花青素的研究现状.docx

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花青素的研究现状

花青素的研究现状

摘要

综述了花青素的研究现状和发展趋势,包括花青素的植物来源,种类、结构与特性,花青素的分离与分析,生物合成途径,生物合成的基因工程,生理和保健功能,以及组织培养技术。

关键词花青素;研究现状;研究发展趋势

第一章花青素简介（前言）

第二章花青素的研究现状及发展趋势

1花青素的植物来源及应用

2花青素的种类、结构与特性

3花青素的分离与分析

4花青素的生物合成途径

5花青素生物合成的调控基因

6花青素的生理及保健功能

6.1抗癌作用

6.2抗突变

6.3心血管保护

6.4肝脏保护

6.5抗氧化损伤及细胞凋亡

7花青素的植物组织培养技术

7.1碳源

7.2氮源

7.3激素

7.4光

7.5温度

7.6前体添加剂

8总结

第三章参考文献

第一章花青素简介（前言）

花青素（Anthocyanidin）,又称花色素,是自然界一类广泛存在于植物中的水溶性天然色素,属黄酮类化合物。

也是植物花瓣中的主要呈色物质,水果、蔬菜、花卉等五彩缤纷的颜色大部分与之有关。

在植物细胞液泡不同的pH值条件下,使花瓣呈现五彩缤纷的颜色。

在酸性条件下呈红色,其颜色的深浅与花青素的含量呈正相关性,可用分光光度计快速测定,在碱性条件下呈蓝色。

花青素的颜色受许多因子的影响,低温、缺氧和缺磷等不良环境也会促进花青素的形成和积累。

【1】

在自然状态下,花青素在植物体内常与各种单糖结合形成糖苷,称为花色苷（Anthocyanin）。

花青素广泛存在于开花植物（被子植物）中,据初步统计,27个科,73个属植物中含花青素。

从天然野生果实蓝靛果中提取出来的一种花青素（矢车菊素）,其主要用于食品着色方面,也可用于染料、医药、化妆品等方面。

花青素作为一种天然食用色素,安全、无毒、资源丰富,而且具有一定营养和药理作用,在食品、化妆、医药等方面有着巨大的应用潜力。

但是和其他天然色素一样,其染色力弱,使用剂量大，不稳定（易受pH、氧化剂、亲核剂、酶、金属离子、温度、光照等影响），使其应用受到一定限制。

大量研究表明:

花青素具有抗氧化、抗突变、预防心脑血管疾病、保护肝脏、抑制肿瘤细胞发生等多种生理功能。

【1~3】

花青素存在于植物的果实、花、茎和叶中的液泡内,是植物体内的一种水溶性色素。

由于各种花青素分子结构上的差异或酸碱度的不同,花青素就显出红、紫、蓝等不同的颜色。

当气温低或缺少磷营养时,有些植物的茎、叶就会变成紫红色,这是因为叶片里的碳水化合物转变成花青素的缘故;秋天的红叶也是叶片的花青素引起的[1]。

目前食品工业上所用的色素多为合成色素,几乎都有不同程度的毒性,长期使用会危害人的健康,因此天然色素就越来越引起了科研领域的关注。

由于至今国内市场上还没有花青素纯品,所以提取高纯度的花青素对花色苷类色素的深入研究与开发提供必备的表征条件和理论依据,并且有助于它的工业利用。

第二章花青素的研究现状及发展趋势

1花青素的植物来源及应用

花花青素的食物来源主要有樱桃（针叶樱桃）、蔓越莓、蓝莓（越橘）、覆盆子、黑莓、草莓、茄子、红葡萄、小萝卜、黑醋栗、红酒和接骨木落等。

【2】

2花青素的种类、结构与特性

花青素的基本结构单元是22苯基苯并吡喃型阳离子,即花色基元。

现已知的花青素有20多种,主要存在于植物中的有6种:

天竺葵色素（Pelargonidin）、矢本菊色素或芙蓉花色素（Cyanidin）、翠雀素或飞燕草色素（Delphindin）、芍药色素（Pe2onidin）、牵牛花色素（Petunidin）及锦葵色素（Malvidin）。

自然条件下游离状态的花青素极少见,主要以糖苷形式存在,花青素常与一个或多个葡萄糖、鼠李糖、半乳糖、阿拉伯糖等通过糖苷键形成花色苷。

已知天然存在的花色苷有250多种。

花青素分子中存在高度分子共轭体系,具酸性与碱性基团,易溶于水、甲醇、乙醇、稀碱与稀酸等极性溶剂中。

不溶于乙醚、氯仿等有机溶剂,遇醋酸铅试剂会沉淀,并能被活性炭吸附。

在紫外与可见光区域均具较强吸收,紫外区最大吸收波长在280nm附近,可见光区域最大吸收波长在500~550nm范围内。

花青素类物质的颜色随pH值的变化而变化,pH<3呈红色稳定，pH3~6红色变浅，pH>6时呈蓝色且不稳定。

【1,4,9】

3花青素的分离与分析

提取是分离、纯化和利用花青素的主要环节。

目前比较常用的方法有溶剂提取、加压溶剂萃取、超高压辅助提取、微波辅助提取、超声波辅助提取、高压脉冲电场辅助提取等等。

（1）溶剂提取（solventextraction）

溶剂提取是花青素的常规提取方法,溶剂多选择甲醇、乙醇、丙酮、水或者混合溶剂等。

为了防止提取过程中非酰基化的花青素降解,常在提取溶剂中加入一定浓度的盐酸或者甲酸,但在蒸发浓缩时这些酸又会导致酰基化的花青素部分或全部的水解。

另外,对于提取物中可能含有脂溶性成分的样品,需采用有机溶剂如正己烷、石油醚、乙醚等进行萃取。

传统的溶剂提取方法提取时间长,生产效率较低,热溶剂容易造成花青素降解以及生理活性的降低。

国外提取花青素的传统方法是采用低温（4~8e）或者常温（25e）避光条件下1%HCl甲醇溶液浸提16~20h,或者采用015%、1%的三氟乙酸的甲醇溶液,4e条件下浸提24h。

考虑到食品中残留甲醇的毒性,也有用1%的HCl乙醇溶液代替甲醇溶液。

另外为了避免酰基化的花青素的水解,也可选择弱酸如酒石酸、柠檬酸代替盐酸。

而国内则多采用热溶剂（50~70e）浸提1~2h的方式,溶剂可选择不同浓度的醇溶液或酸化的水溶液。

（2）加压溶剂萃取（pressurizedsolventextraction,PSE）

加压溶剂萃取,又称加压液体萃取（pressurizedliquidextraction,PLE）、快速溶剂萃取（acceleratedsolventextraction，ASE）。

它是通过外来压力提高溶剂的沸点，进而增加物质在溶剂中的溶解度以及萃取效率的。

Arapitsas等人（2008）采用此技术优化了紫甘蓝中花青素的最佳提取工艺,最佳参数为:

样品215g，温度99e，提取时间7min，溶剂为V（水）BV（乙醇）BV（甲醇）=94:

5:

1。

（3）超高压辅助提取（extractionassistedbyhighhydrostaticpressure）

2008年Corrales等人采用不同的提取方式对葡萄中花青素的提取效率进行了比较研究，发现相同条件下，与热（70e）提取相比，高压（600MPa）辅助提取花青素等多酚类的效率可以提高近50%，且其产物的抗氧化活性约为热浸提物的3倍。

同时发现,采用高压辅助提取比其他方法可以获得更多的酰化的花青素。

（4）微波辅助提取（microwaveassistedextraction,MAE）

1986年Ganzleret等人首先报道了利用微波萃取从土壤、种子、食品、饲料中分离各种类型化合物的样品制备新方法。

2007年,Sun等人通过响应面试验优化了微波辅助提取红树莓中花青素的最佳工艺参数:

提取溶剂为浓度115mol/L的HCl和体积分数95%的乙醇（体积比15:

85）,提取液料比为5mLB1g，提取时间为53min，提取温度为71e,提取次数2次,依此工艺，红莓花青素的提取得率为36319Lg/g鲜果。

（5）超声波辅助提取（ultrasoundassistedextraction,UAE）

超声波作为一种辅助提取手段主要集中在中草药成分、植物油、多酚、芳香成分、多糖以及其他功能成分的提取等研究领域。

2007年Chen等人以树莓为原料,优化了超声波辅助提取花青素的最佳工艺参数：

液料比4:

1（mL:

g），提取时间200s,超声波功率400W。

2008年，Corrales等人开展了不同的提取方法对葡萄中花青素的提取率影响的对比，结果显示，相同条件下与热（70e）浸提相比，超声波辅助提取花青素等酚类的效率可以提高50%以上。

2004年顾红梅等人对紫甘薯中花青素的超声波辅助提取方法也进行了研究最佳提取条件为采用V（0.1%HCl）:

V（95%乙醇）=40:

60为提取剂、料液比为1:

40、在60e下超声（40Hz）提取30min，一次提取率可达到89.45%。

（6）高压脉冲电场辅助提取（extractionassistedbypulsedelectricfield）

高压脉冲电场作为一种辅助提取手段,国内外已开展了对蛋白质、DNA、多糖、谷胱苷肽、蛋黄卵磷脂、可溶性钙、多糖和酚类物质等成分的提取研究。

2007年Lpez等人在葡萄酒的发酵过程中发现，经PEF前处理的葡萄皮能够增加整个酿造过程中酒的色度,花青素含量和总酚含量均比对照组高。

2008年Corrales等人在对葡萄中花青素的提取研究中发现，与热溶剂（70e）、高静压（600MPa）浸提相比，PEF和超声波辅助提取均具有较高的提取率,而且证明PEF辅助提取适合提取单体葡萄糖苷形式的花青素，在进一步的抗氧化试验中发现，PEF提取物的抗氧化活性远高于其他提取方式。

张燕（2006）对PEF辅助提取树莓中的花青素做了较为系统的研究，发现PEF有效提高树莓花青素的提取率。

（7）亚临界水提取技术（subcriticalwaterextraction,SWE）

在适度的压力下，将水加热到100e以上、临界温度374e以下的高温，水仍然保持在液体状态，它的极性会随温度变化而改变，这种水称为亚临界水。

King等人进行了亚临界水（水温为110~160e）提取浆果（接骨木果、树莓、越橘、阿龙尼亚苦味果）果肉、果皮、果渣、茎组织中花青素的研究，与机械压榨、超临界CO2等提取方法相比，亚临界水提取方法更有效，且提取物的成分、营养价值、抗氧化活性均优于乙醇提取物，并且高于沸点温度的亚临界水对提取物可以起到一种辅助杀菌作用。

2005年Ju等人采用亚临界水和亚临界硫化水（subcriticalsulfuredwater，SSW）对红葡萄皮中的花青素进行了提取研究，亚临界水和亚临界硫化水提取物（100~160e）具有与传统热水或60%甲醇浸提物（50℃，1h）相当甚至更高的花青素含量和ORAC值（oxygenradicalabsorbancecapacity）。

且亚临界硫化水提取物的花青素、总酚含量以及提取物的抗氧化指数（ORAC值）均高于亚临界水提取物，这2种方式的最佳提取温度分别为100℃和100~110℃。

同时发现虽然温度升高会使部分花青素降解，但提取物的ORAC值仍随温度的升高而增大，表明花青素的热降解产物也具有很强的抗氧化能力。

2007年LuqueRodrguez等人采用动态过热流体（乙醇水溶液）萃取技术（superheatedliquidextraction）对葡萄皮中的花青素以及其他酚类进行了提取研究，优化了最佳提取参数:

流体为体积分数01.8%的HCl乙醇水溶液（体积比1:

1），提取温度120℃，时间30min，流速112mL/min，压力8MPa。

此法提取的花青素、总酚和黄烷醇含量分别为传统动态固液萃取的3、7和11倍。

（8）超临界流体辅助提取（super2criticalfluidextraction,SCFE）

SCFE是利用压力和温度对超临界流体溶解能力的影响而进行提取。

在超临界状态下,将超临界流体与待分离的物质接触,使其有选择性地把极性大小、沸点高低和分子量大小的成分依次萃取出来。

张树宝等人（2006）对超临界CO2提取大花葵中花青素的最佳工艺进行了研究,萃取压力为25MPa、萃取温度为60e、萃取时间为45min、物料比为1:

25时萃取率最高。

但此法更适合提取天然植物中亲脂性、极性较小的色素，对亲水性、极性大、分子质量大的色素，萃取得率较低。

（9）微生物发酵或酶解法

此法是利用微生物或酶的作用将细胞壁成分降解,让胞内的花青素成分迅速渗透扩散出来,以利于提取。

王振宇等人采用微生物和纤维素酶对大花葵中的花青素进行了提取研究。

采用黑曲霉、木酶、固氮菌等组合菌对大花葵纤维素进行降解,使植物细胞壁中纤维素解链,花青素得到充分释放,最佳提取工艺参数为接种量015%、温度30e、初始含水量50%、pH510,该方法的优点是花青素可以直接与微生物的代谢产物乙酸形成稳定性较强的酰化花青素。

而最佳酶法提取工艺参数为温度为33e,pH值为618,固液比为lB4,酶用量为810mg/g,酶解时间为120min。

（10）C2射线辐照辅助提取（extractionassistedbyC2radiation）

Ayed等人（2000）报道了一种利用C2射线辐照技术对葡萄废渣中的花青素进行提取的方法。

在焦亚硫酸钠存在的情况下包装后进行C辐照,当C辐照剂量为6kGy,焦亚硫酸钠浓度为2000mg/kg（以SO2计），60e加热15min后,可以获得最高的提取效率。

（11）联合辅助提取

基于许多单一提取手段的利弊不一,许多学者尝试采用联合辅助提取的方式以提高产物的提取率。

2003年Cai等人进行了微波2超声波联合辅助提取草莓中花青素的研究,微波功率:

624W,作用时间60s,超声波处理时间40s,料液比1B6,提取液pH=510为其最佳提取工艺。

2005年王振宇等人以大花葵为原料,用CO2超临界装置对植物原料进行预处理后,进行超声波辅助提取花青素,得到其最佳提取工艺参数为:

超声波频率30kHz,提取溶剂为2%稀H2SO4,处理时间40min,提取温度50e。

【4,5,6,7】

4花青素的生物合成途径

花青素是植物中广泛存在的次生代谢产物,是通过两条途径合成的。

B环和C3桥是由莽草酸途径（shikimicacidpathway）合成的,A环是丙二酸途径（malonicacidpathway）合成的。

花青素生物合成途径中比较关键的酶有苯丙氨酸解氨酶（phenylalanineammonialyase,PAL）、苯基苯乙烯酮合酶（chalconesynthase,CHS）、二氢黄酮醇还原酶（dihydroflavonol-4-reductase,DFR）、花色苷合成酶（anthocyanidinsynthase,ANS）和类黄酮-3-O糖基转移酶（flavonoid-3-o-glycosyltransferase,3GT）等。

PAL催化苯丙氨酸脱氨,生成肉桂酸（cinnamicacid）。

PAL是多酚类物质代谢途径中的一个限速酶,分子量在220～330KDa,其全酶由四个相同亚基组成四聚体,最适pH在8～915之间。

PAL的活性部位具有脱氢丙氨酰基的亲电中心[1]。

几乎能在所有植物细胞中找到PAL,在真菌、细菌、藻类中也有发现。

PAL位于线粒体、白色体、叶绿体、过氧化物酶体、乙醛酸体等细胞器中。

植物组织和部位不同,PAL的活性不同。

植物始分化的部位PAL活性高,衰老组织中活性极低,甚至丧失活性。

PAL的活性受植物激素、营养水平、光照、机械伤害和病原菌的侵入等因素的影响。

如真菌的侵入会引发PAL编码的mRNA的转录,使PAL的合成速度加快,从而促进解氨作用。

CHS是催化合成苯基苯乙烯酮的关键酶。

CHS是一个二聚体的多酮合成酶,每个亚基分子量约为42KDa。

F3H是依赖于酮戊二酸的过氧化物酶,催化二氢黄烷酮生成二氢堪非醇。

F3′H和F3′5′H决定花色苷B环的羟化模式,最终产生不同种类的花色苷,F3′5′H是合成蓝色花色素的关键酶。

DFR是催化二氢堪非醇（dihydrokaempferol,DHK）、二氢栎皮黄酮（dihydroquercetin,DHQ）和二氢杨梅黄酮（dihydromyricetin,DHM）分别生成无色花葵素（leucopelargonidin）、无色花青素（leucocyanidin）和无色花翠素（leucodelphindin）的关键酶。

不同植物的DFR作用的底物不同。

ANS催化无色花色素转变为有色花色素,3GT催化花青素与糖基形成花色苷。

植物的器官呈现红、紫、蓝等颜色是植物体内花青素种类、辅色剂和液胞中H+相互作用的结果。

在植物生长过程中这些因素的变化及彼此的相互作用均受植物体基因的调控。

最近的研究表明,花青素与分子辅色剂辅色作用可使花青素变得稳定。

辅色剂本身无色,但将其加入花青素溶液中,溶液的色泽加深。

【1,8,9】

5花青素生物合成的调控基因

植物花青素的时空合成机制已有深入的研究。

已有的研究表明，不同植物中的花青素生物合成受2类基因的共同控制，一类是结构基因，其编码生物合成途径中所需的酶；另一类是调节基因，其编码的转录因子调控结构基因的时空表达（Holton和Cornish1995）。

目前已分离和鉴定了3类花青素合成的转录因子：

（1）R2R3-MYB蛋白；

（2）myc家族的bHLH蛋白；（3）WD40蛋白（Ramsay和Glover2005）。

目前已经分离的花青素的合成的调控基因如下：

【9】

6花青素的生理及保健功能

由WHO/FAO组成的食品添加剂联合专家委员会（JEC2FA）考察了花色苷的毒理学资料,结论是毒性很低，唯一的负面作用是使一些动物器官（肝、肾上腺、甲状腺）的重量和体重下降。

1982年确定其人体ADI值（每日允许摄入剂量）为0~2.5mg/kg体重。

从根本上讲，花青素是一种强有力的抗氧化剂，它能够保护人体免受自由基的损伤花青素还能够增强血管弹性,改善循环系统和增进皮肤的光滑度,抑制炎症和过敏改善关节的柔韧性。

6.1抗癌作用

SudheerK.Mantenal，ManjeshwarS.Baligal等，用体外和体内两种试验方法研究了花青素对乳腺癌的作用。

体外试验：

用GSPs加入CT1，MCF-7和MDA-MB-468细胞（小鼠高转移性乳腺癌细胞）的培养皿中培养十五天后，与对照组比较，发现4T1，MCF-7和MDA-MB-468细胞的增值能力和生长速度明显下降。

有剂量反映关系。

体内试验：

将4T1细胞植入小鼠的背部（20只小鼠分试验组和对照组各10只），给与试验组小鼠不同剂量的GSPs后观察乳腺癌的生长和转移情况,发现试验组小鼠的乳腺癌发生率小于对照组,发生时间较晚,并且少有转移。

本试验发现GSPs可通过诱导肿瘤细胞凋亡,中断线粒体旁路,增加caspase3的活性等机制,抑制肿瘤细胞的生长和转移。

从膳食中射入GSPs可以很好的预防抑制乳腺癌的发生和发展。

【3】

Kawabe，Mayumi.Tamano，Seiko等，将用DMH制造成结肠癌模型的F344/DuCrj小鼠分为3组，,一组为阴性对照，一组给与PhIP（一种促癌剂），一组给PhiP加PSPC（紫甘薯中提取的花青素）和RCC（紫甘蓝中提取的花青素#）后观察发现PSPC和RCC可以减少PhiP对结肠癌的促进作用。

【3】

6.2抗突变

Yomshimoto用鼠伤害杆菌TA98为材料,评价了4种甘薯块根水提取物的抗突变活性。

发现特别是紫肉甘薯（Ayamurasaki）中的花色苷可有效地抑制杂环胺、32氨基21,42二甲基25氢2吡哆2（4,32b）吲哚、32氨基212甲基25氢2吡哆2（4,32b）吲哚和22氨基232甲基眯唑（4,52f）喹啉引起的突变作用。

实验强调特别是酰基化的花色苷具有强烈的抗突变作用。

6.3心血管保护作用

Preuss，HG.Wallerstedt，D等，将40个血胆固醇过多患者分为4组。

第一组给安慰剂，第二组给GSE100mgbid，第三组给烟酸铬200microgbid，第四组给烟酸铬加GSE各100mgbid。

观察2个月，发现第四组的总胆固醇水平和LDL中的胆固醇水平明显低于其他三组。

提示用GSE加烟酸铬联合用药能明显的降低总胆固醇水平和LDL中的胆固醇水平,改善血胆固醇过多患者的症状。

【3】

XiaodongLing，Wenhua等，将动脉粥样樱花的（apo）E-deficient小30只,分3组，一组给与AIN-93G饮食，二组给AIN-93G饮食加轻甲基戊二酰一辅酶A抑制剂，三组给AIN-93G饮食加富含花青素的黑麦提取物。

观察20周后发现二、三组的大面积坏死灶和纤维化程度低于一组。

说明黑麦提取物中的花青素与轻甲基戊二酰一辅酶A抑制剂一样可以稳定动脉粥样硬化的发展,并且花青素还能降低血浆中的甘油三醋,总胆固醇含量，从而改善脂肪形态，一种比轻甲基戊二酰一辅酶A抑制剂更安全有效的抗动脉粥样硬化剂。

【3】

6.4肝保护作用

张晓丽、刘洪海等，将60只小鼠随机分成6组，每组10只，分别为空白对照组、肝损伤模型组、阳性对照组（给予维生素E5mg/（kg*d））、花青素高剂量组（20mg/（kg*d））、低剂量组（5mg/（kg*d）），各组连续灌肠给药21d。

空白对照组和肝损伤模型组给予0.9%氯化钠溶液，各组均自由进食。

花青素可抑制由于CCl4肝损伤所致的小鼠红细胞膜中SOD、CAT的降低,抑制血浆GSH-Px活性的降低及血浆ALT、AST活性的异常升高;降低红细胞膜中MDA含量及肝脏指数,提高肝糖原水平及脾脏指数、胸腺指数,有效缓解CCl4对肝脏组织的损伤。

【10】

6.5抗氧化损伤及细胞凋亡

余晶、鲍中英等人对H2O2和花青素干预培养的Huh7细胞,应用MTT法检测细胞活力,荧光探针DCFH2DA测定细胞内活性氧（ROS）生成量,免疫印迹测定Akt、磷酸化激活的c-Jun蛋白水平。

实验结果为H2O20.8mmol/L孵育1小时可显著诱导Huh7细胞损伤,细胞活力下降到（49127±312）%，ROS生成量是未处理细胞的3156倍。

细胞经花青素50μmol/L与H2O2共孵育后,细胞存活率提高到（8112±2134）%；花青素能显著抑制H2O2引起的Huh7细胞ROS生成,ROS生成下降74%（P<0.01）。

花青素抑制H2O2引起Huh7细胞死亡和ROS生成的效应随剂量增加而加强。

花青素抑制H2O2激发Huh7细胞磷酸化c-Jun表达，提高细胞Akt水平。

因此可以得到这样的结论，花青素抑制H2O2引起的Huh7细胞氧化应激损伤所导致的细胞死亡，其作用机制在于减少细胞内活性氧生成，抑制H2O2激活磷酸化c-Jun，提高细胞Akt水平。

【12】

7花青素的植物组织培养技术

郭成栓、欧阳蒲月、杜敏等，研究了培养条件对植物细胞培养生产花青素的影响。

7.1碳源

碳源是影响植物细胞培养产生花青素的重要原因。

植物细胞内花青素通常和糖类结合以花青苷的形式存在。

花青素又是在糖代谢的基础上由苯丙酮酸和乙酸缩合而成的,因此糖类对于花青素的合成非常重要。

首先，碳源的种类影响植物细胞产生花青素。

对大