骨髓增殖性疾病的JAK2V617FMPLW515L点突变及JAK2外显子12突变研究.docx

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骨髓增殖性疾病的JAK2V617FMPLW515L点突变及JAK2外显子12突变研究

南京医科大学硕士学位论文

英文缩写

ET：

essentialthrombocythemia原发性血小板增多症

MPD：

myeloproliferativediseases骨髓增殖性疾病

PV：

polycythemiavera真性红细胞增多症

IMF：

idiopathicmyelofibrosis特发性骨髓纤维化

CML：

chronicmyelogenousleukemia慢性髓细胞白血病MDS：

MyelodysplasticSyndromes骨髓增生异常综合征PCR：

polymerasechainreaction聚合酶链反应AS—PCR：

allelespecificpolymerasechainreaction等位基因特异性一PCRARMS—PCR：

amplificationrefractorymutationscreening-PCR，

扩增阻抗突变-PCR

EPO：

erythropoietin促红细胞生成素

TPO：

thrombopoietin血小板生成素

TPOR：

thrombopoietinreceptor血小板生成素受体EECs：

endogenouserythroidcolonies内源性红系集落形成c-MPL：

c—myeloproliferativeleukemiavirusgene

细胞内骨髓增殖性白血病病毒基因

41

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论文独创性声明

本论文《置煎增殖性瘗痘的』趟丝y鱼12夏!

迦巡§!

§L点塞变及』墅丝窆}显王12塞变砑究滏是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。

论文中除了特别加以标注和致谢的地方外，不包含其他人或机构已经发表或撰写过的研究成果。

其他同志对本研究的启发和所做的贡献均

在论文中作了明确的声明并表示了谢意。

专业：

凼型鱼这堂作者签名：

基i丞日期：

鲨s二!

厶二垒：

论文使用授权声明

本人完全了解南京医科大学有关保留、使用学位论文的规定，即：

学校有权保留送交论文的复印件，允许论文被查阅和借阅；学校可以公布论文的全部或部分内容，可以采用影印、缩印或其它复制手段保存论文。

保密的论文在解密后遵守此规定。

作者签名：

基盔导师签名：

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中文摘要第一部分

JAK2V617F点突变与原发性血小板增多症的临床相关性研究

目的探讨JAK2V617F点突变与原发性血小板增多症（ET）的临床相关性，回顾性分析66例ET患者的临床及实验室检查资料。

方法应用等位基因特异性．聚合酶链反应（AS．PCR）检测JAK2V617F点突变，分析比较JAK2V617F点突变阳性与阴，陛两组患者的临床及实验室指标。

结果66例ET患者中27例存在JAK2V617F点突变，突变率为41．O％。

JAK．2V617F点突变阳性和阴性两组患者初诊时骨髓红系百分比（26．9％士9．4％vs16．3％士8．7％，P<0．05）、粒红比（2．94-1．8VS5．2-4-2．9，P<0．05）、初诊及随访过程中微血管障碍发生率（29．6％VS5．1％，P<0．05）经分析差异有统计学意义；两组骨髓粒系百分比、外周血白细胞计数、血

红蛋白、血小板计数及血栓事件发生率均无统计学差异。

结论AS．PCR检测原发性血小板增多症患者中JAK2V617F点突变阳性率为41。

o％，JAK2V617F点突变阳性的原发性血小板增多症患者初诊时骨髓红系增生明显活跃。

关键词原发性血小板增多症；JAK2V617F；等位基因特异性聚合酶链式反应

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第二部分骨髓增殖性疾病的MPLW515L点突变研究

目的了解MPLW515L和JAK2V617F点突变在我国骨髓增殖性疾病（MPD）中的突变情况。

方法采用等位基因特异性聚合酶链反应（AS．PCR）及基因测序方法检测190例MPD患者的MPLW515L和JAK2V617F点突变。

结果102例原发性血小板增多症（ET）患者中有1例存在MPLW515L点突变，突变率为1．o％；43例存在JAK2V617F点突变，突变率为42．1％。

13例特发性骨髓纤维化（IMF）患者未检测到MPLW515L点突变；5例存在JAK2V617F点突变，突变率为38．1％。

32例真性红细胞增多症（PV）患者未检测到MPLW515L点突变；20例存在JAK2V617F点突变，突变率为62．5％。

43例慢性粒细胞白血病（CML）患者未检测到MPLW515L和JAK2V617F点突变。

结论AS．PCR检测MPLW515L和JAK2V617F点突变简便可靠。

ET患者中可存在MPLW515L点突变，JAK2V617F点突变存在于PV、ET、IMF患者中，而CML患者不存在JAK2V617F点突变。

关键词点突变；MPLW515L；JAK2V617F；骨髓增殖性疾病；等位基因特异性．聚合酶链反应

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第三部分

真性红细胞增多症的JA磁外显子12突变研究

目的了解JAK2外显子12突变在真性红细胞增多症（PV）患者中的发

生情况。

方法采用聚合酶链反应（PCR）扩增12例JAK2V617F点突变阴性PV

患者的JAK2外显子12片段，经基因测序与野生型JAK2外显子12比对，了解是否存在JAK2外显子12突变。

结果12例JAK2V617F点突变阴性PV患者中3例（25．O％）检测到外显子12突变，其中N542．E543del、H538QK539L及K539L突变各一例。

结论JAK2V617F点突变阴性的PV患者中存在JAK2外显子12突变。

JAK2外显子12突变的检测对PV患者的诊断及分类有重要的临床意义。

关键词点突变；JAK2外显子12；真性红细胞增多症；聚合酶链式反应；

基因测序

研究生：

夏瑁

导师：

李建勇

徐卫

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Abstract

PartICorrelationsofJAK2V617Fmutationwithclinicalandlaboratorylaboratoryfinding：

‘essentia—thrombocythemiafindingsinessentialthrombocythemiapatients

objectiveToevMuatethefrequencyofJAK2V617Fmutationandanalyzeitsclinicalassociationsinpatientswithessentialthrombocythemia（ET）．MethodsMutationwasdetectedbyallelespecificpolymerasechainreaction

（AS—PCR）andclinicalfeaturesof66ETpatientswereretrospectively

reviewed．

ResultsAmong66patients，29patients（41．O％）hadJAK2V617FmutationbyAS-PCR．Thepatientscarryingthemutationdisplayedhigherbonemarrowerythropoiesis（26．9％士9．4％VS16．3％4-8．7％，P

／erythropoiesis（2．9+1．8VS5．2+2．9，P<0．05）andincidenceofmicrovasculardisturbances（29．6％VS5．1％，P<0．05），Buttheage，gender，leukocyte，plateletcounts，hemoglobin，bonegranulopoiesis，splenomegMy，historyofthrombosisandhemorrhagehadnodifferencebetweenpatientswithandwithoutthemutation．

ConclusionThefrequencyofthemutationinETpatientsis41．O％．ThepresenceoftheJAK2V617FmutationisassociatedwithahigherbonemarrowerythropoiesisinETpatientsatdignosis．

Keywordsessentialthrombocytemia；JAK2V617F；AS．PCR

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PartIIMPLW515Lmutationinmyeloproliferative

diseasespatients

objectiveToevaluatethefrequencyofMPLW515LandJAK2V617F

mutationsinpatientswithmyeloproliferativediseases（MPD）．

MethodsMPLW515LandJAK2V617Fmutationsweresimultaneouslydetectedbyallelesspecificpolymerasechainreaction（as—PCR）in190MPD

patients．

ResultsMPLW515Lmutationwasdetectedin1of102（1．O％）essentialthrombocythemia（ET）patientsandWasnotdetectedinpolycythemiaverapⅥ，idiopathicmyelofibrosis（m伍），chronicmyelogenousleukemia（CML）patients．JAK2V617Fmutationwasdetectedin20of32PVpatients（62．5％），

43of102ETpatients（42．1％），5of13IMFpatients（38．1％），andwasnot

detectedinCMLpatients．

ConclusionMPLW515LmutationWasdetectedinETpatient，butWasnotfoundinPV，IMFandCML．JAK2V617FmutationWasdetectedinPV,ETandI．MF，butwasnotfoundinCML．

KeywordsMPLW515L；JAK2V617F；Myeloproliferativediseases；

AS．PCR

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PartIIIJAK2exon12mutationsinpolycythemiaverapatients

ObjectiveTosearchedforJAK2exon12mutationsinpatientswithpolycythemiavera（PV）．

MethodsPolymerasechainreaction（PCR）wasusedfor12JAK2V617F

。

negativePVpatientstoamplytheregionofJAK2exon12，directgene

sequencingwasperformedtodetectmutationsofJAK2exon12．

Results3of12（25．O％）JAK2V617F—negativePVpatientshadJAK2exon12mutations，whichwereH538QK539L，K539LandN542-E543del．ConclusionJAK2exon12mutationscouldexistinJAK2V617F—negativePVpatients．DetectionofJAK2exon12mutationsisusefulforclinical

diagnosisofPV．

KeywordsJAK2exon12；polycythemiavera；PCR；genesequence

Postgraduate：

JunXiaSupervisor：

JianyongLi

W．eiXu

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第一部分JAK2V617F点突变与原发性血小板增多症的临床相关性研究

●■■_-●●■一

刖吾

原发性血小板增多症（ET）是一种以血小板显著持续性增多为特征的骨髓增生性疾病（MPD）。

MPD中除幔性髓细胞白血病（CML）具有特征性的Ph染色体和bcr／abl融合基因以外，其余各亚型的发病机制尚不清楚，仅lo％～15％的病例存在细胞遗传学异常，且均无特征性改变B,2】。

自2005年以来国际上大量文献【3巧】辛艮道了bcr／abl阴·tgMPD包括真性红细胞增多症（PV）、ET、特发性骨髓纤维化（IMF）等三种疾病中的JAK2基因点突变，即JAK2基因编码序列第617位氨基酸的第一位碱基发生G-◆T点突变，导致其编码的缬氨酸变为苯丙氨酸（表示为JAK2V617F）II这是继bcr／abl之后MPD发病机制研究的又一重要进展。

最近的临床研究认为JAK2V617F突变阳性与阴性两型不仅分子学发病机理不同，在临床特征、实验室检查、疾病转化等方面可能存在差异；JAK2V617F点突变阳·t#-ET与PV可能是一个疾病的两个阶段[6-101。

本研究收集66例ET患者，应用AS．PCR检测JAK2V617F点突变，对临床及实验室资料进行回顾性分析，探讨我国ET中JAK2V617F点突变发生率及其临床相关性。

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对象和方法

研究对象

2005年6月--2007年4月在南京医科大学第一附属医院和南京市其他医院的住院或门诊就诊的ET患者66例，男30例，女36例，年龄16～87岁，中位年龄50岁。

ET的诊断标准参照《血液病诊断与疗效标准》【n】。

骨髓或外周血2ml提取DNA，统计患者初诊时年龄、外周血白细胞、血小板计数和血红蛋白水平、脾脏大小、血栓及出血事件、骨髓增生情况并记录患者病程进展情况。

二．主要试剂与仪器

（1）DNA提取试剂盒（挪威Dynal公司）。

（2）2xTaqPCRMasterMix（北京天根科技有限公司）：

1ml／管。

o．1UTaqPolymerase／gl，500小dNTPeach，20mMTris—HCL（pH8．3），100mMKCL，3mMMgCl2，其它稳定剂和增强剂，含染料。

（3）PCR扩增仪（美国M讼司，PCT200TM型）。

（4）离心机（美l訇BeckmanCoulter公司，CS．6R型）。

（5）凝胶成像分析系统（美Transilluminator202D,'冷）

三．实验方法与步骤1．DNA合成

（1）取骨髓或外周血500山加入2mlEP管中，加入1ml4℃度放置的红

细胞裂解液，震荡30s；

（2）10000—12000rpm离心1min；

（3）缓慢弃上清液，用干净的吸水纸吸干管缘液体，可看到管底残留白

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色块状物；

（4）在沉淀上加入125肛1蛋白酶，震荡5s；

（5）置于65。

C水浴器中10min，每2~3min震荡一次，至沉淀完全溶解；（6）加275山蛋白清除液于标本中，震荡5s；

（7）一20。

C放置10min；

（8）12000r．p．rn以上离心5min；

（9）小心将上清液（舍DNA）转移到一个干净，标记的2mlEP管中；（10）慢慢加入500m4。

C冷藏放置的乙醇；

（11）来回颠倒EP管6～10次使DNA沉淀，可看到象白色纤维或半透明

团块状的DNA，若看不见DNA，将EP管置．20"C10min；

（12）12000r．p．m以上离心5min沉淀DNA，小心弃上清；（13）加入1ml70％乙醇，震荡5s，12000r．p．m以上离心1-2min；

（14）小心倒去乙醇，颠倒EP管使DNA风干，将EP管倒放于干净吸水

纸上2~3min使乙醇挥发；（15）在管中加入100-150山DNA溶解液；（16）置650C水浴器中15min，充分溶解DNA；（17）紫外分光光度仪测量DNA的浓度和纯度。

2．引物的设计

包括一对外侧引物以扩增出JAK2基因第12号外显子，即为体系验证引物（内参），另外一条中间引物37端碱基与V617F突变位点碱基相吻合，从而使3’端序列与野生型V617序列错配，而突变型产物得以延伸。

引物序列设计为两条上游引物和一条公共下游引物，如表1所示。

扩增产物为

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203bp，内参为364bp。

引物由上海生物工程有限公司设计合成。

表1．引物序列

引物序列

forwardspecific5'-agcatttggttttaaattatggagtatatt．3’

forwardinternal5'-atctatagtcatgctgaaagtaggagaaag-3’

reVerSe5'-ctgaatagtcctacagtgttttcagtttca-3’

3．AS．PCR检测J铷陋V617F点突变

PCR反应体系：

DNA25ng，10mmol／L的上游引物各O．2pl，10mmol／L的下游引物O．4“1，MasterMix12．5gl，加去离子水至终体积25gl。

PCR扩增循环参数：

95"C预变性4min，95℃变性30s，55"C退火30s，72。

C延伸1min，反应35个循环。

最后72。

C延伸7min。

配制1．5％的含溴化乙锭的琼脂糖凝胶，取5山PCR产物加样，于lxTBE缓冲液中，90V电泳40min，紫外光透视仪分析图像并照相，分析。

4．基因测序

JAK2V617F点突变阳性标本均用外侧引物重新PCR扩增后回收、纯化，上海英骏生物技术有限公司测序，测序结果与野生型基因序列比对四．统计学处理

计量资料芒检验，计数资料移险验、Fisher"s；确+）7概率法。

SPSSl2．o统

计软件进行分析，尸值

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结果

一．AS—PCR检测JAK2V617F点突变结果本组66例ET患者经AS—PCR检测到JAK2V617F点突变27例，突变

率41．O％。

图1为PCR扩增产物经1．5％的琼脂糖凝胶电泳图，JAK2V617F点突变阴性为364bp一条带，JAK2V617F点突变阳性为203、364bp两

条带。

将琼脂糖凝胶电泳存在双条带的PCR扩增产物进行回收、纯化和测序。

测序结果与野生型基因序列比对，均存在突变位点碱基G一+T。

随机取琼脂糖凝胶电泳只有单条带的PCR扩增产物基因测序，均无突变。

12345

1：

DNAMarker（MD101）：

2：

JAKV61t一点突变?

i性对照：

3：

JAKV617F点突变阳性；4：

JAKV61F点突交阴性：

5：

空白工：

j照

图1ET患者．IAKV617F点突变AS．PCR扩增电泳图

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二．JAK2V617F点突变与ET临床相关性分析结果本研究66例ET患者JAK2V617F点突变阳性27例，阴性39例，阳

性率41％。

两组临床相关性分析见表2。

两组患者初诊时的性别、年龄、外周血白细胞计数、血红蛋白水平和血小板计数均无统计学差异（P>0．05）。

初诊及其后随访ee．--r触及脾肿大8例，JAK2V617F点突变阳性与阴性各4例。

有血栓史患者12（18．1％）例，JAK2V617F点突变阳性患者5（18．5％）例，其中4例脑梗死、l例肺梗死。

阴性7（17．9％）例，其中6例脑梗死、1例心肌梗死。

微循环障碍如头痛，末肢感觉异常者10例，JAK2V617F点突变阳性患者8（29．6％）例，阴性2（5．1％）例，微循环障碍发生率JAK2V617F点突变阳性组显著高于阴性组。

血栓发生率两组无统计学差异。

所有病例中仅2例提供皮肤淤斑的出血史，JAK2V617F点突变阳性阴性各1例。

比较两组骨髓增生情况，骨髓粒系百分比（58．6％士8．4％vs62．4％±9．5％，P>0．05），红系百分比（26．9％±9．5％vs16．3％±8．7％，P<0．05），骨髓粒红比（2．9±1．8VS5．2士2．9，P<0．05），提,--5,Fn性组骨髓红系增生更活跃，有统计学差异。

在本研究进行的一年半期间有1例JAK2V617F点突变阳性患者进展为骨髓纤维化。

1例JAK2V617F点突变阴性患者死亡，死因为大面积脑梗死．

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表2．JAK2V617F点突变阳性与阴性患者的临床实验室资料比较

AllpatientsJAK2V617FP=positivenegative

Number（％）6627（41％J39（59％】

Male／females29／361O／1720／190．253Age（years），median（range）53．6（i6-87）56．3（16—79）51．6（i7—87）0．295SpIenomegaly（％）8（12．1％）4（15．3％）4（10．2％）0．811

WBC（109／L）12．3+6．113．0-+6．311．7+5．90．395

Hemoglobin（g／L）135．9+22．2138．I+_20．2134．1±24．10．482Plateletcount（109／L）945．8_+441．I894．5_+298．0984．9_+527．50．423Subjectswiththrombosis12{i8．1％）5（I8．5％）7（I7．9％）O．793Microvasculardisturbances10