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一个新的具有特殊结构和潜在趋化活性

一个新的具有特殊结构和潜在趋化活性

的人细胞因子趋化素样因子1的克隆和特性研究

韩文玲娄雅欣唐军民张颖妹陈英玉马大龙等

细胞因子是在免疫和炎症反应中起重要作用的小分子蛋白质。

近年来，越来越多的细胞因子得以发现。

本文介绍一种新的细胞因子趋化素样因子1（CKLF1）的发现和特性研究。

CKLF1全长cDNA序列包括530个碱基，有一个编码99个氨基酸的完整开放读码框架。

CKLF1与已发现的其它细胞因子没有明显的序列同源性。

CKLF1在PHA刺激的U937细胞中的表达可被IL-10所部分抑制。

重组的CKLF1能够明显趋化嗜中性细胞、单核细胞和淋巴细胞，同时，它能够刺激小鼠骨骼肌细胞的增殖。

以上结果表明CKLF1可能在炎症和骨骼肌再生过程中发挥重要作用。

关键词：

白细胞介素10；骨骼肌细胞；剪切；抑制性减数杂交

前言

细胞因子是一群在免疫和炎症反应中起重要作用的小分子蛋白质。

总的来说，细胞因子在细胞被活化后呈一过性诱导表达，其表达受多种因素调控。

细胞因子包括白细胞介素、肿瘤坏死因子、生长因子和趋化因子等

（1）。

其中，趋化因子是结构相似的小分子蛋白质，在吸引和活化白细胞过程中起重要作用。

趋化因子在蛋白质水平上含有4个保守的半胱氨酸，根据前两个半胱氨酸的相对位置不同，趋化因子可分为CXC（α）、CC（β）、C（δ）和CX3C（γ）4个亚家族，C代表半胱氨酸，X代表任一氨基酸

（2）。

以前的研究表明：

人前单核细胞系U937细胞在PHA刺激下，能够产生多种细胞因子；而白细胞介素10能抑制多种细胞因子的产生（3）（4）。

基于以上研究结果，我们设计了一条新的技术路线来发现新的细胞因子。

利用抑制性减数杂交技术，从PHA刺激的U937细胞中克隆到能被IL-10所抑制的cDNA序列，其中一个序列编码一个新的分泌性细胞因子，含有CC家族趋化因子所具有的特征性结构即两个连续的半胱氨酸，并对多种白细胞具有趋化作用，该因子被命名为趋化素样因子1（CKLF1）。

但是，该因子与其它CC家族趋化因子有如下区别：

（1）CKLF1成熟蛋白质只有一个连续的CC结构，其羧基端没有其它的半胱氨酸；

（2）CKLF1与已发现的其它CC家族趋化因子没有明显序列上的同源性；（3）CKLF1至少存在其它三种不同的RNA剪切形式；（4）它对骨骼肌细胞有刺激作用。

CKLF1可能代表一个新的家族的趋化因子。

因此，我们将其命名为趋化素样因子1，其相应的变异体命名为CKLF2，CKLF3和CKLF4。

材料和方法

抑制性减数杂交（SSH）

SSH的操作方法按Diatchenko报道的进行操作（5），用CLONTECH公司的PCR-SelectTMcDNASubtractionKit。

SSH技术把抑制性PCR（SuppressionPCR）和传统的减数杂交方法相结合（16），可用于比较两个群体的mRNA，得到在一组mRNA中表达，而在另一组mRNA中低表达或不表达的基因。

先将mRNA反转录为cDNA，其中含有特异表达基因的样本为tester，另一组为driver，tester和drivercDNA杂交，去除杂交体cDNA，没有形成杂交体的cDNA即是在tester中特异表达或高表达的基因，而在driver中不表达或低表达的基因。

抑制性PCR在选择性扩增特异基因的同时，抑制自身的扩增，使杂交阳性率更高。

在SSH操作过程中，人前单核细胞系U937细胞由本室长期传代培养。

细胞培养在含10%胎牛血清，100U/ml青链霉素的RPMI1640培养基中。

用于SSH操作的U937细胞批量培养至2×107细胞，离心收集细胞,用Hank’s液洗三遍后悬于含10ng/mlPHA的10%FCSRPMI1640中,其中一半即1×107细胞作为tester,另一半细胞中加入终浓度为100ng/ml的IL-10作为driver。

继续培养8小时后收集细胞，提取mRNA，取2gmRNA合成双链cDNA，用RsaI切后，将tester分为两组，在T4DNA连接酶作用下，分别连上Adapter1和Adapter2，进行两轮杂交，杂交产物用作PCR扩增的模板。

将杂交产物稀释1000倍，利用试剂盒提供的PCR引物，进行第一轮PCR，扩增27轮，然后将第一轮PCR产物稀释10倍，分别以NESTEDPCR引物1和NESTEDPCR引物2R进行第二轮PCR，扩增15轮，得到的扩增产物即为差异基因片段，Glassmilk回收200－1600bp的片段，克隆到pGEM-Teasy中，连接产物转化XL-Blue菌，选白色克隆。

得到约100个克隆，随机筛选15个变大明显的克隆，纯化质粒DNA，用ALF快速测序仪进行序列分析，并在NCBI中进行序列同源性比较。

生物信息学

将来自PHA刺激的U937细胞文库的EST片段与GenBankTBLASTN的EST数据库进行比较。

将与CKLF1片段有高度同源性的序列（50个以上碱基，95%以上同源性），通过ESTAssemblyMachine（http:

//www.tigem.it）.进行EST拼接（6）。

用于CKLF1拼接的EST片段的登记号为W38899,N95062,AA429945,AA987264,AA927461,W19056,N89912,AA516431,AA479657,AA455042,AA989129,AF151058，NM-016951，W52820。

在PHA刺激的U937细胞中得到CKLF1的全长序列，测序证明EST拼接正确。

CKLF1可能的信号肽切割位点分析用PcGene、Prosite软件和SignalPserver（http:

//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP）　进行分析。

CKLF1的染色体定位用HTGS数据库分析（http:

//www.ncbi.nlm.nih.gov）。

包含CKLF1基因的两个染色体片段的登录号为AC010542和AC018557。

NorthernBlot分析

我们对目的基因的表达情况进行了NorthernBlot分析，细胞总RNA的提取用生命公司的TRIZ0LTM试剂提取。

分别取20gtester或driverRNA，在1.5%的甲醛变性胶中电泳，通过毛细管吸引法将RNA转到尼龙膜上。

探针的标记和杂交操作参照DUPONT公司RandomPrimerFluoresceinLabelingkitwithAntifluorescein-HRP（DuPontNENNELMGC-803）试剂盒说明书。

标记探针的核苷酸均为来源于SSH杂交得到的全长EST片段（CKLF1全长cDNA片段中的53-530位碱基）。

寡核苷酸

用于扩增CKLF1及其变异体的全长cDNA片段的引物为：

P15’GCA,AGA,AGC,GGG,AAG,CCG,A3’和P25’GGA,AGA,ATA,CAG,AAA,TAT,GTT,TAA,TAC3’；用于扩增CKLF1及其变异体的编码区cDNA片段以构建pCDI-CKLF1的引物为：

P35’ATG,GAT,AAC,GTG,CAG,CCG,AAA,AT3’和P45’TTA,CAA,AAC,TTC,TTT,TTT,TTC,ATG,C3’；用于扩增不含终止密码的CKLF1及其变异体的cDNA片段，以构建pEGFP-N1-CKLF1,pEGFP-N1-CKLF2和pEGFP-N1-CKLF4的下游引物为：

P55’CGGGATCCAAAACTTCTTTTTTTTCATGC3’

CKLF1表达谱分析

用巢式PCR的方法对CKLF1及其变异体在各种不同组织中的表达水平进行分析，用Clontech公司MultipleTissuecDNAPanels试剂盒提供的单链cDNA文库作模板，利用P1，P2和P3，P4引物，进行PCR扩增。

在第一轮PCR反应中，取1µlcDNA文库作模板，反应体系为25µl，进行25个循环；在第二轮PCR反应中，取1µl第一轮PCR产物作模板，反应体系为25µl，进行20个循环。

取10µl第二轮PCR产物，在5%SDS-PAGE胶中电泳。

质粒构建

为了对CKLF1，CKLF2和CKLF4的亚细胞定位进行研究，将去终止码的相应序列克隆到表达载体pEGFP-N1中。

用P3和P5引物，从PHA刺激的U937细胞cDNA文库中，扩增CKLF1，CKLF2和CKLF4的cDNA序列，在P5引物中，终止码被去除，并引入BamH1酶切位点。

PCR产物用Klenow酶处理为平端，然后用BamH1酶切。

pEGFP-N1载体先用EcoRI酶切，再用Klenow酶处理为平端，然后用BamH1酶切。

酶切处理后的载体片段和目的基因片段回收后，连接得到重组质粒pEGFP-N1-CKLF1，pEGFP-N1-CKLF2和pEGFP-N1-CKLF4。

用P3和P4引物从PHA刺激的U937细胞cDNA文库中，扩增CKLF1的ORF片段，克隆入pGEM-T载体中，测序。

用EcoRI将插入片段释放出来，连接至经EcoRI切后，并用CIP处理后的pcDI载体中，经酶切鉴定可得到CKLF-1的正义表达载体pcDI-CKLF1。

pcDI是将pcDNA3的BglI-kpnI片段与pCI的BglI-KpnI片段置换后得到的一个真核表达载体（7）。

转染和转染试剂

在瞬时转染中，COS-7细胞在10%胎牛血清的DMEM中培养。

用SuperFect转染试剂，根据说明转染COS-7细胞。

48小时后，收集转染上清，用于活性分析和Westernblot分析。

细胞用PBS洗，甲醛固定30分钟，再用PBS洗，荧光显微镜观察。

CKLF1-EGFP，CKLF2-EGFP，CKLF3-EGFP在COS-7细胞上清中的Westernblot分析

将pEGFP-N1，pEGFP-N1-CKLF1,pEGFP-N1-CKLF2和pEGFP-N1-CKLF4四种质粒分别转染COS-7细胞，48小时后，各取70µl细胞上清，进行SDS-PAGE电泳，电转至尼龙膜上，与抗EGFP多克隆抗体反应，再与HRP标记的二抗反应，用化学发光的方法进行检测。

趋化实验

按照以前报道的方法（8），从健康成年志愿者外周血中分离嗜中性粒细胞、淋巴细胞和单核细胞。

纯化的嗜中性粒细胞重悬于HBSS缓冲液中，细胞密度为1X106/ml；淋巴细胞和单核细胞重悬于含0.5%低内毒素BSA和20mMHepes的1640培养液中，细胞密度分别为5X106/ml和2X106/ml。

细胞趋化实验用48孔趋化小室，按照文献报道的进行（9）。

小孔的下面装满COS-7细胞的转染上清，上面是各种不同类型的细胞。

用于嗜中性细胞的聚炭膜孔径为3µm，趋化时间为30分钟；用于单核细胞和淋巴细胞的聚炭膜孔径为5µm，趋化时间为90分钟。

DNA注射和肌肉切片分析

所有的实验动物均购自北京大学医学部实验动物部。

将100µgpcDI-CKLF1或pcDI分别溶于100µl生理盐水中，取6-8周龄BALB/c小鼠，分别注射pcDI-CKLF1或pcDI于骨胳肌中，同时用40ms，80V电刺激，以提高质粒的摄取量（10）。

10天后，处死小鼠，将注射质粒部位的肌肉取出。

标本分为两部分，一部分用于常规组织学处理，分别进行Feulgen，ANAE，POX和HE染色。

另外一部分用于提取RNA，进行RT-PCR分析。

结果

差异显示cDNA片段的获得

利用SSH技术，我们从PHA刺激的U937细胞中得到了能被IL-10所抑制表达的cDNA序列。

筛选了15个插入序列大于200个碱基的克隆，测序，并在Genbank公共数据库中检索，发现其中6个克隆包括CKLF1为新基因。

Northernblot分析再次证明白细胞介素10能够抑制CKLF1的表达，CKLF1约为600个碱基（见图1）。

图1.CKLF表达的Northernblot分析

第2和第4泳道的RNA来自PHA刺激的U937细胞；第1和第3泳道的RNA来自PHA刺激同时IL-10抑制的U937细胞。

CKLF1在PHA刺激的U937细胞中的表达可被IL-10部分抑制（第1和第2泳道）。

CKLF1全长DNA序列克隆及其编码蛋白质的特征

通过SSH技术从PHA刺激的U937细胞中获得的CKLF1片段含有多聚腺苷酸尾巴和相对少见的加尾信号ATTAAA，人趋化因子Eotaxin和TARC的加尾信号也是ATTAAA（11，12）。

这表明该片段包含完整的3'非翻译区（13，14）。

该片段有一个编码99个氨基酸的完整开放读码框架，96-98位为翻译起始密码ATG，其周边序列为GCGATGG，符合Kozak规律（15）。

在Genbank数据库中检索发现，CKLF1为一个新基因；但是EST数据库检索发现,来自不同cDNA文库的多条EST序列与我们得到的序列部分相同或高度同源。

通过EST延伸技术，在CKLF1原有cDNA序列基础上，向5'非翻译区延长了52个碱基。

Northernblot显示CKLF1与预期的大小基本相符。

为证明EST拼接是否正确，我们设计了引物P1和P2，从PHA刺激的U937细胞中成功得到CKLF1的全长cDNA序列，DNA序列分析表明我们的EST拼接是正确的。

CKLF1的全长cDNA序列及其编码的蛋白质序列如图2A所示（CKLF1在GenBank中的登录号为AF096895）。

图2.CKLF1的核酸和相应的蛋白质序列及其与TARC和STCP-1的序列比较

（A）CKLF1的核酸和蛋白质序列。

核酸序列为正义链，从5'到3'方向。

核酸序列下为相应的蛋白质序列，终止码用星号表示。

（B）CKLF1的蛋白质序列与CC家族趋化因子TARC和STCP-1的比较。

加深的为保守的氨基酸。

CKLF1编码的蛋白质含有99个氨基酸，分子量为10.9KDa，为高度碱性的疏水性蛋白质。

CKLF1蛋白没有N糖基化位点，SignalP分析发现没有典型的信号肽切割位点（16，17），转基因分析和Westernblot分析发现，CKLF1可被分泌到细胞上清中。

其他实验室的研究发现，一些没有前导序列的蛋白质能被分泌出来，如乳腺来源的生长抑制因子，白细胞介素1和巨噬细胞移动抑制因子2等（18）。

因此，CKLF1可能利用另外一种分泌机制。

CKLF1在蛋白质水平上仅与线虫的aminoacidpermease蛋白有低水平的同源性，与其它蛋白质没有明显的同源性。

CKLF1蛋白具有两个结构特性：

（1）CKLF1仅有三个半胱氨酸，最后两个连续排列，具有CC家族趋化因子的结构特征；

（2）BLAST检索发现，CKLF1与其它CC家族趋化因子之间没有明显同源性。

但是，手工排列发现，CKLF1与两个位于16号染色体上CC家族趋化因子TARC和STCP-1在CC附近有数个关键的氨基酸相同（图2B所示）。

CKLF1三个变异体的克隆化

通过RT-PCR技术，我们从PHA刺激的U937细胞中得到CKLF1的全长cDNA序列，同时，得到了其它三条片段，经克隆化和序列分析后，发现它们为CKLF1的三种变异体，分别命名为CKLF2（AF135380），CKLF3（AF135381）和CKLF4（AF145216）。

在PHA刺激的U937细胞中，CKLF1比CKLF2，CKLF3和CKLF4的表达水平高，且该基因的表达可被IL-10所抑制，因此NorthernBlot检测时只看到一条带，可能因为其它变异体丰度较低，NorthernBlot敏感度不够而未能检测到。

读码框架分析表明：

CKLF-2、CKLF-3和CKLF-4分别编码152个氨基酸，67个氨基酸和120个氨基酸，它们与CKLF1有相同的氨基端和羧基端，中间27-112为氨基酸不同，但都有CC结构。

用编码最多氨基酸的CKLF2作参照，CKLF1，CKLF3和CKLF4分别缺失27-79，27-111，80-111位氨基酸（图3所示）。

图3.CKLF1、CKLF2、CKLF3和CKLF4的蛋白质序列

图4.人CKLF基因内含子和外显子交界处序列及CKLF1，2，3，4结构示意图

（A）人CKLF基因内含子和外显子交界处序列。

外显子序列用大写字母表示；内含子序列用小写字母表示。

（B）CKLF对外显子的选择性应用及CKLF1，2，3，4的结构示意图。

CKLF1与其变异体有相同的氨基端和羧基端。

在CKLF2蛋白质的基础上，CKLF1，CKLF3和CKLF4选择性用27-79，27-111和80-111位氨基酸。

下划线序列指CKLF2和CKLF4可能的穿膜区序列

CKLF基因定位和结构

通过检索HTGS数据库，将CKLF2全长cDNA序列与人类基因组工作草图相比较，我们发现两个位于16号染色体上的片段与其有高度同源性。

CKLF基因包括4个外显子和3个内含子。

内含子和外显子交界处的序列符合真核细胞剪接规律（图4A）（19）。

CKLF基因与cDNA序列比较发现，外显子1，2，3，4分别编码1-26，27-79，80-111，112-152位氨基酸（图4B）。

CKLF1，2，3，4有共同的外显子1和4，选择性拥有外显子2和3。

因此，它们为同一基因的不同剪接形式。

CKLF1mRNA在不同组织中的表达

CKLF1mRNA在PHA刺激的U937细胞中存在不同的变异体形式。

我们用RT-PCR技术分析了CKLF1及其变异体在成年及胚胎组织中的表达情况，结果发现：

CKLF1及其变异体在脾脏、肺、睾丸、卵巢、外周血白细胞、胎盘、胰腺、胎脑、胎儿骨胳肌和心脏中高表达；成年人骨胳肌、肝脏、胸腺、结肠、前列腺、胎脾和胎肝中表达水平较低；而在成年人脑组织、肾脏、心脏、小肠、胎肺和胎肾中的表达几乎检测不到。

在绝大多数组织中，CKLF1和CKLF2的表达水平相类似，均比CKLF4的表达水平高，而CKLF3的表达水平最低（图5所示）。

图5.人CKLF1及其变异体在各种组织中的分布

（A）CKLF及其变异体在胚胎组织中的表达。

（B）CKLF及其变异体在成年组织中的表达。

左边显示的分子量标准。

CKLF1，CKLF2和CKLF4的亚细胞定位

为了研究CKLF1，2，4的细胞定位，我们构建了CKLF-EGFP融合表达载体，EGFP在CKLFcDNA序列的下游，二者位于同一读码框架。

将融合表达载体和空载体对照分别转染COS-7细胞。

荧光显微镜下观察荧光的分布。

表达对照EGFP的细胞有分布均匀的亮绿色荧光，在细胞内没有特异性亚细胞定位（图6A）；而转染CKLF1-EGFP的细胞，细胞内荧光很弱（图6B）。

基于CKLF1的结构特征，可以推测大部分CKLF1-EGFP蛋白可能被分泌到细胞培养上清中。

相反，CKLF2-EGFP和CKLF4-EGFP主要位于细胞边缘，在细胞的其它位置，仅有很少的荧光分布（图6C和6D）。

转染HEK-293细胞，也得到相似的结果，这表明CKLF1，CKLF2和CKLF4的亚细胞定位不仅局限于COS-7细胞。

图6.EGFP、CKLF1-EGFP、CKLF2-EGFP和CKLF4-EGFP融合蛋白的亚细胞定位

EGFP位于CKLF1，CKLF2和CKLF4的羧基端，它们在同一读码框架上，瞬时转染COS-7细胞，荧光显微镜观察。

（A）转染EGFP对照。

（B）转染CKLF1-EGFP。

（C）转染CKLF2-EGFP。

（D）转染CKLF4-EGFP。

放大倍数为400倍。

CKLF1为分泌性表达

从CKLF1的亚细胞定位结果来看，我们推测CKLF1可能为分泌性表达。

为证明这一点，收集COS-7细胞转染上清，进行SDS-PAGE电泳和Westernblot分析。

Westernblot表明在pcDI-CKLF1-EGFP转染细胞中，有一条约38KD的特异表达带，分子量与CKLF1-EGFP融合蛋白相吻合（图7）。

而在其它三组转染上清中，没有检测到特异的表达带。

因此，我们可以得出以下结论：

虽然CKLF1的信号肽尚有待确定，但CKLF1为分泌性蛋白，在细胞上清中检测不到CKLF2-EGFP和CKLF4-EGFP的存在。

而且，计算机分析发现，CKLF2和CKLF4的27-79位氨基酸为高度疏水性氨基酸，可能是穿膜蛋白。

将CKLF2序列递交到GenBank后，发现了其他两个实验室克隆的序列，与CKLF2有相同的读码框架，其中一个的登录号为AF057306，被认为是穿膜蛋白脂，这提示CKLF2可能是穿膜蛋白。

图7.应用抗EGFP多克隆抗体，在COS-7细胞上清中检测CKLFs/EGFP。

第一泳道：

高分子量蛋白质标准；第二泳道：

EGFP；第三泳道：

CKLF1/EGFP；第四泳道：

CKLF2/EGFP；第五泳道：

CKLF4/EGFP

重组CKLF1在体外的趋化活性

为了研究CKLF1的生物学活性，我们构建了CKLF1真核表达质粒pcDI-CKLF1，该质粒包括CKLF1的完整读码框架。

我们将pcDI-CKLF1和空载体pcDI分别转染COS-7细胞，收集细胞上清，进行趋化活性分析。

重组CKLF1的趋化活性分析用穿孔移动分析法，趋化活性用趋化指数表示（趋化指数是指pcDI-CKLF1转染细胞上清组的细胞数与空载体pcDI转染细胞上清组的细胞数的比值）（20）。

与pcDI转染细胞上清相比较，pcDI-CKLF1转染细胞上清对人中性粒细胞、淋巴细胞和单核细胞有明显的趋化活性（图8所示）。

我们在果蝇S2细胞系统中得到相似的实验结果，这说明CKLF1的趋化活性不仅局限于COS-7细胞系统。

CKLF1体内趋化活性

我们将pcDI-CKLF1裸质粒注射到BALB/c小鼠肌肉中，10天后，取注射部位肌肉组织，RT-PCR分析发现CKLF1的表达水平较高；同时，肌肉纵切，Feulgen染色，发现与空载体对照组相比，注射pcDI-CKLF1裸质粒的小鼠肌肉切片中有更多的细胞浸润。

这表明CKLF1能引起白细胞的聚集或能刺激干细胞的增殖或二者兼而有之。

为进一步验证CKLF1的体内趋化活性，我们又对部分肌肉切片进行POX或ANAE染色，然后用HE复染（21）。

如图9D和图9F所示，许多细胞呈POX或ANAE强阳性，而在图9C和图9E中，没有发现相应的阳性细胞。

众所周知，POX阳性细胞主要是嗜中性粒细胞，而ANAE阳性细胞主要为单核细胞和T淋巴细胞（22）。

在细胞染色的基础上，结合形态学观察，CKLF1在体内能够趋化嗜中性粒细胞、单核细胞和淋巴细胞，这与CKLF1的体外趋化活性一致。

图8.CKLF1对白细胞的趋化作用

将人外周血淋巴细胞、单核细胞和嗜中性粒细胞置于趋化小室中，下面孔中加入不同稀释度的COS-7细胞转染上清。

在高倍镜下，随机选5个视野，计数穿膜细胞的数量。

CI：

趋化指数。

图9.小鼠肌肉内注射pcDI-CKLF1引起的白细胞浸润

A、C、E为注射pcDI组小鼠；B、D、F为注射pcDI-CKLF1组小鼠。

注射质粒10天后，取肌肉组织，作组织切片。

D和F中可见白细胞浸润。

CKLF1在体内引起骨胳肌的形态学改变

将肌肉组织固定后，分别作纵切片和横切片，HE染色。

在表达CKLF1的肌肉组织中，除了观察到多细胞浸润现象外，还发现了肌肉组织的形态学改变，如图10所示。

在横切面中，CKLF1组有细胞核居中现象（图10B），而对照组没有这种现象（图10A）；在纵切面中，CKLF1组细胞核成串珠状排列（图10D）。

这种现象说明肌卫星细胞被活化，肌肉处于再生状态（23）。

目前，尚需进一步的实验来证明这是CKLF1的直接作用还是由被趋化细胞产生的细胞因子导致的