染色体与DNA.docx

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染色体与DNA

第二章DNA与染色体

第二节DNA的结构

一.DNA结构性质及其研究历程

2.核苷酸的性质

（1）碱基的性质

①互变异构。

嘌岭和嘧啶都有酮式和烯醇式的互变异构体。

一般而言，酮式稳定。

②光吸收。

所有嘌呤和嘧啶在260nm左右都有最大光吸收。

③疏水性。

在中性pH和细胞环境中嘌呤和嘧啶相当不溶于

水。

（2）核苷酸的解离

主要是磷酸基团的解离，其解离常数pKa1接近1，pKa2约为6，因此核苷酸在中性pH时带有负电荷。

3．核苷酸的生物学功能

①作为核酸构件分子。

4种5'-核苷三磷酸（NTP）和4种5’-脱氧核苷三磷酸（dNTP）作为底物，分别用于合成RNA和DNA。

②作为能量载体，如ATP、GTP、CTP和UTP。

③作为多糖或寡糖合成的糖基载体，如UDP-Glc；磷脂等合成中的酰基、胆碱等载体，如CDP-胆碱。

④作为信息分子。

环核苷酸如cAMP和cGMP作为细胞通讯第二信使。

‘

⑤作为辅酶。

如辅酶A（CoA）、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（辅酶I，NAD+）、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（辅酶Ⅱ，NADP+）、黄素单核苷酸（FMN）、黄素腺嘌岭二核苷酸（FAD）。

（3）分子形状和相对分子质量

DNA是大的生物分子

因此DNA水溶液具有高黏度；

分子形状对分子质量也影响DNA在超速离心和在密度梯度离心时的行为。

在氯化铯密度梯度离心时（48小时），DNA的浮力密度与其碱基组成、分子构象有关，有高G+C的其浮力密度较高，超螺旋>环状>线形。

⏹但事实上碱基环上的氢原子有其较为固定的位置：

腺嘌呤和胞嘧啶环上的氮原子常处于氨基（-NH2）状态，只有极少数处于亚氨基（=NH）状态。

同样，鸟嘌呤和胸腺嘧啶环上的C6上的氧原子常为酮式（C=O），很少有烯醇式（C-OH）。

⏹另一方面,A与C上的氮原子偶尔也可以形成亚氨基，G与T上的氧原子偶尔也可形成烯醇式。

可能这就是DNA复制时引起突变的原因之一。

这种突变是生物进化的动力。

DNA双螺旋结构模型的要点：

①  主链：

脱氧核糖与磷酸基通过3‘，5’－磷酸二酯键连接形成螺旋链的骨架。

两条多核苷酸链以右手螺旋的形式，彼此以一定的空间距离，平行地环绕于同一轴上，很象一条扭曲起来的梯子。

两条多核苷酸走向为反向平行（antiparallel），即一条链磷酸二脂键为5’-3’方向，另一条刚好相反。

②碱基配对：

每条长链的内侧是扁平的盘状碱基，碱基一方面与脱氧核糖相联系，另一方面通过氢键（hydrogenbond）与它互补的碱基相联系。

碱基配对不是随机的A与T配对（A=T）；C与G配对（C≡G）。

③螺旋参数：

碱基是接近平面的结构，基本与螺旋轴垂直。

相邻碱基对之间的距离为0.34nm。

相邻碱基对之间绕螺旋轴旋转的夹角为36°.   每个螺旋为3.4nm长，刚好含有10个碱基对.双螺旋直径约为2nm。

 ④ 在双螺旋分子的表面大沟（wideormajorgroove）和小沟（narroworminorgroove）交替出现。

大沟中碱基的差异易于识别，对于蛋白质识别双螺旋结构上的特异信息非常重要。

二、DNA一级结构及其稳定性

脱氧核苷酸以磷酸二酯键连结，碱基排列蕴藏了遗传信息。

DNA一级结构的稳定性：

DNA在pH>11时，双链解开，酸性条件下糖苷键断裂，pH<1时磷酸二酯键水解。

RNA在pH>11时水解。

三.DNA的二级结构：

通常是指双股核苷酸链通过碱基的配对作用形成的双螺旋结构。

1.维持双螺旋结构的作用力

⏹H键

A=T

C≡G

双螺旋结构的稳定性与G+C的百分含量成正比。

⏹碱基堆集力

同一条链中的相邻碱基之间的非特异性作用力即疏水作用力和VanderWaal力

嘌呤环、嘧啶环有一定的疏水性，堆积形成疏水区。

（疏水hydrophobic；

亲水hydrophilic）。

任何一种溶剂若能加强弱的可溶性物质与水的相互作用，或能打破该物质外面的¡°水壳¡±，就会降低疏水相互作用，Tm也降低。

如甲醇能增加碱基的溶解度，三氟醋酸钠可打破¡°水壳¡±，都能使Tm降低。

盐浓度高，促进疏水。

疏水力在温度25℃>40℃，疏水层析不宜低温。

⏹带负电荷的磷酸基的静电斥力

带负电荷的磷酸基团与介质中阳离子之间形成离子键，屏蔽磷酸基之间的斥力。

纯水

高盐（增加疏水作用力，碱基溶解性降低，若不与溶剂成分结合则自相聚集

⏹碱基分子内能

2.DNA双螺旋的呼吸作用

呼吸

绽裂（末端几个碱基对常处于单链状态，两端碱堆集力小，则氢键也不稳定。

）

3.DNA的变性与复性

Ø变性：

由天然的双链变为单链。

Ø复性：

变性DNA在适当的条件下，两条彼此分开的单链可以重新缔合成为双螺旋结构，这一过程称为复性或退火。

3.1变性

变性方法：

热变性，碱变性,有机溶剂如甲醛和尿素等。

DNA在pH>11时，双链解开，酸性条件下糖苷碱断裂，pH<1时磷酸二酯键水解。

双链DNA（dsDNA）A260=1.00，ssDNAA260=1.37，故双链DNA缓慢加热，其溶液对UV吸收值增加。

加温使DNA变性时，其紫外吸收光密度值达最大增值一半时的温度叫解链温度（meltingtemperature,Tm）。

Tm越高，说明DNA分子越稳定。

Marmur-Doty关系式Tm=69.3+0.41（%G+C）

PCR引物的Tm=2×（A+T）+4×（C+G）

②影响Tm的因素。

G-C含量、DNA样品均一性、缓冲液的离子强度和pH。

例如在标准条件（0．15mol/NaC1-0.15mol/L柠檬酸钠）下，Tm=69.3+0.41（C+C）。

尿素、甲酰胺、甲醛等和DNA碱基形成氢键，降低Tm值。

3.2复性

Repetitivesequencesarecommoninmulticellulareukaryoticorganisms.

4Classesofsequencesinhighereukaryotes:

unique[1copy]（majorityofgene

sequences）

slightlyrepetitive[1-10copies]

moderatelyrepetitive[10-several100copies]

highlyrepetitive[severalhundred-severalmillioncopies]

Theboundariesoftheseclassesarearbitrary.

⏹B-DNA：

Watson和Crick提出的DNA双螺旋结构属于B型双螺旋，它是以在生理盐溶液中抽出的DNA纤维在92%相对湿度下进行X－射线衍射图谱为依据进行推测的，这是DNA分子在水性环境和生理条件下最稳定的结构。

⏹A-DAN：

在以钾作反离子，相对湿度为75%以下时所获得的DNA纤维X－射线衍射图给出的是A构象。

A－DNA每螺旋含11个碱基对，而且变成A－DNA后，大沟变窄、变深，小沟变宽、变浅。

⏹Z－DNA：

它是左手双螺旋，与右手螺旋的不同是螺距延长（4.5nm左右），直径变窄（1.8nm），每个螺旋含12个碱基对，分子长链中磷原子不是平滑延伸而是锯齿形排列，有如“之”字形一样，因此叫它Z构象，这一构象中的重复单位是二核苷酸而不是单核苷酸；而且Z－DNA只有一个螺旋沟，它相当于B构象中的小沟，它狭而深，大沟则不复存在。

进一步的分析还证明，Z－DNA的形成是DNA单链上出现嘌呤与嘧啶交替排列所成的。

比如CGCGCGCG或者CACACACA。

⏹Z-DNA有较强的免疫原性;B-DNA无免疫原性.

Z－DNA的生物学意义：

Z－DNA的形成通常在热力学上是不利的。

因为Z－DNA中带负电荷的磷酸根距离太近了，这会产生静电排斥。

但是，DNA链的局部不稳定区的存在就成为潜在的解链位点。

DNA解螺旋却是DNA复制和转录等过程中必要的环节，因此认为这一结构与基因调节有关。

ＳＶ40增强子区中就有这种结构，又如鼠类微小病毒ＤＮA复制区起始点附近有GC交替排列序列。

调控蛋白都是通过其分子上特定的氨基酸侧链与DNA双螺旋沟中的碱基对一侧的氢原子供体或受体相互作用，形成氢键从而识别DNA上的遗传信息的。

大沟所带的遗传信息比小沟多。

沟的宽窄和深浅也直接影响到调控蛋白质对DNA信息的识别。

Z－DNA中大沟消失，小沟狭而深，使调控蛋白识别方式也发生变化。

这些都暗示Z-DNA的存在不仅仅是由于DNA中出现嘌呤一啶嘧交替排列之结果，也一定是在漫漫的进化长河中对DNA序列与结构不断调整与筛选的结果，有其内在而深刻的含意。

五、DNA的三级结构（高级结构）

Tobefunctional,nucleicacidsneedtoadoptparticularthree-dimensionalstructures.ForalongtimeDNAwasregardedasarigidandpassivemoleculewiththesolepurposetostoregeneticinformation,butexperimentaldatahasnowaccumulatedthatindicates

thefulldynamicrepertoireofthismacromolecule.

1.三股螺旋的DNA

1957年，Felsenfeld等人发现，当双链核酸的一条链为全嘌呤核苷酸链，另—条链为全嘧啶核苷酸链时，就会转化形成三链核酸的结构（triplex）。

Hoogsteen于1963年提出了DNA的三螺旋结构：

通常是一条同型的寡核苷酸与寡嘧啶核苷酸—寡嘌呤核苷酸双螺旋的大沟结合。

第三股链的碱基与Watson-Crick碱基对中的嘌呤碱形成Hoogsteen配对。

第三股链与寡嘌呤核苷酸之间为同向平行。

根据第三股链的组成和糖环构型可分为不同的型，例如：

Py·Pu﹡Py、Py·Pu﹡Pu。

“．”表示Watson-Crick配对，“﹡”表示Hoogsteen配对。

一般认为，三股螺旋中的碱基配对方式必须符合Hoogsteen模型，即第三个碱基以A或T与A=T碱基对中的A配对；G或C与G与C碱基对中的G配对，C必须质子化，以提供与G的N结合的氢键供体，它与G配对只形成两个氢键。

2.四链DNA

⏹依据大量的实验报导，含连续三个G或四个G的端粒寡核苷酸在体外一定条件下能形成四链DNA，即G4。

⏹在与人体细胞中的钾离子浓度相似的环境中，得到了两种人类端粒DNA形成的四链结构晶体。

用于生长晶体的人端粒寡聚DNA序列分别是d（TAGGGTTAGGGT）和d[AGGG（TTAGGG）3]。

晶体结构测定表明，四链结构核心的四条链（每条链的核苷酸都是GGG）都是平行的，并由处于外部的三核苷酸环（TTA）连接，形成螺旋桨状结构。

3.DNA超螺旋

DNA的三级结构包括线状DNA形成的纽结、超螺旋（superhelicalform）和多重螺旋以及环状DNA形成的结、超螺旋和连环等多种类型，其中超螺旋是最常见的，所以，DNA的三级结构主要是指双螺旋进一步扭曲形成的超螺旋。

⏹正超螺旋positivesuperhelix：

对于B-DNA来说，overrwinding（紧缠）以后，进行闭合，所产生的趋于解旋的左手螺旋。

⏹负超螺旋negativesuperhelix对于B-DNA来说，underwinding（松缠）以后，进行闭合，所产生的趋右旋的超螺旋，以解除外加的捻转所造成的胁变，天然状态下，一般观察到的都是负超螺旋，易形成泡状结构（不够紧凑，部分受成单链，其余的部分则更为“致密”。

单链需由蛋白质稳定之）。

环形DNA的一些重要的拓扑学特性。

1.      连环数一个闭合环型DNA分子的连环数（linkingnumber），指在双螺旋DNA中，一条链以右手螺旋绕另一条链缠绕的次数，以字母L表示。

习惯上，DNA双链如以右手方向互相缠绕，即为右手螺旋，连环数被定义为正值。

2.      缠绕数（twistingnumber）指DNA分子中的Watson-Crick螺旋数目，可近似地看成是DNA双链的互相缠绕数，以T表示。

上述解链环形与超螺旋形DNA虽都具有相同的L值，但它们却具有不同的T值。

前者T=23，后者为25。

3.      超螺旋周数（numberofturnsofsuperhelix）或扭曲数（writhingnumber）可以近似地看成是螺旋轴的缠绕数，以W表示。

上述解链环形与超螺旋形DNA的W值也是不同的，前者为0，后者为-2。

L、T、W三者之间的关系为:

L=T+W。

T与W值可以是小数，但L值必须是整数。

L值相同的DNA之间可以不经链的断裂而互相转变。

具有不同连环数的同一种DNA分子称为拓扑异构体（topoisomer）。

拓扑异构酶可以催化拓扑异构体之间的转换。

生物体内绝大多数DNA的确是以超螺旋的形式存在的。

由于超螺旋形DNA有较大的密度，在离心场中移动较线形或开环形DNA要快，在凝胶电泳中泳动的速度也较快。

超螺旋DNA分子在凝胶电泳中比其它类型移动速度快，只相差一个超螺旋，就可以在凝胶电泳中分开。

DNA的拓扑异构体之间的转变是通过拓扑异构酶（topoisomerase）来实现的。

J.Wang和M.Gellert首先发现了这类酶。

拓扑异构酶有两类：

DNA拓朴异构酶Ⅰ、Ⅱ。

Topoisomerase:

Aclassofenzymesthatalterthesupercoilingofdouble-strandedDNA.（InsupercoilingtheDNAmoleculecoilsuplikeatelephonecord,whichshortensthemolecule.）ThetopoisomerasesactbytransientlycuttingoneorbothstrandsoftheDNA.TopoisomerasetypeIcutsonestrandwhereastopoisomerasetypeIIcutsbothstrandsoftheDNAtorelaxthecoilandextendtheDNAmolecule.

ofTopoisomerase

⏹AsidefromtopoisomerasesIandII,therearemorediscoveredtopoisomerases.TopoisomeraseIIImayregulaterecombinationwhiletopoisomeraseIVregulatestheprocessofsegregatingnewlyreplicatedchromosomesfromoneanother.

⏹酶Ⅰ：

最初从E.coli中分离，叫ω蛋白.催化DNA链的断裂与重新连接.每次只作用于一条链；瞬时断裂和连接，不需ATP或NAD。

识别单链DNA（负超螺旋常有一定的单链区），使负超螺旋解旋。

能使双链超螺旋DNA转变成松弛形环状DNA，每一次催化作用可使L值增加1。

E.coliTopoI酶突变株，无TopoI酶，只生长稍慢一点。

人的TOPOI是由20号染色体上单拷贝基因编码的、分子量为100kD的蛋白质.

TOPOI催化DNA的单链断裂-再接过程:

①TOPOI识别并以非共价键与DNA分子结合;结合后由于构象的改变,暴露出其活性位点；②通过转酯作用，TOPOI活性位点上的酪氨酸残基与DNA3’端的磷酸基团形成磷酸二酯键，同时伴随DNA骨架上磷酸二酯键的断裂，③另一条链沿着DNA的轴心旋转，通过缺口.④TOPOI与DNA分离，该过程称为链的再接。

DNA的单链断裂-再接不断的重复，从而完成超螺旋DNA的解旋，为DNA的复制和转录作准备。

肿瘤组织细胞中TOPOI表达增高是TOPOI抑制剂应用于肿瘤治疗的理论根据.目前常用的抑制剂主要是喜树碱（campotothecin,CPT）.喜树碱抑制拓扑酶Ⅰ，使其与DNA的复合物稳定化，导致DNA单链断裂不能再度连接。

⏹TOPOII首先与DNA底物共价结合，切断双链并解开螺旋，进而在二价阳离子Mg++,Mn++以及ATP的帮助下，TOPOII改变构象，表现出连接酶活性，将断裂的DNA双链重新连接起来，当ATP水解后，又恢复了原先的酶切活性。

在DNA的复制和转录过程中是必不可少的关键步骤。

特别是一些肿瘤细胞中该酶的活性显著升高，因此也成为抗癌药物的作用靶点。

⏹DNA拓扑异构酶的不同功能

近年来，我们越来越清楚地认识到拓扑异构酶是在活细胞中具有多重功能的重要酶。

除了减少复制过程中双螺旋造成的扭转张力，拓扑异构酶在转录、重组和其他导致双螺旋产生过紧或过松的螺旋过程中也可以发挥类似的作用。

在真核生物中，拓扑异构酶也是形成细胞核基质（弥散于核的骨架）的重要成分，能够维持染色质的结构，并且在染色体分裂时解离DNA分子。

拓扑异构酶I能松弛DNA结构，拓扑异构酶Ⅱ如细菌中的DNA回旋酶和古细菌的逆回旋酶能够在DNA分子中引入超螺旋。

复习思考题

⏹比较A、B和Z型DNA。

⏹Z-DNA和H-DNA的形成条件与作用。

⏹什么是超螺旋？

什么是正超螺旋、负超螺旋？

有何生物学意义？

⏹比较各种拓扑异构酶。

⏹什么是SSCP技术和DHPLC技术，有何应用？

⏹简述DNA复性动力学及Cot曲线。