第七章 酶与细胞的固定化技术pptConvertor.docx
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第七章酶与细胞的固定化技术pptConvertor
第七章
固定化酶与固定化细胞技术
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本章主要内容：
第一节概述
第二节固定化酶与固定化细胞的制备
第三节固定化酶的性质及其影响因素
第四节固定化酶（细胞）的应用
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什么是固定化酶？
第一节概述
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固定化酶（ImmobilizedEnzyme）是20世纪60年代发展起来的—项新技术。
它是通过物理的或化学的手段，将酶束缚于水不溶的载体上，或将酶柬缚在一定的空间内，限制酶分子的自由流动，但能使酶充分发挥催化作用；过去曾称其为水不溶酶或固相酶。
1971年第一届国际酶工程会上正式建议采用固定化酶的名称。
从60年代起，固定化酶的研究发展很快，起初人们把注意力集中在酶的固定化方法研究上，近年来，不但固定化方法和载体开发有了长足发展，并且已转向它在工业、医药、环保、能源开发以及理论研究等方面的应用研究。
固定化酶的发展：
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固定化酶与固定化细胞的优缺点
固定化酶的优点：
（1）极易将固定化酶与底物、产物分开；产物溶液中没有酶的残留，简化了提纯工艺；
（2）可以在较长时间内反复使用，有利于工艺的连续化、管道化；
（3）酶反应过程可以严格控制，有利于工艺自动化和微电脑化；
（4）在绝大多数情况下酶的稳定性得以提高；
（5）较能适应于多酶反应；
（6）酶的使用效率提高，产物得率提高，产品质量有保障，成本低。
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固定化酶的缺点：
（1）固定化时酶的活力有所损失。
同时也增加了固定化的成本，使工厂初期投资增大；
（2）比较适应水溶性底物和小分子底物；
（3）与完整细胞比较，不适于多酶反应，特别是需要辅因子的反应，同时对胞内酶需经分离后，才能固定化。
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（1）省去了酶的分离；为多酶系统，无须辅因子再生；
（2）细胞生长快、数量多、反应快；
（3）可以连续发酵，而且产物提取前不用分离去细胞，能一边排出发酵液，一边进行培养，排除了产物抑制和消耗；
（4）保持酶在细胞内的原始状况，增加了酶的稳定、特别是对污染因子的抵抗力增加。
固定化细胞的优点
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（1）必须保持菌体的完整，防止菌体自溶，否则，将影响产品纯度；
（2）必须防止细胞内蛋白酶对所需酶的分解，同时，需抑制胞内其他酶的活性、阻止副产物的形成；
（3）细胞膜、壁会阻碍底物渗透和扩散。
固定化细胞同时也存在—些缺点：
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一、酶的固定化方法
酶的固定化方法有：
吸附法；共价键结合法；交联法；包埋法。
第二节固定化酶与固定化细胞的制备
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交联
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1.吸附法
吸附法分为物理吸附法和离子交换吸附法。
（1）物理吸附法:
通过氢键、疏水作用和π电子亲和力等物理作用，将酶固定于水不溶载体上。
从而制成固定化酶。
常用的载体有：
①有机载体：
纤维素、骨胶原、火棉胶及面筋、淀粉等。
比如用纤维素作为吸附剂，用膨润的玻璃纸或胶棉膜吸附木瓜蛋白酶、碱性磷酸脂酶、6—磷酸葡萄糖脱氢酶。
吸附后在载体表面形成单分子层，吸附蛋白能力约70mg/cm2。
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②无机载体：
氧化铅、皂土、白土、高岭土、多孔玻璃、二氧化钛等。
例如：
用多孔硅为载体吸附米曲酶和枯草杆菌的淀粉酶以及黑曲霉的糖化酶，在45℃进行固定化，用高浓度的底物进行连续反应，半衰期分别为14、35、60d。
无机载体的吸附容量较低、而且酶容易脱落。
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（2）离子交换吸附法:
是将酶与含有离予交换基的水不溶载体相结合而达到固定化的一种方法。
酶吸附较牢，在工业上颇具广泛的用途。
常用的载体有：
阴离子交换剂：
如二乙基氨基乙基（DEAE）-纤维素、混合胺类（ECTEDLA-纤维素、四乙氨基乙基（TEAE）-纤维素、DEAE-葡聚糖凝胶等。
阳离子交换剂：
如羧甲基（CM）-纤维素、纤维素柠檬酸盐、AmberliteCG50、IRC-50、IR-200、Dowex-50等。
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例：
DEAE-Sephadex固定化氨基酰化酶
将DEAE-SephadexA25充分溶胀，用0．5mol/LNa0H和水洗涤后，加入pH7.0~7.5的米曲霉3042粗酶液（活力为25umol/ml·h），充分混合（1g湿重载体加60ml酶液），于低温下搅拌过夜后，吸去上清液，再用蒸馏水和0.15mol/L醋酸钠水溶液洗涤固定化酶，置4℃备用。
固定化酶活力回收50~60％，水解乙酰—DL—A1a活力为600-800umol/g·h湿固定化酶。
氨基酰化酶也可固定于DEAE—纤维素。
此外，DEAE-纤维素吸附的α-淀粉酶、蔗糖酶已作为商品固定化酶。
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吸附法制备固定化酶操作简单，可充分选择不同电荷、不同形状的载体，吸附过程可以同时纯化酶，固定化酶在使用过程失活后可重新活化，同时，载体可以回收再利用。
但由于有些机理不十分明了，在给酶量、吸附程度与固定化酶活力回收的关系不可预见性大，同时由于吸附法制备的固定化酶易脱落，影响产物纯度和酶的操作为稳定性。
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2.包埋法
定义：
将酶或含酶菌体包埋在各种多孔载体中，使酶固定化的方法称为包埋法。
包埋法操作简单，由于酶分子只被包埋，未进行化学反应，可以制得较高活力的固定化酶。
对大多数酶、粗酶制剂甚至完整的微生物细胞都是适用的。
但是，只有小分子底物和产物可以通过凝胶网络，而对大分子底物不适宜；同时，凝胶网络对物质扩散的阻力导致固定化酶动力学行为的变化、活力降低。
包埋法常用凝胶包埋法和微囊化法。
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（1）凝胶包埋法
是将酶分子包埋在凝胶细微网格中，制成一定形状的固定化酶。
也称为网格型包埋法。
①聚丙烯酰胺凝胶包埋法
聚丙烯酰胺包埋法的缺点是酶容易漏失，以低分子量蛋白质为甚，如果调整交联剂浓度与交联程度可以得到克服。
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聚丙烯酰胺凝胶包埋法的一般制备过程：
将1ml溶于适当缓冲液的酶溶液加入含有750mg丙烯酰胺（单体）和40mgN，N’-甲叉双丙烯酰胺（交联剂）的3ml溶液中，再加0.5ml15％的二甲氨基丙腈（加速剂），同时，加入1％过硫酸钾（引发剂），混合，于25℃保温10min，便得含酶凝胶。
将凝胶粉碎，制得不规则的颗粒，于低温储存或冷冻干燥。
若制备珠状固定化酶，可以在聚合反应开始时，立即转入到疏水相（一种乳化剂，与水相有相同密度）的有机溶液中，使分散成含酶的珠状凝胶。
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②辐射包埋法。
酶溶于纯单体水溶液、单体加合物水溶液或纯聚合物溶液中，在常温或低温下，用x-射线、Y-射线或电子束辐照，可得到包埋酶的亲水凝胶。
1973年H.Maeda等用聚乙烯水溶液辐照包埋了多种酶。
这些被固定的生物物质主要分布在载体表面层区域，固定化产物表面具有生物活性，曾称这种方法为粘附法。
这种方法可粘附酶、叶绿素、病毒等，长期使用后仍有较高的活性。
如用X-射线引发聚丙烯酰胺聚合，可以固定胰蛋白酶。
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③其他凝胶包埋法。
a.淀粉凝胶包埋法：
将氨基甲酸乙酯的泡沫垫浸入温热的淀粉溶液和乙酰胆碱脂酶的混合物中，再经冷却、干燥，便制得固定化乙酰胆碱脂酶。
为增强机械强度和重新水合可加入一定量的甘油。
b.胶原包埋法（即大分子络合法）：
胶原有纤维性，易成膜，能在生理pH下自发的聚焦成束，胶束末端可以通过多种次级键与酶分子相互作用，通过酶和胶原分子形成网架而将酶固定化。
其制备方法极为简单：
将酶加到胶原悬浮液中、铺膜、干燥即得固定化酶。
或者经过透析的酶和胶原混合，插入电极，酶-胶原复合物便在电极上沉淀。
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d.卡拉胶包埋法：
卡拉胶（K-Carrageenin）是由角叉菜（鹿角菜）中提取的一种多糖。
包埋酶的方法为：
将100g酶在37~50℃溶于水中，再将1.7g卡拉胶在40~60℃溶于34ml生理盐水中，二者混合后冷却至10℃，所成凝胶浸在0.3mol/LKCl溶液中硬化，作成适当大小的颗粒，即为固定化酶。
c.海藻酸钙包埋法
称取一定量的海藻酸钠配成水溶液，经杀菌冷却后，与一定体积的酶或细胞悬浮液混合均匀，然后用注射器或滴管将冷悬液滴入一定浓度的凝固浴中（常用CaCl2溶液），形成球状固定化酶（或细胞）。
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e.天然血纤维包埋法：
血纤维不会引起抗体形成，且无毒。
在柠檬酸缓冲液中使酶和血纤蛋白原及凝血酶混合、便制得血纤蛋白包埋的固定化酶。
f.大豆蛋白包埋法：
含葡萄糖异构酶的链霉菌菌株与大豆蛋白溶液混合，在60℃用碳酸镁处理使其凝结，过滤、制球，干燥后用戊二醛和六甲叉二胺处理，硬化，从而制得固定化葡萄糖异构酶。
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（2）微囊型包埋法
是将酶包埋在各种高分子聚合物制成的小球（微囊）内，制成固定化酶。
由于固定化形成的酶小球直径一般只有几微米至几百微米，所以也称为微囊化法。
微囊一般直径约1～100um，膜厚约100nm，膜上孔径约3.6nm，表面积与体积之比极大，物质能很快达到平衡，能有效的包埋许多种酶。
同时、可用不同类型、不同浓度的酶、细胞提取物或细胞，不同组成和含量的膜包裹组建成人工细胞.因此，此法在医疗上极为有用。
例如：
固定化天门冬酰胺酶（治疗白血病）就是用这种方法制成的微胶囊。
微胶囊的制备方法有多种。
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①界面沉淀法
这是一种简单的物理法，它是利用某些高聚物在水相和有机相的界面上溶解度较低而形成的皮膜将酶包埋。
高聚物有：
硝酸纤维素、聚苯乙烯和聚甲基丙烯酸甲酯等。
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②界面聚合法
是用化学手段制备微囊的方法。
利用油水界面上发生聚合反应形成聚合体而将酶包裹起来。
制备方法一般是：
将酶溶液与亲水单体（如乙二醇）用一种水不溶混的有机溶剂制成乳化液，再将溶于同一有机溶剂疏水单体（如多异氰酸）溶液在搅拌下加入到上述乳化液，便在乳化液中的水相和有机溶剂之间的界面发生聚合。
这样水相中酶便包埋在聚合体（聚脲）膜内。
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例如：
用含酶的10％血红蛋白水溶液与己甲叉二胺的水溶液混合，立即在1％的氯仿-环已烷中分散乳化,加入癸二酰氯（有机相）后，便在油-水界面发生聚合反应，弃除上清液，加入Tween-20去乳化,洗除有机溶剂，除去未聚合单体后，转入水相，制得固定化酶。
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例如：
将卵磷脂、胆甾醇和二鲸腊磷酯按7：
2：
1溶于氯仿中，再加入酶液，混合物在旋转蒸发器中、在氮气下32℃转动乳化，然后在室温下保持2h，再在氮气气流中，4℃用超声波处理10s，在室温下保持2h，过Sepharose6B柱，收集脂质体，离心分离脂质体；所得球粒悬浮于缓冲液中，继续超声波处理，并过Sepharose6B柱，可得含酶的微囊。
③脂质体包埋法
近年来采用双层脂质体形成极细球粒包埋酶。
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3.共价键结合法
共价键结合法是酶蛋白的侧链基团和载休表面上的功能基团之间形成共价键而固定的方法。
特点：
酶与载体结合牢固，酶不易脱落，但反应条件较激烈，酶易失活，同时，制作手续亦较繁琐。
共价键结合法制备固定化酶的“通式”：
首先载体上引进活泼基团
关键
然后活化该活泼基团
最后此活泼基团再与酶分子上某一基团形成共价键
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酶分子和载体连接的功能基团
①酶蛋白N-端的α-氨基或赖氨酸残基的ε-氨基。
②酶蛋白C-端的羧基、Asp残基β-羧基和Glu残基γ-羧基。
③Cys残基的巯基。
④Ser、Tyr、Thr残基的羟基。
⑤Phe和Tyr残基的苯环。
⑥His残基的咪唑基。
⑦Trp残基的吲哚基。
在实际中偶联最普遍的基团是：
氨基、羧基以及苯环。
被偶联的基团还应是酶活性的非必需基团，
否则将导致酶失去活性。
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（2）载体的选择
载体直接关系到固定化酶的性质和形成。
对载体的一般要求是:
①一般亲水载体在蛋白质结合量和固定化酶活力及其稳定性上都优于疏水载体。
②载体结构疏松，表面积大，有一定的机械强度。
③载体必须有在温和条件与酶共价结合的功能基团。
④载休没有或很少有非专一性吸附。
⑤载体来源容易，便宜，并能反复使用。
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（3）偶联反应
酶和载体的连接反应取决于载体上的功能基团和酶分子上的非必需侧链基团，而且是在十分温和的pH、中等离子强度和较低温的缓冲液中进行。
现已有许多种偶联反应都能制备固定化酶，如：
重氮法、叠氮反应、芳香烃化反应、巯基-二硫基交换反应、溴化氰-亚胺碳酸基反应等。
这些方法在实际运用中经济意义起着决定性作用，必须考虑到酶的偶联效率，固定化酶总活力，操作的简便性以及载体与试剂的成本等因素。
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举例：
重氮法是将带芳香族氨基的载体，先用NaNO2和稀盐酸处理成重氮盐衍生物，再在中性偏碱（pH8~9）条件下与酶蛋白发生偶联反应，得到固定化酶。
反应示意式如下：
可能与酶蛋白中Tyr的酚基，His的咪唑基生成重氮衍生物，在过量重氮盐存在下还可与酶蛋白的N-端氨基或Lys的ε氨基形成双偶氮化合物。
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4.交联法
是利用双功能或多功能试剂在酶分子间或酶与载体间，或酶与惰性蛋白间进行交联反应，以制备固定化酶的力法。
最常用的交联试剂是戊二醛，其他如苯基二异硫氰、双重氮联苯胺-2，2’二磺酸、1，5-二氟-2，4-二硝苯等。
用戊二醛交联制备固定化酶的反应如下：
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例如：
将500mg酶溶于5m1、0.2mol/LpH6醋酸缓冲液中，在搅拌下滴加2m12.5％戊二醛，在室温下放置10~30min，会有沉淀析出，1~3h内反应结束。
形成的凝胶切碎后水洗，除多余戊二醛，即为固定化酶。
交联法有下列方法：
（1）交联酶法
在一定条件下，加入一定量的戊二醛溶液于酶溶液中，生成不溶性固定化酶。
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交联酶法反应中，酶和试剂的浓度、溶液pH和离子强度、温度、反应时间等均有一定的影响。
温度也有一定影响。
如木瓜蛋白酶和戊二醛在pH6.0、0℃长时间反应，只得可溶性固定化酶，若在室温下0~5h，即可形成不溶性固定化酶。
这种情况对不同酶可能有不同的结果。
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（2）酶与辅助蛋白交联法
用双功能或多功能试剂使惰性蛋白与酶共交联，从而制备固定化酶。
由于酶在交联反应过程中因化学修饰而引起失活，或因可得到的酶量有限时，因此，通常以一些辅助蛋白，如牛血清白蛋白、明胶、胶原、抗体等，与酶一起进行交联。
例如：
10mg脲酶与2.5ml含6％白蛋白、0.2％戊二醛的0.02mol/LpH6.8磷酸缓冲液混合，冷却到-30℃后，再升温至4℃下放置4h，将形成的泡沫聚合物彻底洗除后，冻干，即为固定化脲酶。
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（3）载体交联法
是用多或双功能试剂的一部分功能基团与载体交联，另一部分功能基团与酶蛋白交联而制备固定化酶的方法。
例如：
尼龙固定化木瓜蛋白酶的制备
尼龙布用含18.6％CaC12和18.6％水的甲醇溶液处理10min，洗净吸干，于3.65mol/LHCl、45℃水浴中水解45min，水洗至中性，吸干，用5％戊二醛溶液于20℃搅拌交联20min，用磷酸缓冲液洗去多余戊二醛。
2g处理载体（尼龙）加入4ml酶溶液（1mg/ml）于4~5℃下固定3h后，用0.1mol/LpH7.5磷酸缓冲液（内含0.5mol/LNaCl）洗涤，除去多余酶液，抽干，即为固定化木瓜蛋白酶。
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例：
壳聚糖微球固定化木瓜蛋白酶制备。
①壳聚糖微球制备：
4g壳聚糖洛于2％100m1醋酸溶液，在搅拌下缓慢滴入烧杯中的透平油（酸性胶与透平油的比例为1：
3）中，按4：
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1比例加入25％戊二醛溶液，再用1mol/LNaOH溶液调pH9~10，置水浴（60~70℃）中3h，冷却后，弃去上层油液，依次用石油醚、丙酮、无水乙醇、水洗涤，真空干燥备用。
单用戊二醛等试剂文联制备的固定化酶活力较低，常将此法与吸附法、包埋法结合使用，可以达到既提高固定化酶的活力，又起到加固的效果。
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②酶的固定化：
0.5g载休于0.1mol/LpH7.2磷酸缓冲液浸泡24h，抽干，加入1.6mg/ml的木瓜蛋白酶溶液0.6mL，4~8℃下吸附12h，滴入0.6％戊二醛溶液3m1，于4~8℃交联3h后．弃去上层溶液，用0.1mol/LpH7．2磷酸缓冲液（含NaCl0.5mol/L）洗多次，吸干水分，即得固定化酶。
活力回收约60％，在填充休反应器内连续水解酪蛋白（0.5％）时半衰期为16d.
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另一种方法是酶交联后再用凝胶包埋。
例：
1mg/m1（601U/m1）脲酶的0.02mol/LpH6.8磷酸缓冲液与等体积2.5％戊二醛的上述缓冲液混合，4℃反应10h，加G1y至0.1mol/L，终止交联，得交联酶。
1ml60％丙烯酰胺和1.6％N，N’-甲叉双丙烯酰胺与5mL上述交联酶液混合，37℃保温（为溶液A）。
另取96mg琼脂糖在6mL水中煮沸5min，在搅拌下冷却至40℃（溶液B）。
在溶液B中加入0.5mlN，N，N’，N’—四甲基乙二胺，3.6mg过硫酸铵，立即加入溶液A，4℃聚合30min，凝胶水洗，干燥，即为固定化酶。
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各类固定化方法的特点比较:
比较项目
吸附法
结合法
交联法
包埋法
物理吸附
.共价键结合
离子键结合
制备难易
易
难
易
较难
较难
固定化程度
弱
强
中等
强
强
活力回收率
较高
低
高
中等
高
载体再生
可能
不可能
可能
不可能
不可能
费用
低
高
低
中等
低
底物专一性
不变
可变
不变
可变
不变
适用性
酶源多
较广
广泛
较广
小分子底物、药用酶
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二、微生物细胞的固定化方法
固定在载体上并在一定的空间范围内进行生命活动的细胞称为固定化细胞。
固定化细胞的目的：
不需多次培养、扩大，可以缩短发酵生产周期。
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固定化细胞的特点
细胞类型：
微生物细胞、植物细胞、动物细胞
生理状态：
死细胞（完整细胞、细胞碎片、细胞器）
活细胞（增殖细胞、静止细胞、完整细胞）
形状：
颗粒状、块状、条状、薄膜状或不规则形状。
最多使用：
颗粒状珠体
使用周期：
理论上讲，固定化增殖细胞保持了细胞原有的全部活性，只要载体不解体，不污染就可长期使用。
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微生物固定化技术
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1.包埋法
包埋法是制备固定化细胞最常用的方法。
将产酶菌株用包埋剂如聚丙烯酰胺凝胶、琼脂糖凝胶、琼脂、海藻酸、卡拉胶、醋酸纤维、胶原、明胶等包埋起来，发挥酶或酶系的作用。
1977年我国投入生产的固定化青霉素酰胺酶，是使用明胶、戊二醛包埋大肠杆茵而成。
美国、欧洲和日本等大规模生产高果糖浆的工艺多数采用固定化菌体的酶柱工艺。
菌体细胞的固定化方法基本上沿用酶固定化方法，主要有：
包埋法、吸附法和无载体法等。
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包埋法制备固定化细胞与其制备固定化酶大体相似，兹举例介绍如下。
①聚丙烯酰胺凝胶包埋法
3m1细胞悬浮液，加入12m1生理盐水和丙烯酰胺2.25g、甲叉双丙烯酰胺O.25g、5％二甲氨基丙氰1.5ml及2.5％过硫酸铵1.5ml，在10min内聚合，得到终浓度为15％的聚丙烯酰胺凝胶。
切成3mm×3mm×3mm小块，用蒸馏水、生理盐水各洗二次，抽干即可。
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例如：
用聚丙烯酰胺包埋大肠杆菌（E．coliATCCll303）固定天冬氨酸酶：
将大肠杆菌细胞悬浮液和单体溶液（750g丙烯酰胺和40gN，N’-甲叉双丙烯酰胺溶于2.4L水）在8℃混合后，加入100m125％（体积比）P-二甲氨丙氰和500ml1％过硫酸钾，混匀后于20～25℃放置约5min开始聚合并升温，当升至30℃即用冷水冷却，放置15～20min完成聚合。
凝胶切成直径3～4mm颗粒。
再用水洗涤。
约10ml凝胶相当于1g湿细胞，酶活力约为1300～1800umol/h。
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②琼脂凝胶包理
3m1细胞悬浮液加入到20ml、4％琼脂液（45℃）中，搅拌均匀，凝固后，切成3mm×3mm×3mm小方块，用100m1生理盐水洗二次。
③明胶包埋法
将3m1细胞悬浮液加入到200ml10％明胶液，34℃混匀冷凝后，切块，加入20m15％戊二醛溶液，室温下文联1.5h，用蒸馏水、生理盐水各洗二次。
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④海藻酸盐包埋
3m1细胞悬浮液加入到海藻酸钠溶液中，再用注射器注入2％CaCl2溶液中，形成珠状固定化酶，置冰箱10h，用100ml生理盐水洗二次。
⑤卡拉胶包埋法
8g湿菌、8m1生理盐水在45℃混匀；再将1.5g卡拉胶溶于3m1生理盐水中，两者于50℃混合后、冷至10℃，30min后．将凝胶浸于0.3mol/LKCl溶液中4h，切块或制粒。
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2.吸附法
利用载体和细胞表面所带电荷的静电引力，使细胞吸附于载体上。
吸附法分物理吸附法和离子交换吸附法。
该法操作简单，固定化过程对细胞活性影响小。
影响吸附固定化的因素：
Z-电位
细胞的性质和细胞壁的组成
载体的性质
pH
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①物理吸附法
物理吸附法是将微生物细胞附着于固体载体上的一种固定方法。
载体常用的多孔砖、瓷杯、木屑、蔗渣、聚氯乙烯、硅藻土、玻璃纤维等。
例如：
将酵母用聚氯乙烯或多孔砖固定化，每g载体可以固定80mg酵母；也可将固定化的酿酒酵母，装入反应柱，以生产乙醇，乙醇可达120g/L。
物理吸附法载体与微生物细胞间不起反应，吸附量大，但细胞极容易脱落而流失，有待于进一步改善。
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②离子交换吸附法
利用离子交换吸附细胞常用的载体是离于交换树脂。
例如：
利用阴离子交换树脂吸附放线菌（产葡萄糖异构酶）菌株；用离子交换纤维素吸附无色杆菌（含头孢霉素酰化酶菌株）；用离子交换纤维素吸附米曲霉（含转化酶菌株）等获得成功。
这种方法制备的固定化细胞，细胞易脱落，需不断补充新细胞。
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③无载体法
这是选择适当的条件，通过一定处理使酶固定在细胞内的一种方法。
如葡萄糖异构酶是一种胞内酶，将生物细胞加热至60℃，10min，其他酶失活，则该酶被固定在细胞内，所以又称加热固定化。
又如链霉菌细胞用柠檬酸处理使酶固定在细胞内，若再用壳聚糖处理，使之凝聚干燥即成固定化细胞。
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几种固定化方法的比较
吸附法：
条件温和、方法简便、载体可再生。
但操作稳定性差。
包埋法：
细胞和载体间没有束缚，固定化后，细胞仍保持较高活力。
但这类方法只适用于小分子底物。
共价法：
操作稳定性高。
但由于试剂的毒性，易引起细胞的破坏。
交联法：
可得到高细胞浓度，但机械强度低，无法再生，不适于实际应用。
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第三节固定化酶（细胞）的性质
及其影响因素
一、固定化酶活力
与其溶液酶相比，大多数固定化酶活性下降。
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固定化酶活力下降的主要原因
酶与不溶性载体相结合引起结构发生了变化；
酶活性中
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