取枯草芽孢杆菌的营养琼脂斜面培养物，接种于盛有营养琼脂培养基的培养瓶中，在35～37℃培养7日，用革兰氏染色法涂片镜检，应有芽孢85%以上，用灭菌水将芽孢洗下，在65℃加热30分钟，备用。

2.短小芽孢杆菌（Bacilluspumilus）悬液取短小芽孢杆菌的营养琼脂斜面培养物，照枯草芽孢杆菌悬液的制备法制备。

3.金黄色葡萄球菌（Sraphylococcusaureus）悬液取金黄色葡萄球菌的营养琼脂斜面培养物，接种于营养琼脂斜面上，在35～37℃培养20～22小时，临用时，用灭菌水或0.9%灭菌氯化钠溶液将菌苔洗下，备用。

4.藤黄微球菌（Micrococcusluterus）悬液取藤黄微球菌的营养琼脂斜面培养物，接种于盛有营养琼脂培养基的培养瓶中，在26～27℃培养24小时，或采用适当方法制备的菌斜面，用培养基Ⅲ或0.9%灭菌氯化钠溶液将菌苔洗下，备用。

5.大肠杆菌（Escherichiacoli）悬液取大肠杆菌和营养琼脂斜面培养物，接种于营养琼脂斜面上，在35～37℃培养20～22小时。

临用时，用灭菌水将菌苔洗下，备用。

6.啤酒酵母菌（Saccharomycescerevisiae）悬液取啤酒酵母菌的Ⅴ号培养基琼脂斜面培养物，接种于Ⅳ号培养基琼脂斜面上。

在32～35℃培养24小时，用灭菌水将菌苔洗下置含有灭菌玻璃珠的试管中，振摇均匀，备用。

7.肺炎克雷佰氏菌（Klebosiellapneumoniae）悬液取肺炎克雷佰氏菌的营养琼脂斜面培养物，接种于营养琼脂斜面上，在35～37℃培养20～22小时，临用时，用无菌水将菌苔洗下，备用。

四、常用培养基与制备法

微生物法测定常用的培养基及其制备方法有如下9种。

1.培养基I胨5g磷酸氢二钾3g水1000ml

牛肉浸出粉3g琼脂15～20g

制备方法除琼脂外，混合上述成分，调节pH使比最终的pH值略高0.2～0.4，加入琼脂，加热溶化后滤过，调节pH值使灭菌后为7.8～8.0或6.5～6.6，在 115℃灭菌30分钟。

2.培养基Ⅱ胨6g酵母浸出粉6g琼脂15～20g

牛肉浸出粉1.5g葡萄糖1g水1000ml

制备方法除琼脂和葡萄糖外，混合上述成分，调节pH使比最终的pH值略高0.2～0.4，加入琼脂，加热溶化后滤过，加葡萄糖溶解后，摇匀，调节pH值使灭菌后为7.8～8.0或6.5～6.6，在115℃灭菌30分钟。

3.培养基Ⅲ胨0.5g氯化钠3.5g葡萄糖1g

牛肉浸出粉1.5g磷酸氢二钾3.68g水1000ml

酵母浸出粉3g磷酸二氢钾1.32g

制备方法除葡萄糖外，混合上述成分，加热溶化后滤过，加葡萄糖溶解，摇匀，调节pH值使灭菌后为7.0～7.2，在115℃灭菌30分钟。

4.培养基Ⅳ胨10g枸橼酸钠10g琼脂20～30g

氯化钠10g葡萄糖10g水1000ml

制备方法除琼脂和葡萄糖外，混合上述成分，调节pH使比最终的pH值略高0.2～0.4，加入琼脂，在109℃加热15分钟，于70℃以上保温静置1小时后滤过，加葡萄糖溶解后，摇匀，调节pH值使灭菌后为6.0～6.2，在115℃灭菌30分钟。

5.培养基V胨10g麦芽糖40g

琼脂15～20g水1000ml

制备方法除琼脂和麦芽糖外，混合上述成分，调节pH使比最终的pH值略高0.2～0.4，加入琼脂，加热溶化滤过，加麦芽糖溶解后，摇匀，调节pH值使灭菌后为7.2～7.4，按需要分装，在115℃灭菌30分钟，趁热斜放使凝固成斜面。

6.培养基Ⅵ胨8g氯化钠45g葡萄糖2.5g

牛肉浸出粉3g磷酸氢二钾3.3g琼脂15～20g

酵母浸出粉5g磷酸二氢钾1g水1000ml

制备方法除琼脂和葡萄糖外，混合上述成份，调节pH使比最终的pH值略高0.2～0.4，加入琼脂，加热溶化后滤过，加葡萄糖溶解后，摇匀，调节pH值使灭菌后为7.2～7.4，在115℃灭菌30分钟。

7.培养基Ⅶ胨5g磷酸二氢钾3g琼脂15～20g

牛肉浸出粉3g枸橼酸钠10g水1000ml

磷酸氢二钾7g

制备方法除琼脂外，混合上述成分，调节pH值使比最终的pH值略高0.2～0.4加入琼脂，加热溶化后滤过，调节pH值使灭菌后为6.5～6.6，在115℃灭菌30分钟。

8.培养基Ⅷ酵母浸出粉1g葡萄糖5g磷酸盐缓冲液（pH6.0）1000ml

硫酸铵1g琼脂15～20g

制备方法：

混合上述成分，加热溶化后滤过，在115℃灭菌30分钟。

9.营养琼脂培养基胨10g氯化钠5g

琼脂15～20g肉浸液1000ml

制备方法除琼脂外，混合上述成分，调节pH使比最终的pH值略高0.2～0.4，加入琼脂，加热溶化后滤过，调节pH值使灭菌后为7.2～7.4，分装，在115℃灭菌30分钟，趁热斜放使凝固成斜面。

所有培养基都可以采用相同成分的干燥培养基代替，临用时，照使用说明书配制和灭菌，备用。

五、管碟法双碟的制备与检定法

1.双碟的制备取直径约90mm,高16～17mm的平底双碟，分别注入加热融化的培养基20ml，使在碟底内均匀摊开，放置水平台上使凝固，作为底层，另取培养基适量加热融化后，放冷至48～50℃（芽孢可至60℃），加入规定的试验菌悬液适量（以能得清晰的抑菌圈为度。

二剂量法标准品溶液的高浓度所致抑菌圈直径在18～22mm,三剂量法标准品溶液的中心浓度所致的抑菌圈直径在15～18mm）摇匀，在每一双碟中分别加入5ml，使在底层上均匀摊布，作为菌层，放置水平台上冷却后，在每一双碟中以等距离均匀安置不锈钢小管（内径6.0mm±0.1mm,高10.0mm±0.1mm，外径7.8mm±0.1mm）4个（二剂量法）或6个（三剂量法），用陶瓦圆盖覆盖备用。

2.标准品溶液的制备标准品的使用和保存，应照标准品说明书的规定，临用时按照表8-1的规定进行稀释。

3.供试品溶液