猪脑心肌炎病毒广西株的分离及其全基因组序列分析硕士论文.docx
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猪脑心肌炎病毒广西株的分离及其全基因组序列分析硕士论文
猪脑心肌炎病毒广西株的分离
及其全基因组序列分析
二○○九年六月
硕士学位论文
猪脑心肌炎病毒广西株的分离
及其全基因组序列分析
学科专业预防兽医学
指导教师教授
副研究员
论文答辩日期学位授予日期
答辩委员会主席
论文评阅人
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学位论文原创性声明
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猪脑心肌炎病毒广西株的分离及其全基因组序列分析
中文摘要
脑心肌炎病毒（Encephalomyocarditisvirus,EMCV）属于微RNA病毒科（Picornaviridae）、心病毒属（Cardiovirus）的成员，可引起猪的以脑炎、心肌炎或心肌周围炎为主要临床特征的急性传染病。
针对猪EMCVVP3/VP1基因序列设计并合成一对特异性引物，以构建的含有该引物扩增序列的重组质粒作为阳性标准品，建立了检测EMCV核酸的SYBRGreenIreal-timePCR方法。
该方法线性关系好，标准曲线的相关系数达到0.991；敏感性高，初始模板的检出下限为1×101拷贝/μL，比常规PCR方法高100倍；特异性强，与其它猪源病毒均不发生交叉反应；重复性好，组内与组间的变异系数均小于3%。
应用所建立的方法对临床29份可疑病料进行检测，结果1份为阳性。
将该份疑似病料上BHK-21细胞，并对其进行特性鉴定，确诊为EMCV，命名为EMCV-GXLC，设计5对引物，采用RT-PCR技术扩增EMCV分离株基因组完整开放阅读框（ORF）序列，应用3′-RACE和5′-RACE技术扩增分离株的3′-UTR和5′-UTR，分别进行扩增片段的克隆和测序。
结果表明，EMCV-GXLC株基因组全长7725nt，编码区为6879nt，编码2292个aa，将该株全基因组上传NCBI，GenBank登录号：
FJ897755。
应用分子生物学软件对EMCV-GXLC全基因组核苷酸及推导氨基酸序列进行了序列比对和同源性分析。
全基因组比对结果表明，分离株与来源于广西的FJ604852、FJ604853，北京的DQ464062，河北的DQ464063，韩国的DQ517424、EU780148、EU780149等猪源EMCV分离株的同源性较高，达99.5%以上。
各个片段推导的氨基酸同源性分析显示，非结构蛋白比结构蛋白保守；在非结构蛋白中，3D蛋白最为保守，2A相对变异较大，预示EMCV的诊断引物可以基于3D基因；在结构蛋白中，VP2蛋白相对保守，VP1蛋白同源性最低、变异性较大，适合用于分子流行病学的调查。
VP1蛋白有两个潜在的N-糖基化基序，分别为N29QT和N62QT，VP1是表位最多的区域，预测有9个可能的表位；VP2和VP3共有6个潜在的N-糖基化位点。
3′-UTR和5′-UTR二级结构分析显示，FJ897755与来源于韩国的DQ517424相似度最高。
进化树分析显示，结构蛋白与全基因序列的系统发育进化树相近，且不同结构蛋白基因序列之间的系统发育进化树结构也类似，在分析EMCV分离株的进化关系时，可以使用VP3/VP1基因来绘制系统发育进化树。
关键词：
猪脑心肌炎病毒；荧光定量PCR；分离；测序；全基因组；进化分析
ISOLATIONANDGENOMICSEQUENCEANALYSISOFPORCINEENCEPHALOMYOCARDITISVIRUSGUANGXISTRAIN
英文摘要
Encephalomyocarditisvirus（EMCV）isamemberofthegenusCardiovirusofthefamilyPicornaviridae,itisclinicallycharacterizedbyencephalitis,myocarditisorinflammationaroundcardiacmuscles.
ApairofprimerswasdesignedaccordingtothesequenceoftheVP1geneofEMCVandareal-timePCRassaybasedonSYBRGreen
fordetectionofEMCVwasestablished.TheassayhadagoodlinearrelationshipbetweeninitialtemplatesandCtvalues,andthecorrelationcoefficientofthestandardcurvewas0.991.Also,itwashighlysensitiveandhadadetectionlimitof1×101copies/μLofinitialtemplates,whichwas100timesmoresensitivethantheconventionalPCR.Moreover,itwashighlyspecificandhadnocross-reactionwithotherporcineviruses.Finally,itwashighlyreproducibleandhadacoefficientofvariationslessthan3percentforbothintra-andinter-assay.
OneEMCVstrainwasisolatedfromtheclinicaltissuesamplesorignatedfrompigfarmsinGuangxibyusingBHK-21cells.ThisisolatewasdesignatedEMCV-GXLC（GenBankaccessionNo.FJ897755），andidentifiedusingIFA.Thevirusparticleswithdiameterof27nmwereobservedbyimmuneelectronmicroscopy（IEM）.FivepairsofprimersweredesignedandfiveoverlappingcDNAfragmentscoveringthecompleteopenreadingframe（ORF）withinBJC3andHB1wereamplifiedusingRT-PCR.The5'-rapidamplificationofcDNAends（RACE）and3'-RACEwereemployedtoamplifythe5'-untranslatedregion（UTR）and3'-UTRoftheRNAoftheviruses.ThesequencesofRT-PCR-generatedcDNAfragmentsfromEMCV-GXLCviruseswereassembled.ThecompletegenomesofEMCV-GXLCconsistedof7725nucleotides,andpossessedalargeORFwithasizeof2292aminoacids.
ThehomologyofthegenomicnucleotidesequencesandthepredictedaminoacidswerealignedandanalyzedamongEMCV-GXLCandotherEMCVstrainsavailableinGenBank.Theresultsshowedthat
KEYWORDS:
encephalomyocarditisvirus（EMCV）；real-timePCR；isolation；sequence；genome；phylogeneticanalysis
目录
中文摘要I
英文摘要II
目录III
插图和附表VI
插图清单VI
附表清单VII
缩略词表VIII
1.文献综述1
1.1EMCV基因组结构1
1.1.1EMCV衣壳蛋白及其功能2
1.1.2EMCV非结构蛋白P2和P33
1.1.3EMCV5′-UTR结构与功能3
1.1.4EMCV3′-UTR5
1.2EMCV诊断技术5
1.2.1病毒分离5
1.2.2抗体检测方法5
1.2.3抗原检测方法6
1.3EMCV的流行情况及流行特点6
1.3.1流行情况6
1.3.2流行特点7
1.4EMCV的公共卫生学意义8
1.5研究内容与技术路线9
1.5.1研究内容9
1.5.2技术路线10
2.猪脑心肌炎病毒SYBRGreenIreal-timePCR检测方法的建立错误！
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2.1材料与方法错误！
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2.1.1病毒与引物错误！
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2.1.2主要试剂错误！
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2.1.3试验用溶液配制错误！
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2.1.4主要仪器设备错误！
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2.2方法错误！
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2.2.1质粒标准品的制备错误！
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2.2.2Real-timePCR反应条件的优化错误！
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2.2.3Real-timePCR标准曲线的制作错误！
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2.2.4Real-timePCR的敏感性试验错误！
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2.2.5Real-timePCR的特异性试验错误！
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2.2.6Real-timePCR的重复性试验错误！
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2.2.7Real-timePCR的初步应用错误！
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2.3结果与分析错误！
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2.3.1质粒标准品的制备错误！
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2.3.2Real-timePCR反应条件的优化错误！
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2.3.3Real-timePCR标准曲线的制作错误！
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2.3.4Real-timePCR的敏感性试验错误！
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2.3.5Real-timePCR的特异性试验错误！
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2.3.6Real-timePCR的重复性试验错误！
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2.3.7Real-timePCR的初步应用错误！
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2.4讨论错误！
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2.4.1荧光定量PCR检测方法的建立错误！
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2.4.2荧光定量PCR反应特点错误！
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2.4.3影响荧光定量PCR反应的因素错误！
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2.4.4荧光定量PCR反应的优缺点错误！
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2.5小结错误！
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3.猪脑心肌炎病毒广西株的分离及其全基因组序列测定错误！
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3.1材料错误！
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3.1.1病料收集错误！
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3.1.2主要试剂错误！
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3.1.3试验用溶液配制错误！
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3.1.4主要仪器设备错误！
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3.2方法错误！
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3.2.1病毒的分离错误！
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3.2.2病毒的RT-PCR鉴定错误！
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3.2.3EMCV-GXLC株间接免疫荧光抗体试验（IFA）错误！
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3.2.4EMCV-GXLC株TCID50的测定错误！
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3.2.5分离株的全基因组扩增、克隆与测序错误！
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3.3结果与分析错误！
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3.3.1EMCV病毒的分离错误！
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3.3.2EMCV-GXLC株的RT-PCR鉴定错误！
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3.3.3EMCV-GXLC株间接免疫荧光抗体试验（IFA）错误！
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3.3.4EMCV-GXLC株TCID50的测定错误！
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3.3.5EMCV-GXLC株基因片断的RT-PCR扩增结果错误！
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3.3.6EMCV-GXLC株各个基因片段的克隆、测序及序列拼接错误！
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3.4讨论错误！
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3.4.1关于EMCV的分离错误！
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3.4.2关于EMCV的鉴定错误！
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3.4.3关于EMCV-GXLC株全基因的扩增错误！
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3.5小结错误！
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4.猪脑心肌炎病毒广西株（EMCV-GXLC）全基因组分子特征分析错误！
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4.1材料错误！
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4.1.1本研究所用EMCV分离株信息错误！
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4.1.2分子生物学分析软件错误！
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4.2方法错误！
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4.2.1基因组结构分析错误！
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4.2.2序列比对错误！
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4.2.3结构蛋白基本特征、表位预测及二级结构错误！
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4.2.4系统进化分析错误！
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4.3结果与分析错误！
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4.3.1EMCV-GXLC株的基因组组成和结构分析错误！
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4.3.2EMCV各基因片段同源性分析错误！
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4.3.3EMCV多聚蛋白各基因片段连接处氨基酸分析错误！
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4.3.4EMCV-GXLC株VP1分子特征错误！
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4.3.5EMCV-GXLC株VP2、VP3分子特征错误！
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4.3.6EMCV-GXLC株5′-UTR二级结构预测错误！
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4.3.7EMCV-GXLC株3′-UTR二级结构预测错误！
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4.3.8EMCV系统发育进化树绘制错误！
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4.4讨论错误！
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4.4.1EMCV-GXLC株基因组序列比较错误！
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4.4.2EMCV-GXLC株的变异特点错误！
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4.4.3EMCV-GXLC株VP1的抗原性错误！
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4.4.4病毒基因组的系统发育进化关系错误！
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4.5小结错误！
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5.结论11
附录12
附录1：
SYBRGreenIreal-timePCR用重组质粒测序结果12
附录2：
SYBRGreenIreal-timePCR重复性试验数据12
附录3：
EMCV-GXLC株第1~5代细胞毒TCID50测定结果56
附录4：
EMCV-GXLC株全基因组序列58
致谢63
攻读学位期间发表论文情况64
申明65
参考文献66
插图和附表
插图清单
图1-1EMCV基因组结构和多聚蛋白裂解图2
Fig.1-1OrganizationandpolyproteinofthegenomeofEMCV2
图1-2近年来EMCV全球流行情况7
Fig.1-2TherecentglobalepidemicofEMCV7
图21PCR扩增产物错误！
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Fig.2-1ProductofPCR错误！
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M.DNAMarkerDL2000；1.PCR产物错误！
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M.DNAMarkerDL2000；1.PCRproduct错误！
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图22重组质粒鉴定错误！
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Fig.2-2Identificationoftherecombinantplasmid错误！
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图23SYBRGreenIreal-timePCR的扩增曲线（A）、熔解曲线（B）错误！
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Fig.2-3Dynamiccurve（A）andmeltingcurve（B）ofSYBRGreenIreal-timePCR错误！
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图24SYBRGreenIreal-timePCR的标准曲线错误！
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Fig.2-4StandardcurveofSYBRGreenIreal-timePCR错误！
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图25SYBRGreenIreal-timePCR特异性试验错误！
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Fig.2-5SpecificityassayofSYBRGreenIreal-timePCR错误！
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图31EMCV在BHK-21细胞上产生的细胞病变错误！
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Fig.3-1CPEofEMCVinBHK-21cells错误！
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图32EMCV-GXLC株3D基因片段的RT-PCR鉴定错误！
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Fig.3-2Identificationof3DgeneofEMCV-GXLCstrain错误！
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图33EMCV-GXLC株的间接免疫荧光抗体试验鉴定结果错误！
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Fig.3-3IFAidentificationofEMCV-GXLCstraininBHK-21cells错误！
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图34EMCV-GXLC株基因组各片段扩增结果错误！
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Fig.3-5TheamplifiedfragmentsthegenomeofEMCV-GXLCstrainbyRT-PCR错误！
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图41EMCV-GXLC株的序列信息错误！
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Fig.4-1SequenceinformationaboutEMCV-GXLCstrain错误！
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图42EMCV-GXLC株基因组组成简图错误！
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Fig.4-2ThegenomeorganizationdiagramofEMCV-GXLCstrain错误！
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图43EMCV-GXLC株与EMCV参考毒株VP1蛋白氨基酸序列比对错误！
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Fig.4-3AlignmentofthepredictedaminoacidsequencesforVP1ofEMCV错误！
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图44EMCV-GXLC株VP1蛋白特性预测错误！
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Fig.4-4PredictiononantigensitesandsomecharactersofVP1proteinofEMCV-GXLCstrain错误！
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图45EMCV-GXLC株VP2和VP3氨基酸序列错误！
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Fig.4-5PredictedaminoacidsequencesofVP2proteinandVP3proteinofEMCV-GXLCstrain错误！
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图46EMCV-GXLC株VP2蛋白特性预测错误！
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Fig.4-6PredictiononantigensitesandsomecharactersofVP2proteinofEMCV-GXLCstrain错误！
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图47EMCV-GXLC株VP3蛋白特性预测错误！
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Fig.4-7PredictiononantigensitesandsomecharactersofVP3proteinofEMCV-GXLCstrain错误！
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图48EMCV-GXLC株与部分EMCV参考株的5′-UTR二级结构预测错误！
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Fig.4-8Predictionofthe5′-UTRsecondarystructureofEMCV-GXLCstrainandreferenceEMCV错误！
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图49部分EMCV分离株的ploy（C）结构域基因片段比对结果错误！
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Fig.4-9Alignmentofthenucleotidesequencesforploy（C）ofEMCV错误！
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图410EMCV-GXLC株与部分EMCV参考株的3′-UTR二级结构预测错误！
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Fig.4-10Predictionofthe3′-UTRsecondarystructureofEMCV-GXLCstrainandreferenceEMCV错误！
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图411EMCV全基因组、ORF核苷酸序列系统发育进化树错误！
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Fig.4-11PhylogenetictreesderivedfromEMCVcompletegenomeandORFnucleotidesequences错误！
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图412EMCVCCR、VP3/VP1、VP2和VP1核苷酸序列绘制的系统发育进化树错误！
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Fig.4-12PhylogenetictreesderivedfromfourEMCVdatasets，i.e.CCR，VP3/VP1，VP2andVP1nucleotidesequences错误！
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图413EMCVP2、P3、2A、3D核苷酸序列绘制的系统发育进化树错误！
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Fig.4-13PhylogenetictreesderivedfromfourEMCVdatasets，i.e.P2，P3，2Aand3Dnucleotidesequences错误！
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图414EMCV3′-UTR、5′-UTR核苷酸序列绘制的系统发育进化树错误！
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Fig.4-14PhylogenetictreesderivedfromEMCV3′-UTRand
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