Western blot详细操作过程讲解.docx
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Westernblot详细操作过程讲解
WesternBlot
WesternBlot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。
经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄（NC）膜或聚偏二氟乙烯（PVDF）膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。
以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。
该技术广泛应用于检测蛋白水平的表达。
流程：
蛋白样品的提取→蛋白样品定量与变性→PAGE凝胶电泳→转膜→丽春红染色→封闭→抗体孵育→底物显色。
实验器材和试剂：
一．蛋白提取试剂
1.10%SDS裂解液：
称取10gSDS粉末加入双蒸水至90mL，充分溶解，定容至100ml室温保存。
2.RIPA裂解液
1ml裂解液工作液配方：
10ul100mmol/LPMSF（1mM）
0.2ul10mg/mlAprotinin（2ug/ml）
5.0ul1mg/mlLeupeptin（5ug/ml）
0.9848ml裂解液
0.5ml裂解液工作液配方：
5ul100mmol/LPMSF（1mM）
0.1ul10mg/mlAprotinin（2ug/ml）
2.5ul1mg/mlLeupeptin（5ug/ml）
0.4924ml裂解液
PMSF必须摇匀至无结晶时才可与裂解液混合
3．蛋白酶抑制剂：
100mmol/LPMSF：
17.4mgPMSF粉末溶于1ml异丙醇（AR），分装250ul每管后－20℃保存。
使用终浓度为1mmol/L。
【PMSF：
在溶液中不稳定，应在临用前从储存液中现加于裂解液中。
PMSF剧毒，严重损害呼吸道粘膜、眼睛及皮肤，吸入、吞进或通过皮肤吸收后有致命危险一旦眼睛或皮肤接触了PMSF，应立即用大量的水冲洗。
凡被PMSF污染的衣物应予丢弃。
】
二．蛋白定量试剂：
1.BCA蛋白定量试剂盒
2.10ml0.9%的生理盐水（90mgNaCl溶于10ml去离子水中）
三．上样用试剂：
6×SDS上样缓冲液：
取一个离心管，秤取2.0gSDS粉末，6mg溴酚蓝（BromopHenolblue;Albutest）粉末，然后用枪头加入5mL1.5mol/LTris-HCl（pH6.8），用移液管加入10mLGlycerol（甘油，丙三醇），枪头加入2mLβ-mercapteethanol（β-巯基乙醇）充分混匀，加双蒸水定容至20ml，涡旋溶解。
4℃避光保存。
四．电泳工作液：
1.1.5mol/LTris-HCl缓冲液：
（三（羟甲基）氨基甲烷）
称取18.171gTris粉末，加入60mL双蒸水中，加盐酸调节pH至6.8或8.8，定容至100mL。
4℃保存。
可致癌，不要直接接触皮肤。
2.1.0mol/LTris-HCl缓冲液：
称取12.114gTris粉末，加入60mL双蒸水中，加盐酸调节pH至6.8或8.8，定容至100mL。
4℃保存。
可致癌，不要直接接触皮肤。
3.0.5mol/LTris-HCl缓冲液：
称取6.057gTris粉末，加入60mL双蒸水中，加盐酸调节pH至6.8或8.8，定容至100mL。
4℃保存。
可致癌，不要直接接触皮肤。
4.10%APS：
（一周内使用，最好新鲜配置）
称取0.5gAPS粉末，加入双蒸水至5mL，充分溶解，4℃保存。
5.10%SDS:
秤取10gSDS粉末溶于100ml双蒸水中，可50℃水浴下溶解，室温保存。
如在长期保存中出现沉淀，水浴溶化后，仍可使用
5.分离胶（下层胶）：
分离胶
5%
7.5%
10%
12%
15%
30%acrylamide/bis
1.68ml
2.5ml
3.35ml
4.02ml
5ml
1.5mol/LTris-HCl（pH8.8）
2.5ml
2.5ml
2.5ml
2.5ml
2.5ml
10%SDS
100ul
100ul
100ul
100ul
100ul
DdH2O
5.47
4.65ml
3.8ml
3.13ml
2.15ml
10%APS（灌胶时再加）
50μL
50μL
50μL
50μL
50μL
TEMED（灌胶时再加）
5ul
5ul
5ul
5ul
5ul
分离蛋白分子量
57-212KD
36-94KD
20-80KD
12-60KD
10-43KD
混匀后在室温下静置15min，然后加入5ulTEMED即为分离胶，即可灌胶。
6.4%浓缩胶（上层胶）：
0.7mL30%Acr/Bis；
1.5mL0.5mol/LTris-HCl（pH6.8）；
60μL10%SDS；
3.6mL双蒸水混匀后加入50μL10%APS和5μLTEMED（灌胶时再加）。
7.1×电泳液缓冲液（使用液）（PH=8.3）：
3.04gTris粉末，14.4g甘氨酸（Glycine）粉末，1gSDS粉末溶于800ml双蒸水中，调PH=8.3，用ddH2O定容至1000ml，室温保存。
可重复使用3-5次。
10×电泳液缓冲液（储存液）（PH=8.3）：
30.4gTris粉末，144g甘氨酸（Glycine）粉末，10gSDS粉末溶于800ml双蒸水中，调PH=8.3（浓HCl调），用ddH2O定容至1000ml，室温保存。
五．转膜工作液：
1×转膜液缓冲液（使用液）（PH=8.3）：
3.0gTris粉末，14.1g甘氨酸（Glycine）粉末，1.25gSDS粉末溶于800ml双蒸水中，用ddH2O定容至1000ml，溶解后室温保存，使用时再加250mL甲醇（AR）可重复使用3-5次。
10×转膜液缓冲液（储存液）（PH=8.3）：
30.0gTris粉末，141g甘氨酸（Glycine）粉末，12.5gSDS粉末溶于800ml双蒸水中，用ddH2O定容至1000ml，溶解后室温保存。
使用时稀释10倍，加入20%甲醇。
可取10×溶液100ml,ddH2O900ml，甲醇250ml。
（重复利用再重新加入甲醇50ml）
六．封闭液
1g脱脂奶粉于20mL1XTBST混匀,4℃保存。
保存时间不能太久，有味道就不能用了。
七．抗体孵育用液
1XTBST缓冲液（使用液）：
24.2gTris粉末，87.6gNaCl，10mLTween20（AR）溶于800ml双蒸水中，用ddH2O定容至1000ml调节pH至7.4。
室温保存。
10XTBST缓冲液（储存液）：
24.2gTris粉末，87.6gNaCl，10mLTween20（AR）溶于800ml双蒸水中，用ddH2O定容至1000ml调节pH至7.4。
室温保存。
八．丽春红染液（可回收利用）
九．显影液
WesternLightningECLPro
十．STRIP膜再生
试剂100ml5ml8ml12ml14ml
10%SDS20ml1ml1.6ml2.4ml2.8ml
0.5MTrisHCl（pH6.8）12.5ml0.625ml1ml1.5ml1.75ml
ddH2067.5ml3.375ml5.4ml8.1ml9.45ml
β-mercaptoethanol0.8ml40ul64ul96ul112ul
操作步骤：
（一）蛋白样品制备
（1）待测蛋白细胞收集
1.准备冰盒，提前准备好需要的试剂和器材，EP管：
标记好相关信息（细胞名称，蛋白提取，转染信息，时间）；离心管，滴管，含血清的培养液，胰蛋白酶，PBS。
4℃离心机提前预冷；
2.弃掉皿内的无血清培养液（含血清的培养液，可直接收到相应的离心管），用1.0ml的PBS清洗，将PBS收到相应的离心管内，再用1.0ml的PBS清洗，收集PBS，每皿加1ml的胰蛋白酶进行消化，37℃，5min。
3.消化后将皿放在冰盒上，冰上操作。
用培养液（可以用离心管内带血清的培养液）吹打细胞，收入离心管（可再冲洗一次，冲洗干净），将离心管配平后放1500r/5min离心。
4.取出离心管，吸掉上清（注意不要碰到蛋白固体），管底留少量液体，用手弹离心管底部，震荡离心管，加入1ml的PBS吹打几次后移入相应的EP管，在离心管再加入0.5ml的PBS清洗加入EP管。
EP管配平后4℃，1500r/5min。
5.取出EP管，轻轻吸掉上清，留少许液体在底部，弹几下EP管进行震荡，加入1.5ml的PBS涡旋3-5次，配平后4℃，1500r/5min。
6.取出EP管，轻轻吸掉上清，留少许液体在底部，配平状态在4℃离心机进行离心，转速为最高转速14800转，达到此速度立刻停止，取出EP管，小心吸掉所有的液体。
7.将EP管放在-80℃冰箱内保存。
（2）细胞总蛋白的提取：
1.准备相应的试剂和器材，按照配方配置裂解液和PMSF溶液，4℃离心机提前开机预冷，准备冰盒。
2.取出收集好的蛋白样品置于冰上。
3．按照配方配置裂解工作液，（根据试剂盒实际要求）摇匀置于冰上。
（PMSF要摇匀至无结晶时才可与裂解液混合），取40-50ul（细胞多用50ul）裂解工作液加入细胞EP管中，吹打均匀，涡旋几次，冰上裂解30min,（裂解期间每10min涡旋一次），裂解完成后再涡旋一次然后转移至4℃离心机14800r/20min（提前开离心机预冷）。
取出离心后的EP管吸取上清，置于新的EP管中。
4.将轻微离心后的上清可分装后放于－20℃保存。
（二）蛋白含量的测定
1.配置10ml0.9%的生理盐水（90mgNaCl溶于10ml去离子水中），用于配置相应的BSA梯度溶液。
2.将标准样品和蛋白样品按下表稀释和加样
检测范围=（20-2000ug/ml）
瓶号
A
B
C
D
E
F
G
H
样品
BSA含量
0ug
1ug
2.5ug
5ug
10ug
20ug
40ug
50ug
2mg/mlBSA
-
0.5ul
1.25ul
2.5ul
5ul
10ul
20ul
25ul
1ul
0.9%saline
25ul
24.5ul
23.75ul
22.5ul
20ul
15ul
5ul
-
24ul
工作液
200ul
200ul
200ul
200ul
200ul
200ul
200ul
200ul
200ul
BSA终浓度（ug/ml）
0
40
100
200
400
800
1600
2000
工作液最后加，加工作业速度要快，且在冰上操作。
样品：
工作液=1：
8（25ul:
200ul）
3.BCAA:
BCAB=50:
1,每孔需要200ul工作液。
根据需要的数量配置工作液，所需工作液的总体积为：
（标准品的个数+待测蛋白质样品的个数）×（实验重复次数）×（用于每个样品的工作液的体积）=所需的工作液
（当试剂B加入到试剂A中时，开始可观察到有浑浊产生，经搅拌后浑浊会迅速消失，得到绿色澄清工作液。
工作液储存于密闭容器中，在室温下可稳定保存数天）
注：
如果样品有限，则可取标准品和待测未知样品10ul（样品与工作液的比例为1:
20）。
然而，在这种情况下，定量分析的检测范围将被限制在125-2000g/mL。
ABCDEFGHI
4.将微孔板密封，在37℃恒温箱30转中孵育30分钟。
（孵育时盖报纸避光）
5.将微孔板冷却到室温。
使用微孔板读数仪，测量样品在562nm或该波长附近的吸光值。
打开酶标仪“Gen5CHS2.04”图标→新建记录→检测，吸收光→波长562→打开96孔板盖子放入机器开始检测，将结果复制到Excel中拷贝。
∙该方法在波长540-590nm范围内均可成功得到结果。
由于微孔板酶标仪的光路长度比使用比色皿的分光光度计短，因此微孔板方案要求样品与工作液的比例更高，才能获得与试管标准方案相同的灵敏度。
如果想要得到较高的562nm处的吸光值，则需将孵育时间增加到2小时。
延长孵育时间或升高温度将会增加样品在562nm处的吸光值，也会降低试剂的最低检测下限和该方案的检测范围。
6.将各个标准品和待测蛋白质样品在562nm处的吸光值根据公式计算出相应的蛋白浓度。
2016/3/9
全蛋白
No.
Samplename
OD
OD0
OD－OD0
Testvolume（μl）
proteinconcentration（μg/μl）
Samplevolume（μl）
protein（μg）
Addingsamplevolume（μl/20μg蛋白）
Sample1
A549-Ctrl-24h
0.695
0.347
0.348
1
6.90
40
499.07
2.90
Sample2
A549-NTsiRNA-24h
0.639
0.347
0.292
1
5.76
40
272.44
3.47
Sample3
A549-NEK2siRNA-24h
0.709
0.347
0.362
1
7.18
40
289.56
2.78
Sample4
A549-NEK2siRNA-24h
0.676
0.347
0.329
1
6.51
40
386.32
3.07
Sample5
A549-Ctrl-48h
0.591
0.347
0.244
1
4.79
50
411.31
4.17
Sample6
A549-NTsiRNA-48h
0.536
0.347
0.189
1
3.70
50
430.08
5.41
Sample7
A549-NEK2siRNA-48h
0.574
0.347
0.227
1
4.45
50
354.13
4.49
Sample8
A549-NEK2siRNA-48h
0.586
0.347
0.239
1
4.69
50
263.45
4.26
（三）蛋白变性
按下表进行配置：
（上样缓冲液应新鲜配置）
NO.
A549-Ctrl-
24h
A549-NTsiRNA-
24h
A549-NEK2siRNA-24h
A549-NEK2siRNA-24h
A549-Ctrl-
48h
A549-NTsiRNA-48h
A549-NEK2siRNA-48h
A549-NEK2siRNA-48h
样品用量（ul）
2.90
3.47
2.78
3.07
4.17
5.41
4.49
4.26
ddH20
（ul）
12.10
11.53
12.22
11.93
10.83
9.59
10.51
10.74
Loadingbuffer（ul）
3
3
3
3
3
3
3
3
样品终含量（ug）
20
20
20
20
20
20
20
20
总体积（ul）
18
18
18
18
18
18
18
配置过程在冰上操作
漩涡震荡后70℃水浴10min，可以-20℃保存备用。
（四）SDS－PAGE电泳
（1）清洗玻璃板：
用水轻轻冲洗玻璃板，洗干净后用干净的纸或布擦干，然后将接触胶的一面用酒精擦洗，擦干后开始装配。
玻璃板的下缘必须对齐。
若不继续使用，需用乙醇擦拭后晾干再妥善收起来，梳子应用水洗干净，临用前用乙醇擦拭晾干。
（2）灌胶与上样
1、玻璃板对齐后放入夹中卡紧，然后垂直卡在架子上准备灌胶。
装配好后，插入梳子，在最上边的红线下侧一点点处（梳子插入的位置）用油笔做一条直线标记，分离胶加至此线。
2、配置分离胶，在烧杯里放入旋子（旋子在放烧杯的一层），低速转动10-15min，然后加入50ul10%APS和5ulTEMED后立即摇匀即可灌胶，烧杯口紧贴灌胶板，将分离胶灌入玻璃板夹层，待胶面升到画的界限，停止灌胶。
然后胶上加一层双蒸水，平移均匀加入，加到满，压平分离胶，液封后的胶凝的更快，等待30-40min，待凝固后，形成明显的界限，倒出上层的双蒸水，并用纸吸干剩余的双蒸水。
（操作时胶一定要沿玻璃板流下，这样胶中才不会有气泡。
加双蒸水时要沿着玻璃板左右平移加，速度不能太快，否则胶会被冲变型。
）
3、在等待分离胶凝固的同时按前面方法配4％的浓缩胶,配好后在凝固好的前10-15min，烧杯里加入旋子慢速旋转10-15min，然后加入50ul10%APS和5ulTEMED后立即摇匀即可灌胶。
将剩余空间灌满浓缩胶然后选择合适的梳子插入浓缩胶中，待凝固。
（灌胶时也要使胶沿玻璃板流下以免胶中有气泡产生。
插梳子时要使梳子保持水平）实验提前5-8小时制作电泳胶/或过夜。
（一块板可用2ml1×TBST放在密封的袋中保存）
4.在分离胶凝固的同时配置电泳缓冲液并进行蛋白变性处理。
5、胶凝固后，取出PAGE胶板，用双蒸水冲洗干净，将胶水平放置，双手从两侧同时缓慢抽出梳子，用双蒸水轻轻冲洗胶孔，装入电泳槽板上，上推胶板以避免漏液，装入垂直槽固定架，将其放入电泳槽中，加入电泳缓冲液，用枪头插入胶孔轻轻吹打几次，赶出孔内液体。
（小玻璃板面向内，大玻璃板面向外。
若只跑一块胶，那槽另一边要垫一块塑料板且有字的一面面向外。
）
6、按照上样顺序将变性过的蛋白进行加样，在样品一侧加入10ulMarker,对应电极盖好盖子。
7、调整电压为100-120进行电泳，90min，随时观察，条带到底即可停止进行转膜。
（五）转膜
1.电泳过程配置转膜缓冲液
2将裁剪掉右上角的聚偏二氟乙烯（PVDF）膜泡入甲醇中（缓慢摇动）2min（硝酸纤维素（NC）膜不需要浸泡甲醛），用双蒸水冲洗干净，加入双蒸水摇动2min。
在反应盆内倒入的转膜缓冲液，将海绵，滤纸和PVDF膜完全浸入缓冲液中，至少浸泡30min,需要浸泡的是两块滤纸，两块海绵，一块PVDF/NC膜。
3.将电泳完的凝胶玻璃板取出，用双蒸水冲洗干净，用塑料的铲子缓慢撬开小玻璃板，然后用浸泡过缓冲液的一块滤纸贴在胶上，反过来将玻璃板用长片撬下来，按照marker的标志切割目的蛋白所在区域的凝胶，将浓缩胶部分切除（大蛋白不需要切除），将转膜夹放在转膜槽上，黑色在下，白色在上，在黑色板上铺上海绵，用移液枪吸取10mL的缓冲液，缓慢冲洗3次（有泡沫的部分不要吐出），然后用滚子朝一个方向滚，赶出气泡，重复三次，一共滚三次；然后将带有胶的滤纸铺上，滚三次，铺上膜，滚三次，铺上滤纸，滚三次，铺上海绵，滚3次，将白色盖板盖上，卡扣位置朝上，插入电泳槽，黑色对黑色，红色对红色，倒满缓冲液，对应电极盖上盖子。
将电流调制40-42V进行转膜，转膜90min/或30V4度overnight。
转膜过程中配置1×TBST和封闭液。
4.转膜完成后取出PVD/NCF膜（膜上蛋白marker清晰，胶上无明显蛋白marker，表明转膜完全），剪除无蛋白区域，在右上角剪去一角，已确认方向，将膜用双蒸水清洗三次，浸泡进丽春红染液中染色，置于摇床中速3min左右（丽春红染液回收），用双蒸水重复漂洗2-3次直至出现清，拍照记录晰条带，如条带清晰整齐则表明之前的步骤成功。
再用TBST清洗一次（不能直接冲着膜加液）。
（六）封闭
1．转膜过程配置封闭液，在磁力搅拌器上一直搅拌溶解，溶解后4度保存备用。
2.将洗掉染液的PVDF膜取出放入盛有封闭液的方盒中，将膜完全浸润，盖好盖子，在摇床上中速摇动1h。
（七）抗体孵育
1.取出封闭后的膜加入1×TBST5ml左右摇晃几下倒掉，倒入10ml（浸没）TBST，摇床中速15min，再清洗2次，每次5min。
2.将稀释后的一抗连同膜转移到密封塑料袋内（或者孵育盒内），在室温下转动1-2小时，转移至4℃冰箱中摇动过夜。
3.将过夜后的膜从一抗中取出（一抗回收）加入10ml（浸没）TBST，摇床中速15min，倒掉后再清洗2次，每次5min。
4.将稀释后的二抗倒入抗体孵育盒，将PVDF膜置于二抗中室温缓慢摇动30min-1h。
（二抗回收）加入10ml（浸没）TBST，摇床中速5min，重复三次。
（清洗过的膜放在1×TBST，4℃保存）。
（切带后，一个空需要大约1.5ml二抗）
（八）底物显影
1.将WesternLightningECLPro化学发光A液和B液按1:
1的比例根据膜的大小选择合适用量在EP管中混合均匀（一整张膜需要1ml，即A,B液各0.5ml），将PVDF膜控干后铺于显影塑料盒内，将显影混合液均匀的涂在PVDF膜上，避光孵育5min左右，将膜夹在塑料膜内，将塑料膜置于显影仪器进行显影。
打开GeneSys软件→Blots→ChemiBlot（Series）→BioRadblot（7×8.4cm）→ChemiFast（ECLPlus）→Marker勾选→选择拍摄张数（根据实际情况选择）→勾选“…ofpreviousimage”→选择三张拍摄时间（30s，1min,3min根据实际情况选择）→调整曝光出来图像的效果→保存→关闭仪器。
根据显影结果进行分析。
（九）STRIP膜再生去除一抗二抗
1．将显影过的膜用双蒸水清洗几次，泡进strip缓冲液中，恒温箱内50度115转，孵育45min。
2．取出孵育后的膜用双蒸水清洗几次，用TBST在摇床上清洗3次，每次15min。
3.一抗过夜，二抗孵育，再显影。
前期准备：
蛋白已经定量，各样本已经稀释到某固定浓度，已经和SDSloadingbuffer混合，已经分装好，保存与-20°。
头天下午或晚上配胶，分离胶和浓缩胶一起配好，带上梳子，放入潮湿的自封袋内放入4°冰箱备用。
8:
00从冰箱里取出蛋白样品，用PCR仪95度加热5min。
混合均匀并离心。
8:
30取出昨晚配好的胶，组合，加电泳液。
在电泳液里拔梳子能稍微容易一些。
用10ul的枪加样。
9:
00开始电泳。
恒流30mA一般1个小时足够了。
9:
30开始准备转膜用的滤纸和PVDF膜，PVDF膜泡甲醇。
一般8cm的宽是固定的，所以如果要裁胶的话可以先大概估计一下。
10:
10电泳结束（假设电泳用了70分钟），起开玻璃板，裁出胶上所要的条带，如果整块胶转就更方便了。
把胶放在盛有转膜缓冲液的培养皿里。
11:
00转膜开始（这里裁纸和铺三明治还是比较费时间的，我一般要用30分钟到50min，所以这里要抓紧时间）。
12:
00转膜结束（这里按60min的半干转的时间来计算）。
开始封闭1h。
13:
00封闭结束，开始孵育一抗（在这里你可以选择一抗孵育过夜，如果不过夜的那一天就能结束），如果不过夜的话我一般选择37°1h然后在室温（23°左右）再1h。
15:
00一抗孵育结束。
TBST洗涤3*10m
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