血清脂类测定.docx

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血清脂类测定

血浆中的脂类包括胆固醇、胆固醇脂、甘油三酯、磷脂和非酯化脂肪酸等。

目前，对有关脂类代谢疾患的诊断和治疗过程，均必须检测血浆（清）中的脂类，通过其含量的变化，对临床疾患提供协助诊断的依据。

有关医学科研工作，脂类的定量检测也是一项必备的研究项目。

1．胆固醇测定

血浆中胆固醇及其酯的含量检测，从方法学上可分为两大类：

一类是化学法包括抽提法和直接测定法，这类方法目前仍在沿用；另一类是酶法测定，方法敏感特异快速，并能自动化分析，已常规应用。

化学测定法种类多，由于显色反应的特异性不同，其结果有一定的差异。

目前公认的参考方法是Abell-Kendall（L-B反应）法。

另外，三氯化铁-硫酸反应法（Zak法）具有显色稳定法、操作简便、灵敏度约5倍于L-B反应法，胆固醇酯与游离胆固醇显色程度比较接近等优点，缺点是特异性差，干扰因素比L-B法多，如冰醋酸中含有的乙醛酸，血清样品中的血红蛋白，胆红素以及硫酸的质量等因素均可影响Zak方法的准确性，Zak法更适合于科研使用。

酶法测定血清胆固醇的方法已被广泛采用，国产试剂已能满足临床的需要。

胆固醇测定用的标准品，按美国国家标准局（NBS）出品纯度达99.8%,是国际公认的参考物，国内李健斋等已纯化制成符合这一要求的胆固醇纯品，已供临床检测血清胆固醇使用。

2．甘油三酯测定

血浆甘油三酯的测定，目前多以化学法和酶法定量。

化学法测定甘油三酯是以脂蛋白变性，水解成甘油，并以甘油为计算依据。

酶法是以特异酶水解甘油三酯，除去脂肪酸，再测定甘油，方法特异，准确而快速，临床广为应用。

目前甘油三酯测定的方法主要以定量甘油为依据，然而血清样品中存在有游离甘油，如何从反应过程中的总甘油中减去游离甘油，多年来一直在研究讨论这一问题。

若不减去，其测定值将会高于血清样品中的真值，如果要减去，就必须先测出血清样品中的游离甘油，甘油三酯的测定方法将增加一个繁杂的步骤，实际工作中难以做到。

有报道血清样品中的游离甘油实际量是0.07～0.13mmol/L，相当于甘油三酯的0.5～6.0mmol/L，为此建议，实测的甘油三酯量减去一个校正系数即：

甘油三酯（mmol/L）=[0.98×总甘油（mmol/L）]-0.07（mmol/L）。

这一校正系数也仅适用于健康人，对临床病人并不一定适用。

据报道，血清样品的游离甘油一直是个未知数，无法测准。

为此，目前临床测定血清甘油三酯时，基本上未考虑游离甘油，因为其含量很少，暂且忽略不记。

甘油三酯测定的参考物，推荐三油酸甘油酯和三软脂酸甘油酯混合物（2：

1，W/W），此参考物适用于化学法。

在酶法测定中，仍以高纯度的三油酸甘油酯为参考物。

3．磷脂测定

血清磷脂包括卵磷脂、溶血卵磷脂、神经磷脂、脑磷脂和其他少量磷脂。

如需要分别检测各种磷脂，可以通过薄层层析法、柱层析法和高压液相色谱法。

目前，临床仅测定血清磷脂总量。

血清磷脂总量的测定方法有化学方法和酶法两大类。

化学法是以磷脂中的磷为定量依据，因为每磷脂分子中都含有一个磷酸根，故将磷脂的磷称为脂性磷。

由于血清中磷脂大部分为卵磷脂，其分子量中磷约占4%，故将脂性磷换算成磷脂的系数，一般为25。

由于化学法均需要抽提，再测抽提液中的磷脂的磷，血清中的磷酸盐不可能混入抽提液中，因此血清中的磷酸盐对磷脂测定的干扰很少。

酶法是利用磷脂酶进行定量测定。

生物体中磷脂酶包括磷脂酶A1、A2、C和D四种。

磷脂酶D特异性差，均可水解卵磷脂、溶血卵磷脂和神经磷脂，三者约占血清总磷脂的95%，临床多用含磷脂酶d的试剂进行磷脂的定量测定。

4．游离脂肪酸测定

游离脂肪酸属于未酯化的一类脂肪酸，故又称为非酯化脂肪酸，其量很少，采用方法必须是灵敏的方法，还需要避免脂肪水解产生脂肪酸的干扰。

测定方法有：

①滴定法需要微量滴定装置，因为要通过肉眼观察颜色，难免会有主观因素的影响，所以难以测定准确，很难用于常规；②光度法，以铜皂法常用；③酶法，主要采用特异性不强的脂肪酶D进行检测，方法特异，快速准确，已常规应用于临床。

第一节　胆固醇测定

血清中胆固醇包括CE和FC，酯型的CE占70%，FC占30%。

CE中的C3的-OH在LCAT作用下，可分别结合亚油酸（43%）、油酸（24%）、软脂酸（10%）、亚麻油酸（6%）、花生四烯酸（6%）、硬脂酸（3%）等脂肪酸结合而成。

血清中胆固醇在LDL中最多，其次是HDL和VLDL、CM最少。

血清总胆固醇测定方法分为化学法和酶法两大类。

1．化学法

化学法一般包括：

①抽提；②皂化；③毛地黄皂苷沉淀纯化；④显色比色四个阶段。

代表性的方法有Sperry-Webb法，通过①～④步骤操作过程。

常规操作中多采用省去了②、③。

或者用省去②、③步骤的Zak-Henly法及省去③步骤的Abell-Kendall法，现将此法作为标准参考方法予以引用。

2．酵法测定

CE在胆固醇酯酶（cholesterolesterase）作用下水解成FC和NFFA，TC再经胆固醇氧化酶（cholesteroloxidase,COD）氧化成△4胆甾烯酮和H2O2。

再分别定量O2的消耗或者H2O2的生成量，或者△4胆甾烯酮生成量,以作为TC的定量依据。

该法是目前常规的应用方法，快速准确，标本用量少，便于自动生化分析仪作批量测定。

一、Abell-Kendall改良法

1．原理

血清加入醇溶性氢氧化钾，使胆固醇从脂蛋白中分离出来，同时使胆固醇酯加水分解成游离胆固醇，加石油醚振摇、抽提，使胆固醇移入石油醚层，分离并取一定量的石油醚层，蒸发至干，再进行Liebermann-Burchard显色反应，620nm比色定量。

该法可用于基本功训练及组织细胞胆固醇的提取定量。

2．试剂组成

代号

种类

浓度

组　成

贮存2～8℃

有效时间

乙醇

优质纯

石油醚

沸点68℃，特级纯

水醋酸

分析纯

无水醋酸

胆固醇分析用，不含HCI

浓硫酸

分析纯

KOH液

33%（W/W）

KOH10g+H2O20ml

乙醇性KOH液

R194ml+R66ml

临用前配制

Liebermann

配制后

Burchard

R420体积+R51体积+R310体积

试剂*

内用完

胆固醇标准液

5.17mmol/L

胆固醇标准品200mg+R1→100ml

*：

在三角烧瓶内，加入无水醋酸，于冰水中冷至10℃以下，再慢慢加入浓硫酸，混合，静置10min，又加冰醋酸混匀，备用。

3．操作

图15-1血清胆固醇（Abell法）测定操作图

按图15-1操作。

4．计算

标准总胆固醇浓度=ESA/EST×5.17（mmol/L）

二、酶法（CEH、COD-POD法）

首先将血清中胆固醇酯在胆固醇酯酶（CEH）水解为游离胆固醇和脂肪酸，胆固醇在胆固醇氧化酶（COD）作用下，生成△4-胆甾烯酮和H2O2，再H2O2经过氧化物酶（POD）作用在4-氨基安替比林（4-AA-P）及N-乙基-N-（3-磺基醋酸）-3甲氧基苯胺（N-ethyl-N-（3-sulfopropyl）-manisidine,ESPAS）参与下，生成红色醌亚胺色素。

H2O2+ESPAS+4-氨基安替比林→红色醌亚胺色素

（一）手工测定法

1．试剂组成

代号

种类

浓度

组成

贮2～8℃

有效时间

Na2HPO4

50mmol/L

Na2H2PO4

50mmol/L

胆酸钠

3mmol/L

4-氨基安替比林

0.82mmol/L

R1*

ESPAS

14mmol/L

24h

Carbowax-6000

0.17mmol/L

CEH

33U/L

COD

117U/L

POD

6700U/L

标准液

5.17mmol/L

用异丙醇溶解胆固醇

*混匀，调pH至6.70±0.10（25℃），或购买试剂盒。

酶以活性单位表示。

2．操作

按图15-2操作。

3．计算

标准总胆固醇浓度=ESA/EST×5.17（mmol/L）

（二）自动化分析仪测定

以CL-7200型全自动生化分析仪检测为例。

1．试剂组成

A液：

CEH、POD、抗坏血酸氧化酶等。

B液：

COD、4-氨基安替比林等。

图15-2血清胆固醇测定（酶法）操作图

2．上机参数

项　目

参　数

方　法

终点法

波　长

双波长（540nm，700nm）

反应温度

37℃

试剂A反应时间

2～3min

试剂B反应时间

5～6min

样本用量

3μl

试剂A用量

250μl

试剂B用量

120μl

单位

mmol/L

3．操作过程

4．计算

以△A=A2-A1，根据同样处理之标准或质控物计算，打印结果。

5．注意事项

（1）试剂与样本量可根据分析仪要求按比例改变。

（2）试剂在有效内2～8℃避光食保存。

（3）胆固醇含量超过200mmol/L，需用生理盐水稀释再测。

第二节　甘油三酯测定

甘油三酯又称中性脂肪，由于其甘油骨架上分别结合了3分子脂肪酸、2分子脂肪酸或1分子脂肪酸，相应称为甘油三酯（TG）、甘油二酯（DG）和甘油一酯（MG）。

血清中90%～95%是TG，TG中结合的脂肪酸分别为油酸（44%）、软脂酸（26%）、亚油酸（16%）和棕榈油酸（7%）。

血清TG测定方法一般分为物理化学法、化学法及酶法三大类。

血清中TG的化学组成并不单一，准确求其分子较为困难。

因标准不同，测定结果存在差异。

化学法多采用三棕榈精（软脂精）（分子量807.3）、三油精（分子量895.4）为标准，按摩尔浓度计算。

酶法测定以三油精为标准物进行换算。

1．化学法

化学测定法包括：

①TG的抽提分离；②皂化；③甘油糖的氧化；④氧化生成甲掌显色定量等四个阶段。

操作较为繁杂，影响测定因素太多，本法准确性差，一般很少用。

2．酶法测定

酶法测定包括：

①TG的抽提与皂化；②加水分解生成甘油糖定量等二个阶段。

目前常规检测应用的方法有甘油激酶（glycerolkinase,GK）法和甘油氧化酶（glycerolOxidase,GOD）法。

操作简便，快速准确，并能在自动化生化分析仪上进行批量测定。

一、乙酰丙酮法

1．原理

血清中加入异丙醇抽提取甘油三酯，经KOH皂化使甘油三酯水解生成甘油及脂肪酸，甘油在过碘酸作用下氧化成甲醛，在氯离子存在下甲醛与乙酰丙酮缩合生成黄色的3，5二乙酰，1，4二氢甲基吡啶，其颜色的深浅与甘油三酯的含量成正比，420nm测定定量。

该法可用于基本功训练及组织细胞TG的提取测定。

2．试剂组成

代号

种类

浓度

组成

贮2-8℃

有效时间

抽提液

（CH3）CHOH（A.R）重蒸馏

吸附剂

氧化铝，水洗除去微细颗粒，

110℃烤干3h以上

闭封

一周

皂化剂

KOH5g+H2O→100ml

醋酸溶液

2mol/L

CH3COOH11.5ml+H2O→100ml

过碘酸钠

0.05mol/L

NaIO41.07g+H2O→100ml

氧化剂

R41体积+R51体积

一周

醋酸铵液

CH3COONH215.4g+H2O→100ml

显色剂

CH3COCH2COCH30.75ml+R-1

40ml+R-7100ml+R-480ml

参考液

2mg/dl

三油酸甘油酯

2mg+R-1→100ml（TG100mg/dl）

3．操作

按图15-3操作。

图15-3血清甘油三酯（乙酯丙酮法）测定操作图

4．计算

血清TG浓度=ESA/EST×1.13（mmol/L）

二、酶法（GK-GPO-POD比色法）

血清中甘油三酯经脂肪酶水解为甘油和脂肪酸，甘油在甘油激酶（GK）及ATP存在下，生成3-磷酸甘油，尔后，在磷酸甘油氧化酶（GPO）作用氧化成磷酸二羟丙酮并生成H2O2，H2O2与底物4-氨基安替比林和ESPAS在过氧化物酶（POD）作用下，生成红色亚醌化合物（quinoneimine），比色（500nm），其颜色深浅与甘油三酯含量成正比。

（一）手工测定法

1．试剂组成

代号

种类

浓度

贮存2～8℃

磷酸甘油氧化酶

≥3.0KU/L

冷藏

（A液）

抗坏血酸氧化酶

≥1.0KU/L

甘油激酶

≥0.7KU/L

4-氨基安替比林

80mg/L

脂蛋白脂酶

≥2.0KU/L

冷藏

过氧化物酶

≥10KU/L

ESPAS

300mg/L

R3（参考液）

甘油酸三脂

200mg/dl（2.26mmol/L）

冷藏

*：

一般采用商品试剂盒

图15-4血清甘油三酯测定法（酶法）操作图

2．操作

按图15-4操作。

3．计算

血清TG浓度=ESA/EST×2.26（mmol/L）

（二）生化分析仪检测

全自动生化分析仪测定操作（以CL-7200型为例）。

1．试剂

A液：

GK，GPO，4-AA-P、抗坏血酸氧化酶等。

B液：

POD，Lipase,ESPAS等。

标准液：

甘油三油酸酯200mg/dl（2.26mmol/L）。

2．上机参数

名称

参数

方法

终点法

波长

双波长（540nm700nm）

试剂A反应时间

2～3min

试剂B反应时间

5～6min

反应温度

37℃

样本用量

4μl

试剂A用量

200μl

试剂B用量

100μl

单位

mmol/L

3．操作过程

4．计算

以△A=A2-A1并根据同样之标准或质控物计算，自动打印结果。

5．注意事项

①试剂与样本量可根据分析仪要求按比例改变。

②试剂在有效期内2～8℃避光保存。

③样本中甘油三酯含量超过11mmol/L需用生理盐水稀释后再测。

第三节　磷脂测定

磷脂（PL）并非单一的化合物，其分子内含有磷酸基的多种脂质，磷脂是这一类物质的总称。

血中PL包括：

①卵磷脂占60%和溶血卵磷脂占2%～10%；②磷脂酰乙醇胺等，占2%；③鞘磷脂，占20%。

血清PL定量方法包括测定无机磷的化学法和酶法两大类。

1．化学测定法过程包括：

①抽提分离；②灰化；③显色、比色的三个阶段。

2．酶测定法

可分别利用磷脂酶A、B、C、D等4种酶作用，加水分解，测定其产物，对PL进行定量。

一般多采用磷脂酶D（PL-D）进行定量。

PL-D可作用于含有卵磷脂、溶血卵磷脂和鞘磷脂以及含胆碱的磷脂，这三种磷脂约占血清总磷脂的95%。

本法快速准确，便于自动生化分析仪器进行批量检测。

一、化学法（消化法）

1．原理

以有机混合试剂（无水乙醇、乙醇）抽提血清中磷脂，再用浓硫酸和过氯酸消化抽提液中的脂类和其他有机化合物，用硝酸盐与磷反应生成有色化合物，比色定量。

本法可用组织细胞磷脂的抽提定量。

2．试剂组成

代号

种类

浓度

组成

贮2～8℃

有效时间

R-1

抽提液

无水乙醇：

乙醇=3:

R-2

消化液

用1L密器，加水约500ml，置冷水中缓缓加浓硫酸280ml到水中，冷却后加过氯酸（70%，AR）65ml，混匀，加蒸馏水至1000ml

R-3

显色剂

钼酸铵（A.R）2.5g+无水醋酸钠8.2g，加蒸馏水溶解并稀释至1L，监用时取此液体9份加新配的VitC液（10%）1份，混合即可

R-4

参考液（贮存液）1mg/L

称干燥KH2PO（A.R）0.4393g,溶于蒸馏水中，转移至100ml的容量中，用蒸馏水加至刻度。

冷藏

R-5

参考应用液

0.04mg/ml

取贮存液2ml加至50ml容量中，加水至刻度

冷藏

3．操作

按图15-5操作。

4．计算

血清脂性磷浓度=ESA/EST×10（mg/dl）

血清磷脂（以卵磷脂计）=ESA/EST×10×0.3229（mmol/L）

图15-5血清磷脂测定（消化法）操作图*采用带塞玻璃试管

二、酶法

1．原理

磷脂酶D因特异性不高，能水解血清中卵磷脂，溶血卵磷脂和神经磷脂（三者占血清总磷脂的95%），释放出胆碱，胆碱在胆碱氧化酶作用下生成甜菜碱和H2O2，在过氧化物酶作用下，H2O2，4-氨基安替比林、酚发生反应生成红色醌亚胺化合物，其颜色深浅与这三种磷脂的含量成正比，在500nm波长下比色计算结果为：

2．试剂

（1）酶应用液（参考配方）：

每100mlTris-His缓冲液（50mmol/L，pH7.8）中含：

磷脂酶D

45U

胆碱氧化酶

100U

过氧化物酶

220U

4-氨基安替比林

12mg

酚

20mg

CaCl2·2H2O

8mg

TritonX-100

0.2g

（2）标准液：

纯卵磷脂，临用前配制，5mg/2.5ml蒸馏水（含TritonX-1000.5%）

3．操作

（1）标本采集：

空腹12h抽静脉血，不抗凝，分离血清或抗凝血分离血浆。

（2）在3.0ml酶应用液中加入血清（浆）20μl，标准管加标准液20μl，空白管加水20μl，放置37℃水浴10min后，波长500nm，比色，空白管液调零。

4．计算

血清磷脂（mg/dl）=TA/SA×200

血清磷脂（mmol/L）=血清磷脂（mg/dl）×0.01292

第四节　非酯化脂肪酸测定

临床上将C10以上的脂肪酸称为游离脂肪酸（freefattyacid,FFA）或非酯化脂肪酸（nonesterifiedfattyacid,NFFA），正常血清中含有油酸（18:

1,W9）占54%，软脂酸（16：

0）占34%，硬脂酸（18：

0）占6%，是其主要的NFFA。

另外还有月桂酸（12：

0）、肉豆蔻酸（14：

0）和花生四烯酸（20：

4，W6，9，12，15）等含量很少的脂肪酸。

与其他脂质比较，NFFA在血中浓度很低，其含量水平极易受脂代谢，糖代谢和内分泌机能等因素影响，血中NFFA半寿期为1～2min，极短。

血清中的NFFA是与清蛋白结合进行运输，属于一种极简单的脂蛋白。

测定血清NFFA法有滴定法。

比色法，原子分光光度法，高压液相层析法和酶法等。

一般多以酶法测定。

作NFFA测定的标本一定要注意在4℃条件下分离血清并尽快进行测定。

因为血中有各种脂肪酶存在，极易也极快使血中TG和PL的酯型脂肪酸分解成非酯化的FFA，使血中NFFA值上升。

贮存标本仅限于24h内，若保存三天，其值约升高30%，使结果不准确。

1．非酶法测定

非酶法测定包括滴定法、比色法、原子吸收分光光度法和高压液相层析法。

前三种方法准确性差；高压液相层析法，仪器太昂贵，不便于批量操作。

2．酶测定法

主要用脂肪酶测定。

血清中游离脂肪酸可分别测定酶水解后的产物乙酰CoA或AMP或辅酶A（CoA）进行定量。

酶法测定结果准确可靠，快速，易于批量检测。

测定原理如图15-6所示。

图15-6血清主要FFA酶法测定图

□：

内物质作为生成量与变化量进行测定；ACS：

乙酰CoA合成酶；MK：

肌激酶；　PK：

丙酮酸激酶；POD：

丙酮酸氧化酶；DTNB：

α-磺基苯甲酸；ACO：

乙酰CoA氧化酶；ACD：

乙酰CoA脱氢酶。

一、亮度法

1．原理

血清中游离脂肪酸经抽提到高密度铜试剂中，形成铜皂在上层溶剂中，再用二苯卡巴肼与铜显色，进行定量。

2．试剂组成

代号

种类

浓度

组成

贮存2～8℃

有效期

R-1

抽提剂

氯仿：

庚烷：

甲醇=5：

5：

1（V/V）

R-2

缓冲液

33mmol/L

KH2PO44.539g/L100ml+Na2HPO4·2H2O5.983g/l50ml调pH至6.4

R-3

铜贮液

500mmol/L

Cu（NO3）2·3H2o12.07g加H2O→100ml

R-4

三乙醇胺

1.0mol/L

三乙醇胺10ml，加水→100ml

R-5

NaOH液

1mol/L

R-6

铜试剂

R-310ml+R-410ml+R-66ml

+H2O→100ml调pH至8.1

R-7

二苯卡

巴肼液

二苯卡巴肼（乙醇）液（4g/L）10ml+R-40.1ml

临用前配制

R-8

软脂酸标准贮存液

2mmol/L

软脂酸51.2mg溶于100mlR-1液

冷藏

R-9

R-8的应用液

500μmol/L

用R-1液稀释

冷藏

3．操作

按图15-7操作。

4．计算

血清游离脂肪酸（μmol/L）=ESA/EST×500

二、酶法

1．原理

血清中游离脂肪酸或非酯化脂肪酸（NEFA），经酶试剂作用生成紫色化合物，其颜色深浅与NEFA含量成正比。

2．试剂组成

代号

种类

组成

浓度贮存

贮存

缓冲液

磷酸缓冲液

MgCl2液

去垢剂

0.04mmol/LpH6.9

3mol/L

酶/辅酶

乙酰CoA合成酶

抗坏血酸氧化酶

CoA

ATP

4-AAP

溶于10mlR1液中

≥0.3U/ml

≥1.5U/ml

0.9mmol/L

5.0mmol/L

1.5mmol/L

冷藏5日

酶稀释液

苯氧乙醇

去垢剂

0.3%（V/V）

马来酰亚胺

该试剂与R3等体积混合

10.6mmol/L

酶试剂

乙酰CoA氧化酶

过氧化物酶

TOOS

混合上述试剂，再等体积R4试剂混合

≥10U/ml

7.5U/ml

0.2mmol/L

冷藏5日

标准液

1mmol/L

冷藏

*应用带玻塞离心管

3．操作

按图15-8操作。

4．计算

图15-7血清非酯化脂肪酸测定（光度法）操作图

图15-8血清非脂化脂肪酸测定（酶法）操作图

（胡汉宁　储建中）

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