酶制剂的分析.docx
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酶制剂的分析
酶制剂的分析
淀粉质原料中可发酵性物质是淀粉，细胞中的淀粉颗粒由于受植物细胞壁的保护，不易被淀粉酶作用，必须经过粉碎和蒸煮以破坏植物组织细胞，使淀粉游离出来并转化为糊化状态。
糊化之后的淀粉浆要通过酶进行分解，酶解工艺主要包括淀粉的液化和糖化两个步骤，液化是利用耐高温--淀粉酶使糊化的淀粉浆黏度降低，并将淀粉水解成糊精和低聚糖；糖化是利用糖化酶将液化得到的糊精和低聚糖彻底水解成葡萄糖，供酵母菌进行呼吸作用产生酒精。
酒精生产所用酶制剂的检测项目包括酶活力、酶活保存率、pH值、干燥失重、细度、容重、重金属、铅、砷等理化指标和微生物检测。
第1节耐高温α-淀粉酶
耐高温α-淀粉酶采用地衣芽孢杆菌经深层培养和提取而成，具有极好的耐热性，能随机水解淀粉和糖原及其降解物内部的α-1，4-葡萄糖苷键，使胶状淀粉溶液的黏度迅速下降，产生可溶性糊精和寡聚糖，过度水解可产生少量葡萄糖和麦芽糖。
1、采样
取样过程中所使用的采样工具（探子、铲子、镊子、钥匙、采样器等）和盛放中样的工具（如试管、锥形瓶、容器等）等要先进行高压灭菌以保持无菌状态，容器必须清洁、干燥、防漏、广口、灭菌，大小适合盛放检样。
按表5-1抽取样品，每批取样量不少于300mL（或300g），不足者按比例适当加取。
表5-1样品抽取量
批量/桶（或箱）
样本大小/桶（或袋）
＜50
2
51~500
3
＞500
4
液态淀粉酶抽样前先摇动或用灭菌棒搅拌液体，尽量使其达到均质，然后再取所需量的样品。
装入灭菌盛样容器的量不应超过其容量的四分之三，以便于检验前将样品摇匀。
固体淀粉酶则用灭菌抽样器由几个不同部位采取，放人灭菌容器内混合成一份样品。
取样后立即贴上标签，注明样品名称、规格、数量、生产厂名称、取样时间及地点、采样人。
将样品分为两份，1/4样品封存，保留半个月备查，3/4样品立即送往化验室进行捡验。
2、酶活力
耐高温α-淀粉酶活力单位是指在70℃、pH6.0条件下，lmin液化lmg可溶性淀粉成为糊精所需要的酶量，即为1个酶活力单位。
酶活力的测定有分光光度法和目视比色法两种方法。
Ⅰ分光光度法
（1）原理
α-淀粉酶能将淀粉分子链中的α-1，4-葡萄糖苷键随机切断成长短不一的短链糊精、少量麦芽糖和葡萄糖。
而使淀粉对碘呈蓝黑色的特异性反应，随淀粉降解蓝色逐渐减退，渐变成红棕色，其颜色消失的速度与酶活性有关，故可在标准条件下通过测定反应后溶液的吸光度计算其酶活力。
（2）试剂
1）原碘液称取碘化钾22.0g溶于约300mL水中，加入碘11.0g，在搅拌下使其溶解，然后移人500mL容量瓶中，用水定容，贮于棕色瓶中备用（每月制备一次）。
2）稀碘液称取碘化钾20.0g溶于约300mL水中，准确加入原碘液2.00mL，全部移入500mL容量瓶中，用水定容，贮于棕色瓶中备用（须当天配制）。
3）20g/L可溶性淀粉溶液称取可溶性淀粉（以绝干计）2.0000g，精确至0.0001g，用水调成浆状物，在搅动下缓缓倾入70mL沸水中，然后以30mL水分几次冲洗盛淀粉的小烧杯，洗液并人其中，加热煮沸2min直至完全透明，冷却至室温后全部移入l00mL容量瓶，用水稀释至刻线。
此溶液必须当天配制。
4）磷酸缓冲液（pH=6.0）称取磷酸氢二钠（NazHP04·12H20）45.23g、柠檬酸（C6H807·H20）8.07g，用水溶解并定容至1000mL，配好后用pH计校正。
5）盐酸溶液c（HCI）=0.lmol/L。
（3）仪器
1）分光光度计。
2）恒温水浴50~100℃，精度士0.1℃。
3）试管25mm×200mm。
4）容量瓶。
5）自动吸管。
6）秒表。
（4）分析步骤
1．待测酶液的制备
1）液体酶制剂直接用缓冲液配制，使最终酶液浓度控制在65~70U/mL范围内。
2）固体酶制剂称取酶粉1~2g，精确至0.0002g，先用少量磷酸缓冲液溶解，并用玻璃搅棒捣研（或用磁力搅拌器搅拌），直至固体全部溶解（约10~15min），将上清液小心倾入容量瓶中，沉渣部分再加入少量缓冲液，如此捣研3~4次，最后全部移入容量瓶中，用缓冲液稀释至刻度（使酶浓度控制在65~70U/mL范围内），摇匀。
通过四层纱布过滤，收集滤液供测定用。
2．测定
吸取可溶性淀粉溶液20.OmL和缓冲液5.OmL于试管中，在70七恒温水浴中预热平衡Smin.加入稀释好的待测酶液1.00mL，立即用秒表记录时间，摇匀，准确反应5min.
立即用自动吸管吸取上述反应液1.OOmL，加到预先盛有O.lmol/L盐酸0.SmL和稀碘液5.00mL的试管中，摇匀.以0.1mol/L盐酸0.SmL和稀碘液5.00mL的混合液作为试剂空白，于660nm波长下，用lOmm比色皿迅速测定其吸光度（A）.根据吸光度查附录L求得测试酶液的浓度（c）.
（5）计算结果
X=16.67cn
式中X——样品的酶活力，U/mL或U/g；
c一一测试酶的浓度，U/mL；
N——样品的稀释倍数；
16.67——换算常数。
Ⅱ目视比色法
（1）原理
同分光光度法原理。
（2）试剂和溶液
1）原碘液称取碘化钾22.0g溶于约300mL水中，加入碘11.0g，在搅拌下使其溶解，然后移入500mL容量瓶中，用水定容，贮于棕色瓶中备用（每月制备一次）。
2）稀碘液称取碘化钾20.0g溶于约300mL水中，准确加入原碘液2.00mL，全部移入500mL容量瓶中，用水定容，贮于棕色瓶中备用（须当天配制）。
3）20g/L可溶性淀粉溶液称取可溶性淀粉（以绝干计）2.0000g，精确至0.0001g，用水调成浆状物，在搅动下缓缓倾入70mL沸水中，然后以30mL水分几次冲洗盛淀粉的小烧杯，洗液并入其中，加热煮沸2min直至完全透明，冷却至室温，全部移入l00mL容量瓶，用水稀释至刻线。
此溶液必须当天配制。
4）磷酸缓冲溶液（pH=6.0）称取磷酸氢二钠（Na2HP04·12H20）45.23g、柠檬酸（C6H8O7·H20）8.07g，用水溶解并定容至l000mL，配好后用pH计校正。
5）标准终点色溶液
A液：
称取氯化钴（CoCl2·6H20）0.2439g和重铬酸钾0.4878g，用水溶解并定容至500mL。
B液：
称取铬黑T（C20H12N3NaO7S）40mg，用水溶解并定容至l00mL。
C液（标准终点色溶液）：
取A液40mL与B液5.0mL充分混匀，备用。
此混合液于冰箱中保存，15天后需要重新配制。
（3）仪器
1）恒温水浴50~100℃，精度士0.1℃。
2）容量瓶。
3）试管25mm×200mm。
4）秒表。
（4）分析步骤
1．待测酶液的制备
1）液体酶制剂直接用缓冲液配制，使最终酶液浓度控制在300~350U/mL范围内。
2）固体酶制剂称取酶粉1~2g，精确至0.0002g，先用少量磷酸缓冲液溶解，并用玻璃搅棒捣研（或用磁力搅拌器搅拌），直至固体全部溶解（约10~15min），将上清液小心倾入容量瓶中，沉渣部分再加入少量缓冲液，如此捣研3~4次，最后全部移入容量瓶中，用缓冲液稀释至刻度，摇匀。
通过四层纱布过滤，收集滤液供测定用。
最终酶液浓度需控制在300~350U/mL范围内。
2．测定
吸取标准终点色溶液6mL于试管中，作为比色标准。
吸取20g/L可溶性淀粉溶液20mL和pH6.0的磷酸缓冲溶液5m。
置于25mm×200mm试管中，在70℃恒温水浴中预热平衡5min，然后加入预先稀释好的酶液0.5mL，立即用秒表记录时间，充分摇匀，当反应接近2min时，就开始不时地用吸管取出反应液1.00mL，加到预先盛有稀碘液5.00mL的试管中，当试管中反应溶液颜色由紫色渐变为红棕色、恰与标准终点色溶液相同时，即为反应终点，并记录到达终点所需时间（分钟）。
酶反应全部时间控制在2~2.5min之内。
（5）计算结果
式中X一一样品的酶活力，U/mL或U/g；
T——到达反应终点所需时间，min；
20——可溶性淀粉溶液体积，mL；
20/1000——可溶性淀粉溶液浓度，g/mL；
n——样品稀释倍数；
103——lg等于103mg；
0.5——测定酶液用量，mL。
3、酶活力保存率
（1）原理
根据标签上标示的酶活力和实测的酶活力，计算出实测酶活力为标示酶活力的百分数。
（2）计算结果
式中X——样品的酶活力保存率，%；
El一一样品的实测酶活力，U/g或U/mL；
E一一样品的标示酶活力，U/g或U/mL。
4、耐热性存活率
（1）原理
在一定温度和时间条件下对酶进行热处理，根据热处理前后测得的酶活力即可计算出酶的耐热性存活率。
（2）试剂
1）氢氧化钠溶液c（NaOH）=0.lmol/L。
2）糊精溶液称取糊精l00g于烧杯中，加水300mL，搅匀，加耐高温α-淀粉酶1300单位（每克糊精加13单位），置于电炉上加热至沸，冷却，用0.1mol/L氢氧化钠溶液调pH6.0~7.0，然后移入容量瓶中，用水稀释至刻线，摇匀备用。
（3）仪器
1）酸度计。
2）恒温水浴50~100℃，精度士0.1℃。
3）电炉1000W。
4）精密温度计分度值0.1℃。
5）分光光度计。
6）比色管50mL。
7）秒表。
（4）分析步骤
1．待测酶液的制备
1）液体酶制剂直接用糊精溶液配制，使最终酶液浓度控制在65~70U/mL范围内。
2）固体酶制剂称取酶粉1~2g，精确至0.0002g，先用少量糊精溶液溶解，并用玻璃搅棒捣研（或用磁力搅拌器搅拌），直至固体全部溶解（约10~15min），将上清液液小心倾入容量瓶中，沉渣部分再加入少量糊精溶液，如此捣研3~4次，最后全部移入容量瓶中，用糊精溶液稀释至刻度（使酶浓度控制在65~70U/mL范围内），摇匀。
通过四层纱布过滤，收集滤液供测定用。
2．热处理
吸取25mL待测酶液于50mL比色管中，置于95℃恒温水浴中热处理60min，冷却，用水补足至原酶液体积，摇匀。
3．测定酶活力
用分光光度计法或目视比色法进行。
（5）计算结果
式中X——样品酶耐热性存活率，%；
E1——样品热处理后实测的酶活力，U/mL或U/g；
E——样品热处理前实测的酶活力，U/mL或U/g。
5、pH值
（1）原理
将指示（玻璃）电极和参比（甘汞）电极浸入被测样液中，构成一个原电池，其电动势与溶液的值有关，通过测量原电池的电动势即可得出溶液的pH值。
（2）试剂
1）酒石酸盐标准缓冲溶液用无二氧化碳水溶解外消旋的酒石酸氢钾（KHC4H4O6），并剧烈振摇至饱和溶液。
25℃时，pH=3.56。
2）磷酸盐标准缓冲溶液称取磷酸二氢钾（KH2PO4）3.40g和磷酸氢二钠（Na2HPO4）3.55g溶于无二氧化碳的水中，并稀释至1000mL。
25℃时，pH=6.86。
磷酸二氢钾和磷酸氢二钠预先在120℃士10℃干燥2h。
3）硼酸盐标准缓冲溶液称取四硼酸钠（Na2B4O7·10H2O）3.81g，溶于无二氧化碳水中，并稀释至l000mL，此溶液浓度c（Na2B4O7·10H2O）=0.01lmol/L。
25℃时，pH=9.18。
存放时应防止空气中二氧化碳进入。
4）氢氧化钙标准缓冲溶液于25℃用无二氧化碳水溶解氢氧化钙制成饱和溶液，其浓度c[1/2Ca（OH）2]应在0.0400~0.0412mol/L。
存放时应防止空气中二氧化碳进入。
一旦出现浑浊应弃去重配。
25℃时，pH=12.45。
（3）仪器
1）pH计分度值为0.02pH单位，并备有电磁搅拌器。
2）指示（玻璃）电极用前须在水中浸泡24h以上，用后应立即清洗，并浸入水中。
3）参比（饱和甘汞）电极使用时电极上端小孔的胶皮塞必须拔出，以防止产生扩散电位，影响测定结果。
电极内氯化钾溶液中不能有气泡，以防止断路。
（4）分析步骤
等温度补偿旋钮调至25℃，用接近于被测溶液pH值的两种标准缓冲溶液校正pH计，定位。
用水冲洗电极，再用样液洗涤电极，调整样液温度并将温度补偿调至25℃，测定样液的pH值。
重复测定操作，直到pH值读数稳定lmin为止。
（5）计算结果
从pH计上直接读出读数。
6、干燥失重
（1）原理
在常压下，将试样置于103℃士2℃电热干燥箱中烘干2h，用称量法测定其失去挥发物的质量，以百分数表示。
（2）仪器
1）电热干燥箱103℃士2℃。
2）称量瓶25mm×40mm。
3）干燥器以变色硅胶作干燥剂。
4）分析天平感量0.1mg。
（3）分析步骤
用烘干至恒重的称量瓶称取酶样约2g，精确至0.0002g，置于103℃士2℃电热干燥箱中，将称量瓶盖取下，侧放在称量瓶旁，烘干2h，取出加盖，放入干燥器中冷却至室温（约30min）后称量。
（4）计算结果
式中X——样品的干燥失重，%；
ml——干燥前称量瓶加样品的质量，g；
m2——干燥后称量瓶加样品的质量，g；
m——称量瓶的质量，g。
7、容重
（1）原理
量取固体酶样（或液体酶）l00mL，在20℃称其质量，计算单位体积酶的质量，即为样品的容重。
（2）仪器
1）恒温水浴20℃士0.1℃。
2）分析天平感量为0.1mg。
3）容量瓶l00mL（准确校正过）。
（3）分析步骤
用一个洁净、干燥的已知质量的l00mL容量瓶，取下瓶塞，在上口处，放一个三角玻璃漏斗，将酶样（20℃）自然地缓缓地注人容量瓶中（不要礅），直至刻度。
取下三角漏斗，加盖瓶塞，称量。
（4）计算结果
式中X——样品的容重，g/mL；
ml——容量瓶加样品的质量，g；
m——容量瓶的质量，g.
8、细度
（1）原理
取一定量的酶样，用规定的标准筛进行筛分，称量，计算通过标准筛酶样的质量占总取样量的百分数。
（2）仪器
1）标准试验筛SSW1.18/0.630mm（相当于原14目）；SSW0.80/0.450mm（相当于原20目）；SSW0.40/0.250mm（相当于原39目）i；SSW0.25/0.160mm（相当于原62目）。
2）物理天平感量为0.2g。
（3）分析步骤
称取固体酶样l00g，精确至0.2g。
将规定的标准筛装上筛底盘，然后把称好的样品全部转入标准筛上，加盖振荡筛分5min（并不时敲打筛梆），静置2min，取下上盖，小心将筛上物全部转人到已知质量的烧杯中，用天平称量，计算。
（4）计算结果
式中X1——样品的细度，%；
m——筛上物（或中间物）的质量，g；
100一一取样量，g。
9、重金属
（1）原理
在弱酸性（pH3~4）条件下，试样中的重金属离子与硫化氢作用，生成棕黑色，与同法处理的铅标准溶液比较，做限量试验。
（2）试剂
1）硝酸。
2）硫酸。
3）盐酸。
4）盐酸6mol/L量取50mL盐酸，用水稀释至lOOmL。
5）盐酸1mol/L量取8.3mL盐酸，用水稀释至lOOmL。
6）氨水。
7）氨水6mol/L量取40mL氨水，用水稀释至l00mL。
8）氨水1mol/L量取6.7mL氨水，用水稀释至l00mL。
9）乙酸盐缓冲液pH3.5称取25.0g乙酸铵溶于25mL水中，加6mol/L盐酸45mL，用稀盐酸或稀氨水调节pH值至3.5，用水稀释至l00mL。
10）酚酞指示液1%乙醇溶液。
11）饱和硫化氢水将硫化氢气体通入不含二氧化碳的水中，至饱和为止（此溶液临用前制备）。
12）1%硝酸取lmL硝酸加水稀释至l00mL.
13）铅标准溶液称取0.1598g高纯硝酸铅，溶于l0mL1%硝酸中，定量移入l00mL容量瓶中，用水稀释至刻度。
此溶液lmL相当于1.0mg铅。
临用前用水稀释100倍，使成1.0mL相当于10μg铅。
（3）仪器
纳氏比色管，50mL.
（4）测定
1．试样制备
试样处理可按下列方法之一进行。
1）湿法消解称取5.0g试样，置于250mL凯氏烧瓶或三角烧瓶中，加10~15mL硝酸浸润试样，放置片刻（或过夜）后，缓缓加热，待作用缓和后稍冷，沿瓶壁加人5mL硫酸，再缓缓加热，至瓶中溶液开始变成棕色，不断滴加硝酸（如有必要可滴加些高氯酸，在操作过程中应注意防止爆炸）。
至有机质分解完全，继续加热，至生成大量的二氧化硫白色烟雾，最后溶液应呈无色或微带黄色。
冷却后加20mL水，煮沸除去残余的硝酸至产生白烟为止。
如此处理两次，放冷。
将溶液移入50mL容量瓶中，用水洗涤凯氏烧瓶或锥形瓶，将洗液并入容量瓶中，加水至刻度，混匀。
每l0mL溶液相当于1.0g试样。
取同样量的硝酸、硫酸，按上述方法做试剂空白试验。
2）干法消解称取试样5.0g置于坩埚中，加入适量硫酸浸润试样，小火炭化后，加2mL硝酸和5滴硫酸，小心加热，直到白色烟雾挥尽，移人高温炉中，于550℃灰化完全，冷却后取出，加6mol/L盐酸2mL湿润残渣，于水浴上慢慢蒸发至干。
用1滴浓盐酸湿润残渣，并加l0mL水，于水浴上再次加热2min，将溶液移入50mL容量瓶中，如有必要须过滤，用少量水洗涤坩埚和滤器，洗滤液一并移入容量瓶中，混匀，每l0mL溶液相当于1.0g试样。
在试样灰化同时，另取一坩埚按上述方法做试剂空白试验。
2．测定
A管：
吸取含铅量相当于指定的重金属限量的铅标准溶液（不低于l0μg铅）于50mL纳氏比色管中，加水至25mL，混匀，加1滴酚酞指示液，用6mol/L稀盐酸或lmol/L稀氨水调节pH至中性（酚酞红色刚褪去），加入pH3.5的乙酸盐缓冲液5mL，混匀，备用.
B管：
取一支与A管所配套的纳氏比色管，加入10~20mL（或适量）试样液，加水至25mL，混匀，加1滴1%酚酞指示液，用6mL稀盐酸或lmol/L稀氨水调节pH至中性（舀酞红色刚褪去），加入pH3.5的乙酸盐缓冲液5mL，混匀，备用。
C管：
取一支与A、B管所配套的纳氏比色管，加入与B管等量的相同的试样液，再加入与A管等量的铅标准溶液，加水至25mL，混匀，加1滴1%酚酞指示液，用稀盐酸或稀氯水（6mol/L或lmol/L）调节pH至中性（酚酞红色刚褪去），加入pH3.5的乙酸盐缓冲液5mL，混匀，备用。
问各管中加入l0mL新鲜制备的硫化氢饱和液，并加水至50mL刻度，混匀，于暗处放置5min后，在白色背景下观察，B管的色度不得深于A管的色度，C管的色度应与A管的色度相当或深于A管的色度。
10、铅
Ⅰ二硫腙比色法
（1）原理
试样经消化后，在pH8.5~9.0时，铅离子与二硫腙生成红色络合物，溶于三氯甲烷。
加入柠檬酸铵、氰化钾和盐酸羟胺等防止铁、铜、锌等离子干扰，再与标准系列比较定量。
（2）试剂
1）氨水（1十1）。
2）盐酸（1十1）量取l00mL盐酸，加入l00mL水中。
3）酚红指示液（lg/L）称取0.10g酚红，用少量多次乙醇溶解后移入l00mL容量瓶中并定容至刻度。
4）盐酸羟胺溶液（200g/L）称取20.0g盐酸羟胺，加水溶解至50mL，加2滴酚红指示液，加氨水（1十1），调pH至8.5~9.0（由黄变红，再多加2滴），用二硫腙-三氯甲烷溶液提取至三氯甲烷层绿色不变为止，再用三氯甲烷洗二次，弃去三氯甲烷层，水层加盐酸（l十1）呈酸性，加水至l00mL。
5）柠檬酸铵溶液（200g/L）称取50g柠檬酸铵，溶于l00mL水中，加2滴酚红指示液，加氨水（1十1），调pH至8.5~9.0，用二硫腙-三氯甲烷溶液提取数次，每次10~20mL，至三氯甲烷层绿色不变为止，弃去三氯甲烷层，再用三氯甲烷洗二次，每次5mL，弃去三氯甲烷层，加水稀释至250mL。
6）氯化钾溶液（l00g/L）称取10.0g氰化钾，用水溶解后稀释至100mL。
7）三氯甲烷不应含氧化物。
1 检查方法量取l0mL三氯甲烷，加25mL新煮沸过的水，振摇3min，静置分层后，取l0mL水液，加数滴碘化钾溶液（l00g/L）及淀粉指示液，振摇后应不显蓝色。
2 处理方法在三氯甲烷中加入1/10~1/20体积的硫代硫酸钠溶液（200g/L）洗涤，再用水洗后加入少量无水氯化钙脱水后进行蒸馏，弃去最初及最后的1/10馏出液，收集中间馏出液备用。
8）淀粉指示液称取0.5g可溶性淀粉，加5mL水搅匀后，慢慢倒入l00mL沸水中，边倒边搅拌，煮沸，放冷备用，临用时配制。
9）硝酸（1十99）量取lmL硝酸，加入99mL水中。
10）二硫腙三氯甲烷溶液（0.5g/L）保存冰箱中，必要时用下述方法纯化：
称取0.5g研细的二硫腙，溶于50mL三氯甲烷中，如不全溶，可用滤纸过滤于250mL分液漏斗中，用氨水（1十99）提取三次，每次l00mL，将提取液用棉花过滤至500mL分液漏斗中，盐酸（1十1）调至酸性，将沉淀出来的二硫腙用三氯甲烷提取2~3次，每次20mL，合并三氯甲烷层，用等量水洗涤二次，弃去洗涤液，在50℃水浴上蒸去三氯甲烷。
精制的二硫腙置于硫酸干燥器中干燥备用。
或将沉淀出来的二硫腙用200mL、200mL、100mL三氯甲烷提取三次，合并三氯甲烷层为二硫腙溶液。
11）二硫腙使用液吸取1.0mL二硫腙溶液，加三氯甲烷至l0mL混匀。
用lcm比色杯，以三氯甲烷调节零点，于波长510nm处测吸光度（A），用下式算出配制l00mL二硫腙使用液（70%透光率）所需二硫腙溶液的体积（V）。
12）硝酸-硫酸混合液（4十1）.
13））铅标准溶液（1.0mg/mL）精密称取0.1598g硝酸铅，加l0mL硝酸（1十99），全部溶解后，移人100mL容量瓶中，加水稀释至刻度。
14）铅标准使用液（10.0μg/mL）吸取1.0mL铅标准溶液，置于l00mL谷量瓶中，加水稀释至刻度。
（3）仪器
分光光度计。
（4）分析步骤
1．试样消化
称取5.00g试样，置于250mL定氮瓶中，先加少许水使湿润，加数粒玻璃珠、5mL硝酸后摇匀。
缓缓加入5mL硫酸，待作用缓和停止起泡沫后，先用小火缓缓加热，不断沿瓶壁补加硝酸，待泡沫全部消失后，再加大火力，至有机质分解完全，发生白烟，溶液应澄明无色或微带黄色，放冷。
加20mL水煮沸，除去残余的硝酸至产生白烟为止，如此处理两次，放冷。
将冷后的溶液移入50mL容量瓶中，用水洗涤定氮瓶，洗液并入容量瓶中，放冷，加水至刻度，混匀。
定容后的溶液每l0mL相当于lg试样，相当加入硫酸量lmL。
取与消化试样相同量的硝酸和硫酸，按同一方法做试剂空白试验。
2．测定
吸取10.0mL消化后的定容溶液和同量的试剂空白液，分别置于125mL分液漏斗中，各加水至20mL。
吸取0、0.10mL、0.20mL、0.30mL、0.40mL、0.50mL铅标准使用液（相当0.0、1.0μg、2.0μg、3.0μg、4.0μg、5.0μg铅），分别置于125mL分液漏斗中，各加硝酸（1十99）至20mL。
于试样消化液、试剂空白液和铅标准液中各加2.0mL柠檬酸铵溶液（200g/L），1.0mL盐酸羟胺溶液（200g/L）和2滴酚红指示液，用氨水（1十1）调至红色，再各加2.0mL氰化钾溶液（l00g/L），混匀。
各加5.0mL二硫腙使用液，剧烈振摇lmin，静置分层后，三氯甲烷层经脱脂棉滤入lcm比色杯中，以三氯甲烷调节零点，在波长510nm处测吸光度
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