多维气相色谱及其在中药领域中的研究进展.docx

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多维气相色谱及其在中药领域中的研究进展

多维气相色谱及其在中药领域中的研究进展

摘要：

多维气相色谱是近年来发展较为迅速的一种色谱分离技术，其高分辨、高效、高峰容量以及易与质谱等其他技术联用等优势正成为研究应用的热点。

多维气相色谱技术包含传统二维气相色谱法和全二维气相色谱法，本研究对多维气相色谱技术及其近年来在中药研究中的应用进行了综述，并对多维气相色谱的发展趋势和前景进行了展望。

关键词：

多维气相色谱；中药；应用；综述

DevelopmentsandApplicationsofMultidimensionalGasChromatographyInTraditionalChineseMedicine

Abstract:

Themultidimensionalgaschromatography（MDGC）isgettingaffractiveduetoitsadvantages,suchashighspeedandefficiency,andeasycombinationwithothertechnologies.ThisreviewsummarizedtherecentdevelopmentsofMDGC,comprehensivetwo-dimensionalgaschromatography（GC×GC）,anditsapplicationsintraditionalChinesemedicinestudy.Inaddition,theprospectandfurtherdevelopmentsofMDGCwerediscussed.

Keywords:

multidimensionalgaschromatography;traditionalChinesemedicine;application;review

20世纪，有很多复杂的样品用常规的色谱方法不能完全分开，如药用植物活性成分、石油样品[1-2]、植物精油、烟草研究[3-7]、煤焦油、生物医药样品等。

对这些样品，人们不得不采用复杂的、可能造成组分损失和变化的前处理方法对样品进行预处理；或者对气相色谱进行改进，如顶空气相色谱法、衍生化气相色谱法等。

即便如此，由于各类样品提取物的复杂性，单维的色谱分析不可能把所有欲分析的组分完全分离，因此需要发现具有更高分离能力的分析方法。

多维气相色谱（multidimensionalgaschromatography，MDGC）是利用两根或多根分离机制不同而又互相独立的色谱柱对样品进行分离分析的方法[8]，为中药成分分析提供了较好的分辨率，通过组合不同的分离模式构建多维系统有效地解决了复杂体系样品的分析问题。

本研究对多维气相色谱技术及其近年来在中药研究中的应用进行了综述，并对多维气相色谱的发展趋势和前景进行了展望。

1多维气相色谱的简介

1.1多维气相色谱的概念

在气相色谱分析中，一旦遇到难分离的物质时，改变固定相的选择性是首先考虑的因素。

因为热力学上不能分离的成分，无论怎样改变动力学条件，都不可能实现分离。

反过来思考，不同化学成分的理化特性总是有一定的差别的，在非极性色谱柱上不能分离的成分，在极性柱上一般可以得到分离。

根据分离度公式，增加分离度（R）的途径有两个，一是增加柱长，但R仅与柱长的平方根成正比，柱长增加2倍，R仅增加1.4倍，保留时间却延长2倍，事倍功半。

所以，增加柱长度不是提高分离度的最佳途径。

二是改变选择性因子α，假如α从1.05增加到1.10，R将增加1.9倍。

所以，改变选择性是提高分离度的最佳途径。

但是，对于高度复杂混合物，体系中可能包含不同沸点和不同极性的化合物，更换色谱柱，部分物质的分离效果改善后，其他物质的分离效果可能变差。

所以，要改善总体分离效果，应采用多维气相色谱（MDGC）。

多维气相色谱的早期开拓者-阿拉巴马州立大学的Bertsch教授对MDGC的定义是[9]，两根独立控制且极性不同的色谱柱，通过一定的切换手段，将第一根色谱柱的馏分选择性地转移到第二根色谱柱进行二次分离，从而获得比单柱更强大的分离能力的分离系统。

根据Bertsch的定义，样品前处理技术、GC/MS联用等，都不属于MDGC的范畴。

如果没有切换装置，仅把两根色谱柱直接串连起来，也不能算MDGC。

因为不同选择性色谱柱直接连接，仅是一种调节总体选择性的方式，其效果等同于采用混合固定相。

1.2多维气相色谱的操作原理

多维气相色谱的操作原理：

一维色谱的某些馏份（△t1和△t2），选择性地转移到二维柱，依靠两柱选择性的差异和峰容量的提高，使切割的成分获得更充分的分离。

Giddings[10-11]等人对多维色谱原理进行过深入研究。

Giddings推算，在一维色谱中，即使峰容量提高到两倍，考虑到随机因素，基线分离组分最多只能增加37%。

采用二维气相色谱，峰容量将是两柱的乘积（GC×GC）。

假设两根色谱柱的峰容量为50（中等情况），则二维气相色谱系统的峰容量约2500，相当于一维色谱具有1000万个理论塔板。

显然，如此高的分离能力，是常规的一维色谱不可能达到的。

其实，峰容量并不是多维色谱分离的最主要因素，两柱选择性差异对分离的贡献更大。

在非极性柱上的重叠成分，到极性柱上一般都可以分开。

在多维色谱中，首先需要两柱分离机制不一样。

如果两根色谱柱分离机制相同或过于相近，一维色谱上挤在一起的簇峰，转移到二维柱上，仍然可能是一簇峰。

1.3多维气相色谱的分类

多维气相色谱中，应用比较多的是传统二维气相色谱法和全二维气相色谱法。

传统二维气相色谱法也可简称为二维气相色谱法（Multidimensionalgaschromatography，MDGC）无论从理论上还是应用上，均已相当成熟，但仍存在不足之处；全二维气相色谱法（comprehensivetwo-dimensionalgaschromatography，GC×GC）发展比较成熟，已达到了实用水平。

1.3.1二维气相色谱法

1984年，Giddings阐释了传统二维色谱法的基本理论。

通常使用的二维气相色谱法（GC+GC）一般采用中心切割法进行分析，即从第一根（维）色谱柱预分离后的很小一部分馏分，被再次进样到第2根（维）色谱柱中进一步分离，而样品中绝大多数其他组分被放空或被中心切割。

尽管可以增加中心切割的次数来实现对感兴趣组分的分离，但由于组分流出第1柱进入第2柱时，其谱带已较宽，因此第二维的分辨率会受到损失。

另外，第二维的分析速度一般较慢，不能完全利用二维气相色谱的柱容量，只能实现对部分感兴趣组分的分离，无法对所有组分进行准确的定性和定量。

1.3.2全二维气相色谱法

全二维气相色谱是把分离机理不同且互相独立的两根色谱柱以串联方式结合成的二维气相色谱，两根色谱柱由调制器连接，调制器起捕集、聚焦、再传送的作用。

从一维柱流出的每一段馏分，都经调制器调制后再以脉冲方式送到二维色谱上分离，是全部的而不是部分的样品转移。

在全二维气相色谱分析中，馏分转移周期一般为2-10秒，二维分离必须在2-10秒之内完成，否则不同馏分将重叠，导致分析彻底失败。

二维色谱柱必须具备极快的分离速度，其特点必然是短、细和薄液膜。

二维柱不能太短，一般不宜小于lm，否则分离能力太差。

二维柱也不能太细，以0.1mm内径居多，否则阻力太大，影响载气流量。

二维柱固定相液膜也不能太薄，一般不宜低于0.1µm，否则柱容量太小，过载导致分离度急剧变差。

全二维气相色谱的工作模式很像GC/MS。

第二维色谱柱的快速分离，类似质谱仪的快速扫描；第二维的色谱图，类似全扫描质谱图[12]。

检测器检测到的响应信号经数据采集软件处理后，得到三维色谱图（x轴表示的是第1维柱的保留时间，y轴表示的是第2维柱的保留时间，z轴表示的是色谱峰的强度），或者是二维轮廓图。

1.3.3技术优势和劣势比较[12]

传统二维气相色谱法（MDGC）和全二维气相色谱法（cMDGC）各有优势和不足。

MDGC的优势包括：

（l）二维柱为常规毛细柱，不局限于快速柱，二维分离能力更高。

（2）对于复杂体系中的目标成分，MDGC/MS可提供具有更好的定性定量结果。

（3）对复杂体系中旋光物质，采用常规手性GC柱，MDGC可提供更好的分离效果。

（4）MDGC对检测器没有任何特殊要求，所有的GC检测器都可以使用。

（5）MDGC不需要特别的数据处理技术。

MDGC的缺点包括：

（1）样品全分析需要多次进样，耗时较长。

（2）系统构造复杂，毛细柱、限流管、中点限流器、监视检测器、分析检测器等连接复杂，常常让新手望而生畏。

（3）方法开发手续复杂。

系统载气流量需精心调节，限流管载气流量必须和分析柱一致，限流管规格选择较麻烦。

是在分析柱和质谱仪相联的情况下，分析柱流量只能用软件计算，无法直接测量。

作为GC的最新进展，cMDGC的优势十分明显，包括：

（1）峰容量最高，是真正意义上的GC×GC。

（2）全分析速度快。

只需1次进样，一个小时左右就可以完成全分析。

（3）系统简单，柱安装、载气流量设定都比MDGC简便。

（4）灵敏度高。

毫秒级峰宽，信噪比大大提高，灵敏度大大提高。

理论上比一维GC高20-50倍，实际上可提高5倍左右。

（5）GC×GC-TOF-MS-Deconvolution，构成4D分析，产生极其强大的分离、定性和定量能力。

（6）定量结果更可靠。

强大的分离能力，大大降低本底干扰，提高定量准确度。

（7）化合物族类分析功能。

一维非极性柱按沸点或分子量分离，二维极性柱按官能团或极性分离，方便考察混合物中的同系物。

全二维气相色谱也存在不足。

包括：

（1）二维柱分离能力有限，因为只能用快速柱。

（2）目标成分以及手性成分的分析不如MDGC。

（3）二维柱的极性不能太强，强极性柱保留太强，影响分离速度柱。

这时，不得不牺牲固定液选择性这个最重要的分离因素。

（4）对高沸点成分有一定局限，因为保留太强，可能影响二维分离速度。

（5）对检测器有一定要求，采样速度必须足够快，只有TOF、FID、微升池ECD等好用，NPD、AED、SCD、Q-MS等检测器多少存在一定问题。

（6）数据处理技术高度复杂，数据解析成为瓶颈。

（7）仪器昂贵，液氮消耗速度快。

（8）实际应用效果反映，对复杂体系的分析能力低于预期。

2多维气相色谱技术和仪器的新进展

2.1阀切换的多维毛细管气相色谱系统

随着切换阀硬件的完善，死体积缩至微升级，温度达320℃，聚酰亚胺、聚四氟等阀芯材料的活性相对较低，这些都为多维毛细管多维气相色谱提供了更好的基础。

1998年，意大利Messina大学的L.Mendello等人[13]在2台岛津GC-14BGC的基础上，采用Valco公司的1/32英寸六通阀，构建了一套阀切换的MDGC系统。

六通阀置于一个加热的模块中，可以避免组分冷凝，减少吸附。

整个系统全自动，两台GC也可单独使用，互不影响。

2.2Deans压力切换的多维毛细管气相色谱系统

多维气相色谱走过了一条曲折的发展过程。

80年代出现第一次高潮，当时人们把多维气相色谱形容为“气相色谱的一次革命”，“不亚于从填充柱到毛细柱的变革”，从此“将是多维气相色谱的天下”。

但是，GC/MS联用的迅速发展，冲淡了多维气相色谱的紧迫性和必要性。

另外，当时的多维气相色谱系统的自动化程度较低，很多是独立的外部控制器，方法开发较为复杂。

所以，多维气相色谱90年代逐渐沉寂下来。

大约在2000年之后，多维气相色谱似乎又现高潮，仪器迅速增多，至少有7家公司提供多维气相色谱整机或附件。

尽管仪器构造各式各样，但原理上均属于Deans压力切换。

提供整机的公司包括：

美国Mieroanalyties公司、德国Gerstel公司、日本岛津公司、美国瓦里安公司等。

提供成套升级附件的公司有澳大利亚SGE、美国安捷伦公司、美国PE公司等。

所有系统都实现了自动化，控制软件嵌入气相色谱主机软件中，所有参数均可在色谱软件中设定，具备全自动和序列分析功能。

特别值得一提的是，在仪器硬件方面出现重大创新。

2007年，安捷伦公司首先推出了微板流路技术（capillaryflowtechnology），利用光电雕刻技术，在两片不锈钢平板上刻划出毛细管气路，然后将板粘合起来，制成Deans切换装置。

系统死体积更小，毛细柱安装更简便，活性较低（不锈钢经过硅烷化处理）。

2009年，美国PE公司新推出的Deans切换系统，也采用了微板流路技术。

3多维气相色谱在中药研究中的应用

中药作为天然产物，组成十分复杂，组分间含量差异很大，并且在复方中药制剂中，数种中药材配伍使用，增加了质量控制及分析研究的难度。

武建芳等[14]建立了分析莪术挥发油组成的全二维气相色谱-质谱联用方法，实现了莪术挥发油的单个组分与族组分分析，鉴定出匹配度大于800的组分有249种，其中单萜18种，单萜含氧衍生物34种，倍半萜35种，倍半萜含氧衍生物37种，有69种组分的体积分数>0.02%。

武建芳等[15]还对连翘挥发油的组成分析建立了全二维气相色谱-质谱联用方法。

连翘挥发油组成复杂，且大部分组分为痕量组分。

通过优化色谱条件，使得组分的分离得到大大改善，同时鉴定出更多痕量组分，鉴定的匹配度大于800的组分有220种，多于以往的文献报道。

Qiu等[16]分别使用两种检测器，对来自5个不同产地的15个羌活挥发油样品进行定性和定量分析，其中四川产道地羌活定性鉴别出相似度大于800的组分共769个。

结合程序升温，各挥发油样品均可以得到包含组分结构信息的二维谱图，根据单萜、单萜含氧衍生物、倍半萜、倍半萜含氧衍生物等四类物质实现了明显的族分离。

各产地羌活挥发油样品的定性定量结果显示，四川产道地羌活挥发油的化学成分与其他4个产地的药材相比有很大差异，其中以单萜类和倍半萜含氧衍生物类成分的含量差异最为显著。

对15个样品的分析数据进行主成分分析，获得了满意的聚类结果，并且找到20个对聚类分析影响最为显著的化合物，即导致不同产地羌活挥发油的化学成分差异的标记物均属于单萜类或倍半萜含氧衍生物类化合物，与定性定量分析结果相一致。

Dimandja等[17]应用MDGC技术对薄荷油和荷兰薄荷油进行分析，并与气相-质谱联用方法进行比较，发现薄荷醇、薄荷酮为薄荷油的主要成分，而香芹酮、薄荷醇和柠檬烯则为荷兰薄荷油的主要成分，并且证实了全二维气相色谱用于挥发油分析的优越性。

除此之外，采用多维气相色谱系统对黄花蒿[18]、薄荷[19]等中药的化学成分进行分析研究，同样取得了应用传统一维气相色谱无法企及的分离效果。

4展望

多维气相色谱已经在成分复杂的中药研究中发挥了重要作用。

相信随着色谱仪器技术的不断进步，MDGC在动态分析范围、分离能力、分析通量和检测灵敏度等方面还会有更大的发展，为解决复杂中药分析体系的一些关键问题发挥不可替代的作用[20-21]。

如上所述，由于MDGC采用柱结合模式、调制器的设计对样品的分离效果及整个系统的性能都有较大影响，因此设计和优化适合的调制器是今后MDGC研究的一个热点问题。

不同分离模式之间的匹配组合、与质谱的联用和自动化分析等同样也是MDGC研究的重要内容和方向[22]。

Deans压力切换技术仍将是今后多维气相色谱的主流方向。

随着对复杂系统分析要求的不断提高，随着多维气相色谱系统的自动化、一体化的发展，多维气相色谱的应用将进一步扩展。

多维气相色谱的使用将更加简便，效率更高[23]。

对于中药研究，多维气相色谱在目标物分析、手性分析等方面可发挥更大的作用。

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