均匀设计法从人发中提取黑色素的工艺及其性质研究.docx

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均匀设计法从人发中提取黑色素的工艺及其性质研究

均匀设计法提取人发中黑色素工艺及其性质研究

摘要：

本文用均匀设计法探讨了不同的提取剂、提取时间、提取剂浓度、提取剂用量及提取温度对人发中黑色素提取率的影响，因而确定了人发黑色素的最佳提取工艺，即以人发（g）:

提取剂（ml）为1:

2的比例，36%浓盐酸做提取剂，在（95±1）℃的恒温条件下回流4h。

随后，对该黑色素的理化性质等进行了较系统的研究。

结果表明，人发黑色素耐光、耐热;对还原剂较稳定；对强氧化剂不够稳定；碱性条件下较稳定;Cu2+、Ca2+、Fe3+、Zn2+等金属离子对该色素有护色、增色作用；Mg2+、Al3+、Na+虽有减色作用，结果表明制备的天然黑色素性能优良。

关键字：

均匀设计法；提取；黑色素；理化性质；胱氨酸；稳定性

StudyonExtractionTechnologyandPropertiesoftheMelaninfromHairbyUniformDesignMethod

Abstract:

Inthispaper,theextractiontechnologyandtheeffectsofdifferentsolvent,extractiontime,solventconcentration,solventdosageandtemperatureontheextractionrateofthemelaninfromhairwasstudied.Theresultsshowedthat36%hydrochloricacidwasusedasthesolventandtheoptimumstockratio1:

2，temperature95℃anddistillation4h.Physicalandchemicalpropertiesofthemelaninindicatedthatthemelaninwasstabletolightandtemperature,stableinalkalinesolutionandreducingagents,ithadlessresistanceagainstoxidant.Themetalions,Ca2+,Cu2+,Fe3+,Zn2+couldstabilizeandenhancethepigmentcolorinalkalinecondition.AlthoughMg2+,Al3+,Na+couldreducepigmentcolor,theeffectwasnotobvious.Itwasfoundthatthenaturemelaninhasgoodperformanceandthemethodisconvenientandfeasible.

Keywords：

Uniformdesign;Extraction;Melanin;Physicalandchemicalproperties;Cystine;Stability

1前言

1.1黑色素的概述

1.1.1黑色素的理化性质

黑色素（melanin）是一种生物多聚体。

它广泛存在于动物、植物和微生物中，是目前已知生物色素中最多最广的一类色素[1]。

黑色素可分为两类，一是真黑色素（eu-melanin），不含硫原子，呈棕色或黑色；二是脱黑色素（pheomelanin），含硫原子，呈黄色或微红棕色。

黑色素不溶于酸性溶液，微溶于水，不溶于常见有机溶剂，可溶于碱溶液。

在一些情况下，黑色素与糖及蛋白质结合，导致黑色素具有水溶性[2]。

黑色素在紫外波长220nm下吸收值最大，且随波长的增加，其吸收值下降[3]。

它的红外吸收光谱在3μm和6μm各有一个吸收峰[4]。

其中3422cm的吸收峰是由-0H的伸缩振动产生的，1636和1558cm吸收峰是由芳环骨架振动产生的，在860~650cm范围内的吸收带很弱，表明芳环被取代，形成了共轭体系。

黑色素的电子自旋共振（ESR）波谱是典型的一次微商波谱，无超精细结构，其特征参数g=2.0030~2.0044。

1.1.2黑色素的形成

黑色素的形成是黑色素细胞能分泌一种酪氨酸酶（一种氧化酶），使人发中的酪氨酸被氧化成β-（3，4-二羟苯基）-α-氨基丙酸（又名多巴DOPA）。

天然的多巴为L构型，在酶作用下，它再被氧化成多巴醌，多巴醌进一步被氧化，然后聚合生成黑色素。

黑色素与角蛋白结合形成一种结合蛋白质——黑色素蛋白质。

反应如下：

图1黑色素蛋白的合成

1.1.3黑色素的提取方法

国内外对黑色素提取方法，主要有酸法、酶法、超声波法等。

各种方法各有其优缺点，应根据试验目的、要求及实际条件来选择适用的方法，亦可将各方法进行比较、结合使用。

其中，酸法是一种较常用的方法，只是其操作比较繁琐。

酸法提取的人发黑色素光稳定性优于酶法，但热稳定性方面，酸法不及酶法的人发黑色素稳定。

在抗紫外线方面，酶法优于酸法。

在黑色素的提取率上,蛋白酶法高于盐酸水解法。

超声提取过程产生强烈的振动、空化、搅拌，与传统提取方式比较具有收率高、生产周期短、无需加热，有效成分不被破坏等优点[5]。

与传统提取方式比较，超声提取方法具有简便、提取率高、操作时间短、溶剂用量少的优点。

1.1.4前景与展望

目前，在化学工业中所用的黑色染料绝大多数是合成染料，其结构中的特征基团为偶氮基（-N=N-），现己证实具这种结构的黑色染料有一定的毒性，能够致癌。

因此，很多国家己禁止将这种偶氮结构的染料用于与人体直接接触的消费品上，如染发剂和皮革工业。

在回归自然的趋势下，人们迫切需要安全无毒，不会引起皮肤过敏的天然植物染发剂。

日本、法国正在研制从天然植物中提取白发染黑剂。

印度从苏木精中提取染发剂。

我国地域广阔，有极其丰富的天然黑色素资源，必须抓紧充分利用这些资源，研制出具有实用价值的染发剂产品口[6]。

目前国内外己有这方面的专利报道[7，8]，但在应用过程中发现用天然黑色素做成的染发剂染发还存在不稳定的缺点，尤其是在流汗后更易脱落，因此，还应进行配方方面的研究。

天然黑色素在食品工业上也有很广泛的用途，可将它作为酒类、饮料类、婴儿保健品及大众食品等添加剂。

例如，提取黑芝麻、黑豆、黑米内的天然黑色素，再配以山野果汁天形成黑色饮料，更加丰富了营养成份，又保持着天然本色。

特别是近年来的研究表明，黑色素具有抗氧化和防止衰老等功能[9，10]，这将大大促进天然黑色素在日益受重视的保健食品工业中的应用。

天然黑色素具有防止紫外线辐射的功能，因此，可被用于日用化妆工业制备防晒膏、防晒霖和黑发剂。

此外，近年来发现一些可溶性黑色素在体外对爱滋病病毒有显著的抑制作用，使天然黑色素将来有可能成为一种新的抗爱滋病药物[11]。

2实验部分

2.1实验仪器

名称

厂商

WZFUV-2102PCS型紫外-可见分光光度仪

龙尼柯（上海）有限公司

Tanon-4100全自动数码凝胶成像仪

天能科技（上海）有限公司

精密酸度计PHS-2C型

上海大普仪器有限公司

RE-52A型旋转蒸发器

巩义市英峪予华仪器厂

GZX-9140ME型数显鼓风干燥箱

上海博迅实业有限公司医疗设备厂

DK-8D型电热恒温水槽

巩义市予华仪器有限责任公司

85－2型恒温磁力加热搅拌器

常州澳森电器有限公司

微量进样器

上海安亭微量进样器厂

薄层色谱展开缸

上海信谊仪器厂

电子天平

梅特勒－托利多仪器（上海）有限公司

2.2实验药品

药品名称

纯度

生产厂家

浓盐酸（36~38%）

化学纯

湖南省株洲市化学工业研究

羧甲基纤维素钠

化学纯

天津市光复精细化工研究所

板层析硅胶G

化学纯

青岛海浪硅胶干燥剂厂

乙酸乙酯

化学纯

天津市光复精细化工研究所

甲醇

化学纯

广东汕头市西陇化工厂

丙酮

分析纯

广东汕头市光华化学厂

石油醚（沸程：

60～90℃）

分析纯

天津市光复科技发展有限公司

无水乙醇

分析纯

安徽安特生物化学有限公司

茚三酮

分析纯

上海试剂三厂

氨水

分析纯

汕头市光华化学厂

L-精氨酸

分析纯

天津市光复精细化工研究所

正丁醇

分析纯

天津市科密欧化学试剂开发中心

乙酸

分析纯

广东·汕头市西陇化工厂

氢氧化钠

分析纯

广东汕头市光华化学厂

硫酸铜

分析纯

天津市科密欧化学试剂开发中心

硫酸镁

分析纯

天津市科密欧化学试剂开发中心

氯化钙

分析纯

天津市科密欧化学试剂开发中心

硫酸钠

分析纯

天津市科密欧化学试剂开发中心

三氯化铝

分析纯

天津市科密欧化学试剂开发中心

氯化锌

分析纯

天津市科密欧化学试剂开发中心

高锰酸钾

分析纯

天津市科密欧化学试剂开发中心

重铬酸钾

分析纯

天津市科密欧化学试剂开发中心

双氧水

分析纯

天津市科密欧化学试剂开发中心

次氯酸钠

分析纯

天津市科密欧化学试剂开发中心

亚硫酸钠

分析纯

天津市科密欧化学试剂开发中心

亚硝酸钠

分析纯

天津市科密欧化学试剂开发中心

2.3实验原理与方法

2.3.1实验原理

当头发的角蛋白在一定条件下被水解时，由于角蛋白的结构被破坏，包含在其中的黑色素随即被游离出来。

在反应条件下，部分黑色素被离解成分子量更小的可溶性物质，使水解液呈棕黑色，部分则为黑色不溶性物质，即为本试验中提取的黑色素[12]。

水解液中生成的氨基酸，其中主要是胱氨酸，利用氨基酸在其等电点时溶解度最小，调整介质的pH值，使胱氨酸沉淀析出。

2.3.2黑色素提取工艺优化

2.3.2.1提取剂的选择

准确称取4份人发各10.00g，分别加36%浓盐酸20.00mL、80％甲醇、乙醇、乙醚与浓盐酸的混合液各20mL（V：

V=1：

1），在（95±1）℃的恒温条件下回流4h，然后过滤、蒸馏浓缩、干燥、称重。

2.3.2.2提取剂浓度的选择

准确称取4份人发各10.00g，分别加20.00mL浓度为5%、10％、20％、36％盐酸溶液，在（95±1）℃的恒温条件下回流4h，然后过滤、蒸馏浓缩、干燥、称重。

2.3.2.3提取剂用量的选择

准确称取4份人发各10.00g，分别加36％的浓盐酸10mL、20mL、30mL、40mL，在（95±1）℃的恒温条件下回流4h，然后过滤、蒸馏浓缩、干燥、称重。

2.3.2.4提取时间的选择

准确称取4份人发各l0.00g，各加36％浓盐酸20.00mL，在（95±1）℃的恒温条件下回流2h、3h、4h、5h，然后过滤、蒸馏浓缩、干燥、称重。

2.3.2.5提取温度的选择

准确称取4份人发各l0.00g，各加36％浓盐酸20.00mL，在80℃、85℃、90℃、95℃、100℃、105℃的恒温条件下回流4h，然后过滤、蒸馏浓缩、干燥、称重。

2.3.3人发中黑色素的理化性质研究

2.3.3.1色素溶解性

取少量黑色素加入蒸馏水、36%浓盐酸、乙醇、乙酸乙酯、丙酮、甲醇、浓氨水和pH值为8～13的NaOH溶液中，观察其溶解性[13]。

2.3.3.2色素的光谱特征

将精制成的pH=7.5、浓度为0.0125％的黑色素溶液，以蒸馏水作基准，然后在波长180-330nm范围内用WZFUV-2102PCS型紫外-可见分光光度仪进行扫描，测定其吸光度（ABS），确定λmax。

2.3.3.3色素热稳定性

将pH=7.5的0.025％黑色素溶液分别置于25、50、80、100℃恒温水浴中加热，以0.5h为时间间隔，取出后快速冷却至室温，在λmax测其ABS值。

2.3.3.4色素光稳定性

将配置的pH=7.5，浓度为0.025％的黑色素溶液于容量瓶中，分别置于紫外光下30cm处、室内暗处和自然光下照射，经一定时间后测定其ABS值。

2.3.3.5氧化剂、还原剂对色素的稳定性

取相同稀释条件下的黑色素水溶液l0mL分别加到不同浓度的KMnO4、K2Cr2O7、10％H2O2、NaClO和Na2SO3溶液中，摇匀，在λmax测其ABS值。

2.3.3.6金属离子对色素的稳定性

配制CuS04、MgSO4、CaCl2、NaSO4、FeCl3、AlCl3和ZnCl2溶液，使它们的浓度达到30mg/L，各吸取这7种金属离子溶液0.2mL，分别加入到预先有10mL黑色素液的容量瓶中，定容，在λmax测定色素液ABS值。

2.3.3.7蔗糖、葡萄糖对黑色素的稳定性

取黑色素溶液，分别配制含蔗糖、葡萄糖浓度均为3％的色素溶液，在室温（30℃）下避光放置l00h后，在λmax下测定其最大的吸光度ABS值。

2.3.4氨基酸的分离与鉴定

2.3.4.1试剂配置

1.Pauly试剂配制：

甲液：

准确称量0.09g对氨基苯磺酸，加12mol/L盐酸0.9mL，加热溶解后，加水至10mL，冷却至30℃，再与等量的5%亚硝酸钠水溶液相混，置棕色瓶中，在冰箱中保存。

乙液：

10%硝酸钠溶液。

2.板口试剂配制：

甲液：

准确称量0.5g8-羟基喹啉溶于500mL的丙酮中，配制0.1%8-羟基喹啉丙酮液500mL。

乙液：

1mL溴溶于500mL0.5mol/L氢氧化钠溶液中。

3.显色剂配制：

准确称量1g茚三酮溶于200mL丙酮中，配制0.5%的茚三酮丙酮液200mL。

4.展开剂配制：

按正丁醇：

乙酸：

水=15：

3：

2（V/V）配制100mL展开剂，置于层洗缸中。

5.标准胱氨酸的配制[14]：

准确称量胱氨酸10mg加入三支试管中，再向各个试管中加入2mL蒸馏水，使氨基酸的浓度为5mg/mL。

2.3.4.2薄层板的制备

⑴洗板：

用水多次冲洗，再用洗衣粉水洗涤，最后用蒸馏水冲洗。

⑵烘板

⑶配制0.5%的羧甲基纤维素钠溶液200mL：

准确称量羧甲基纤维素钠1g，放入200mL的蒸馏水中，在磁力搅拌机上加热溶解，配得200mL0.5%的羧甲基纤维素钠溶液。

⑷准确称量45.0g硅胶与0.5%的羧甲基纤维素钠溶液按3：

1混合。

⑸铺板：

⑹凉干

⑺活化：

将凉干的板子在105℃烘箱中干燥30min，取出，放在干燥器中。

2.3.4.3脱色与浓缩

在滤液中加活性炭在90℃下脱色2次，每次用活性炭10g。

吸滤、得浅黄色液体。

将此浅黄色液体，放入旋转蒸发器中，在65℃加热浓缩3h，使液体体积大约为5mL。

2.3.4.4点样

先用铅笔在距薄层板一端1cm处轻轻划一横线作为起始线，然后用毛细管分别吸取2.3.4.3浓缩的样品5μL，点2个样品点。

再分别吸取标准胱氨酸3μL、4μL、5μL、6μL，在起始线上小心点样，斑点直径一般不超过2mm。

按少量多次，待前次点样的溶剂挥发后方可重新点样，以防样点过大，造成拖尾、扩散等现象，而影响分离效果。

2.3.4.5展开

在层析缸中加入配好的展开溶剂，使其高度不超过1cm。

将点好的薄层板小心放入层析缸中，点样一端朝下，浸入展开剂中。

盖好瓶盖，观察展开剂前沿上升到一定高度时取出，尽快在板上标上展开剂前沿位置。

自然晾干。

2.3.4.6显色

用喷雾器将显色剂均匀喷于凉干的层析板上，自然凉干，观察斑点位置，并计算Rf值。

3结果与讨论

3.1提取剂选择对提取率的影响

由图2看出，人发中的黑色素在36%浓盐酸中的提取率最高，水、乙醚中均不溶，在甲醇和乙醇中溶解性相差无几。

但是甲醇有毒，而乙醇无毒且价廉易得，不会引起环境污染问题。

因而最佳提取剂选36%浓盐酸为好。

3.2提取剂浓度对黑色素提取率的影响

由图3看出，提取剂浓盐酸浓度增加，提取率也明显增加，当浓度为36％时的提取率为65.56%，达到最大值并且时间也较短。

因此，提取剂的最佳浓度为36%。

3.3提取剂用量对黑色素提取率的影响

由图4看出，提取剂用量增加，黑色素的提取率也逐渐增加，当提取剂用量为20mL时提取率最大为65.5%。

用量继续增加，黑色素遭到破坏，提取率逐渐降低，最后不再变化，因此，提取剂用量为20mL时，即即人发和提取剂（重量：

体积）比例为1：

2时的提取效率最好。

3.4提取时间对提取率的影响

结果见图5，人发中黑色素的提取率随时间增加有所增加，但在4h和其以上时间时无明显差异。

提取时间的延长会带来其他杂质，增加后续精制处理的步骤。

因此，4h时的提取效果最适。

3.5提取温度对提取率的影响

由图6看出，随着温度的增加，黑色素提取率逐渐增加，在95℃时提取率为65.54%，达到最大值，温度继续增加，高温将黑色素结构破坏，使提取率有所降低，因此，95℃为提取的最佳温度。

3.6黑色素的理化性质对稳定性的影响

3.6.1色素的溶解性

表1人发黑色素在不同试剂中的溶解性

试剂

蒸馏水

36%浓盐酸

乙醇

乙酸乙酯

丙酮

甲醇

浓氨水

NaOH

溶解性

不溶

不溶

不溶

不溶

不溶

微溶

易溶

易溶

由表1看出，人发黑色素不溶于蒸馏水、酸和常用的乙醇、乙酸乙醋、丙酮等有机溶剂，微溶于甲醇，易溶于浓氨水和NaOH。

由图7可知，pH值增大，黑色素的溶解时间也越短，当pH大于9时，溶解时间相差无几，从经济成本考虑，pH为10时为最佳条件。

3.6.2色素的光谱特征

图7说明人发黑色素在紫外波长下有最大吸收，最大吸收峰在220nm处，并随着波长增加，其吸光值下降，与Bell[15]报道的黑色素紫外吸收特征一致。

3.6.3温度对色素稳定性的影响

表2不同温度及不同受热时间下人发中黑色素的吸光值

温度

受热时间

热降解率（%）

0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

25

2.104

2.084

2.083

2.112

2.091

2.098

-0.9

50

2.104

2.085

2.087

2.118

2.109

2.088

-0.76

80

2.104

2.089

2.095

2.123

2.132

2.125

1.0

100

2.104

2.137

2.168

2.179

2.181

2.196

4.4

从表2可知，该色素的吸光度值在80℃以下基本不发生变化，在100℃以下加热2.5h，黑色素降解幅度只有4.4％。

目测色素液颜色均无变化，所以人发中黑色素在不同温度条件下的热稳定性较好。

3.6.4光对色素稳定性的影响

表3光照对人发黑色素稳定性影响

光照

时间（d）

吸光度变化率（%）

初始值

1

3

5

15

紫外光

2.340

2.335

2.330

2.324

2.319

-0.9

自然光

2.340

2.338

2.333

2.336

2.328

-0.5

暗处

2.340

2.340

2.340

2.339

2.337

-0.13

从表3中可见，黑色素在紫外光照射下放置15d，其吸光度值仅下降为0.9%；自然光及暗处下其吸光度值基本不变，色素液颜色也均无明显变化，表明人发中黑色素耐光性良好。

3.6.5氧化剂、还原剂对色素稳定性的影响

表4氧化剂对人发黑色素稳定性的影响

溶液

KMnO4（mL）

K2Cr2O7（mL）

吸光度

初始值

5

10

15

5

10

15

2.104

1.737

0.391

0.229

1.753

1.340

0.711

溶液

NaClO（mL）

H2O2（mL）

吸光度

初始值

5

10

15

5

10

15

2.104

2.108

2.055

2.026

1.858

1.610

1.189

表5还原剂对人发中黑色素稳定性的影响

时间（h）

加入Na2SO3（g）

0.05

0.10

0.20

0.30

0.40

0

1.767

1.767

1.767

1.767

1.767

7

1.757

1.760

1.762

1.766

1.769

24

1.762

1.765

1.759

1.761

1.773

48

1.744

1.758

1.768

1.770

1.777

由表4可见，该黑色素随KMnO4、K2Cr2O7、NaClO、H2O2浓度增大，吸光度值减小；长期放置色素液均变为无色，表明KMnO4、K2Cr2O7、NaClO和H2O2对人发黑色素都有漂白作用，说明人发黑色素对强氧化剂不稳定。

由表5可见，随Na2SO3浓度增大，吸光度值增加，但放置48h后，色素几乎没有损失，表明该色素有良好的耐还原性。

3.6.6金属离子对色素稳定性的影响

表6金属离子对人发中黑色素稳定性得影响

时间

金属离子

蒸馏水

Cu2+

Mg2+

Ca2+

Na+

Fe3+

Zn2+

A13+

10min

1.470

0.438

1.261

0.685

1.578

1.026

0.441

0.978

24h

1.947

0.831

1.498

0.965

1.682

0.858

0.927

0.994

48h

2.042

0.842

1.379

0.916

1.870

1.062

0.893

0.981

从表6可知，金属离子Cu2+、Ca2+、Fe3+、Zn2+对色素有较强的保色、增色作用；Mg2+、A13+、Na+虽有减色作用，但不十分明显。

3.6.7蔗糖、葡萄糖对黑色素的影响

表7蔗糖、葡萄糖对黑色素稳定性关系

糖类

A值

颜色

沉淀物

3%蔗糖溶液

0.35

黑色

无沉淀

3%葡萄糖溶液

0.31

黑色

无沉淀

由表7可知，不加任何物质的色素溶液的最大吸光度A值为0.35，而加了糖类的色素溶液在放置100h后所测定的最大A值变化不大，因此测定结果表明，蔗糖和葡萄糖均对该黑色素的稳定性无影响。

3.7胱氨酸的薄层分析

图8胱氨酸样品的凝胶成像仪扫描结果图

表8胱氨酸薄层色谱的Rf值

点样量序号

1

2

3

4

5

6

a/cm

3.4

3.5

3.5

3.5

3.6

3.6

Rf值

0.34

0.35

0.35

0.35

0.36

0.36

注：

b＝10cmRf＝a/b

1号、2号为人发中分离浓缩的胱氨酸样品，分别点样5μL;3号、4号、5号、6号为5mg/mL标准胱氨酸，依次点样3μL、4μL、5μL、6μL，由图8看出，1号、2号样品由于浓度较低，颜色很浅，标准品浓度较深；样品的斑点与标准品基本一致，因此，样品中含有胱氨酸。

4结论

人发中的黑色素不溶于蒸馏水、酸和常用的乙醇、乙酸乙醋、丙酮等有机溶剂，微溶于甲醇，易溶于浓氨水和pH大于9的强碱溶