猪脑心肌炎病毒广西株的分离及其全基因组序列分析硕士论文.docx

1、猪脑心肌炎病毒广西株的分离及其全基因组序列分析硕士论文猪脑心肌炎病毒广西株的分离及其全基因组序列分析二九 年 六 月 硕士学位论文猪脑心肌炎病毒广西株的分离及其全基因组序列分析学科专业 预防兽医学 指导教师 教授 副研究员 论文答辩日期 学位授予日期 答辩委员会主席 论文评阅人 广西大学学位论文原创性声明和学位论文使用授权说明学位论文原创性声明本人声明：所呈交的学位论文是在导师指导下完成的，研究工作所取得的成果和相关知识产权属广西大学所有。除已注明部分外，论文中不包含其他人已经发表过的研究成果，也不包含本人为获得其它学位而使用过的内容。对本文的研究工作提供过重要帮助的个人和集体，均已在论文中明

2、确说明并致谢。 论文作者签名： 年 月 日学位论文使用授权说明本人完全了解广西大学关于收集、保存、使用学位论文的规定，即：本人保证不以其它单位为第一署名单位发表或使用本论文的研究内容；按照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版本；学校有权保存学位论文的印刷本和电子版，并提供目录检索与阅览服务；学校可以采用影印、缩印、数字化或其它复制手段保存论文；在不以赢利为目的的前提下，学校可以公布论文的部分或全部内容。请选择发布时间：即时发布 解密后发布（保密论文需注明，并在解密后遵守此规定）论文作者签名： 年 月 日导师签名： 年 月 日猪脑心肌炎病毒广西株的分离及其全基因组序列分析中文摘要脑心肌炎病毒（E

3、ncephalomyocarditis virus, EMCV）属于微RNA病毒科（Picornaviridae）、心病毒属（Cardiovirus）的成员，可引起猪的以脑炎、心肌炎或心肌周围炎为主要临床特征的急性传染病。针对猪EMCV VP3/VP1基因序列设计并合成一对特异性引物，以构建的含有该引物扩增序列的重组质粒作为阳性标准品，建立了检测EMCV核酸的SYBR Green I real-time PCR方法。该方法线性关系好，标准曲线的相关系数达到0.991；敏感性高，初始模板的检出下限为1101拷贝/L，比常规PCR方法高100倍；特异性强，与其它猪源病毒均不发生交叉反应；重复性好，

4、组内与组间的变异系数均小于3%。应用所建立的方法对临床29份可疑病料进行检测，结果1份为阳性。将该份疑似病料上BHK-21细胞，并对其进行特性鉴定，确诊为EMCV，命名为EMCV-GXLC，设计5对引物，采用RT-PCR技术扩增EMCV分离株基因组完整开放阅读框（ORF）序列，应用3-RACE和5-RACE技术扩增分离株的3-UTR和5-UTR，分别进行扩增片段的克隆和测序。结果表明，EMCV-GXLC株基因组全长7 725 nt，编码区为6 879 nt，编码2 292个aa，将该株全基因组上传NCBI，GenBank登录号：FJ897755。应用分子生物学软件对EMCV-GXLC全基因组核

5、苷酸及推导氨基酸序列进行了序列比对和同源性分析。全基因组比对结果表明，分离株与来源于广西的FJ604852、FJ604853，北京的DQ464062，河北的DQ464063，韩国的DQ517424、EU780148、EU780149等猪源EMCV分离株的同源性较高，达99.5%以上。各个片段推导的氨基酸同源性分析显示，非结构蛋白比结构蛋白保守；在非结构蛋白中，3D蛋白最为保守，2A相对变异较大，预示EMCV的诊断引物可以基于3D基因；在结构蛋白中，VP2蛋白相对保守，VP1蛋白同源性最低、变异性较大，适合用于分子流行病学的调查。VP1蛋白有两个潜在的N-糖基化基序，分别为N29QT和N62QT

6、，VP1是表位最多的区域，预测有9个可能的表位；VP2和VP3共有6个潜在的N-糖基化位点。3-UTR和5-UTR二级结构分析显示，FJ897755与来源于韩国的DQ517424相似度最高。进化树分析显示，结构蛋白与全基因序列的系统发育进化树相近，且不同结构蛋白基因序列之间的系统发育进化树结构也类似，在分析EMCV分离株的进化关系时，可以使用VP3/VP1基因来绘制系统发育进化树。关键词：猪脑心肌炎病毒；荧光定量PCR；分离；测序；全基因组；进化分析ISOLATION AND GENOMIC SEQUENCE ANALYSIS OF PORCINE ENCEPHALOMYOCARDITIS V

7、IRUS GUANGXI STRAIN英文摘要Encephalomyocarditis virus (EMCV) is a member of the genus Cardiovirus of the family Picornaviridae, it is clinically characterized by encephalitis, myocarditis or inflammation around cardiac muscles.A pair of primers was designed according to the sequence of the VP1 gene of E

8、MCV and a real-time PCR assay based on SYBR Green for detection of EMCV was established. The assay had a good linear relationship between initial templates and Ct values, and the correlation coefficient of the standard curve was 0.991. Also, it was highly sensitive and had a detection limit of 1101

9、copies/L of initial templates, which was 100 times more sensitive than the conventional PCR. Moreover, it was highly specific and had no cross-reaction with other porcine viruses. Finally, it was highly reproducible and had a coefficient of variations less than 3 percent for both intra- and inter-as

10、say. One EMCV strain was isolated from the clinical tissue samples orignated from pig farms in Guangxi by using BHK-21 cells. This isolate was designated EMCV-GXLC（GenBank accession No. FJ897755），and identified using IFA. The virus particles with diameter of 27 nm were observed by immune electron mi

11、croscopy (IEM). Five pairs of primers were designed and five overlapping cDNA fragments covering the complete open reading frame (ORF) within BJC3 and HB1 were amplified using RT-PCR. The 5-rapid amplification of cDNA ends (RACE) and 3-RACE were employed to amplify the 5-untranslated region (UTR) an

12、d 3-UTR of the RNA of the viruses. The sequences of RT-PCR-generated cDNA fragments from EMCV-GXLC viruses were assembled. The complete genomes of EMCV-GXLC consisted of 7 725 nucleotides, and possessed a large ORF with a size of 2 292 amino acids. The homology of the genomic nucleotide sequences an

13、d the predicted amino acids were aligned and analyzed among EMCV-GXLC and other EMCV strains available in GenBank. The results showed thatKEY WORDS: encephalomyocarditis virus (EMCV)；real-time PCR；isolation； sequence；genome；phylogenetic analysis目录中文摘要 I英文摘要 II目录 III插图和附表 VI插图清单 VI附表清单 VII缩略词表 VIII1.

14、 文献综述 11.1 EMCV基因组结构 11.1.1 EMCV衣壳蛋白及其功能 21.1.2 EMCV非结构蛋白P2和P3 31.1.3 EMCV 5-UTR结构与功能 31.1.4 EMCV 3-UTR 51.2 EMCV诊断技术 51.2.1 病毒分离 51.2.2 抗体检测方法 51.2.3 抗原检测方法 61.3 EMCV的流行情况及流行特点 61.3.1 流行情况 61.3.2 流行特点 71.4 EMCV的公共卫生学意义 81.5 研究内容与技术路线 91.5.1 研究内容 91.5.2 技术路线 102. 猪脑心肌炎病毒SYBR Green I real-time PCR检测方

15、法的建立 错误！未定义书签。2.1 材料与方法 错误！未定义书签。2.1.1 病毒与引物 错误！未定义书签。2.1.2 主要试剂 错误！未定义书签。2.1.3 试验用溶液配制 错误！未定义书签。2.1.4 主要仪器设备 错误！未定义书签。2.2 方法 错误！未定义书签。2.2.1 质粒标准品的制备 错误！未定义书签。2.2.2 Real-time PCR反应条件的优化 错误！未定义书签。2.2.3 Real-time PCR标准曲线的制作 错误！未定义书签。2.2.4 Real-time PCR的敏感性试验 错误！未定义书签。2.2.5 Real-time PCR的特异性试验 错误！未定义书签

16、。2.2.6 Real-time PCR的重复性试验 错误！未定义书签。2.2.7 Real-time PCR的初步应用 错误！未定义书签。2.3 结果与分析 错误！未定义书签。2.3.1 质粒标准品的制备 错误！未定义书签。2.3.2 Real-time PCR反应条件的优化 错误！未定义书签。2.3.3 Real-time PCR标准曲线的制作 错误！未定义书签。2.3.4 Real-time PCR的敏感性试验 错误！未定义书签。2.3.5 Real-time PCR的特异性试验 错误！未定义书签。2.3.6 Real-time PCR的重复性试验 错误！未定义书签。2.3.7 Real

17、-time PCR的初步应用 错误！未定义书签。2.4 讨论 错误！未定义书签。2.4.1 荧光定量PCR检测方法的建立 错误！未定义书签。2.4.2 荧光定量PCR反应特点 错误！未定义书签。2.4.3 影响荧光定量PCR反应的因素 错误！未定义书签。2.4.4 荧光定量PCR反应的优缺点 错误！未定义书签。2.5 小结 错误！未定义书签。3. 猪脑心肌炎病毒广西株的分离及其全基因组序列测定 错误！未定义书签。3.1 材料 错误！未定义书签。3.1.1 病料收集 错误！未定义书签。3.1.2 主要试剂 错误！未定义书签。3.1.3 试验用溶液配制 错误！未定义书签。3.1.4 主要仪器设备

18、错误！未定义书签。3.2 方法 错误！未定义书签。3.2.1 病毒的分离 错误！未定义书签。3.2.2 病毒的RT-PCR鉴定 错误！未定义书签。3.2.3 EMCV-GXLC株间接免疫荧光抗体试验（IFA） 错误！未定义书签。3.2.4 EMCV-GXLC株TCID50的测定 错误！未定义书签。3.2.5 分离株的全基因组扩增、克隆与测序 错误！未定义书签。3.3 结果与分析 错误！未定义书签。3.3.1 EMCV病毒的分离 错误！未定义书签。3.3.2 EMCV-GXLC株的RT-PCR鉴定 错误！未定义书签。3.3.3 EMCV-GXLC株间接免疫荧光抗体试验（IFA） 错误！未定义书签

19、。3.3.4 EMCV-GXLC株TCID50的测定 错误！未定义书签。3.3.5 EMCV-GXLC株基因片断的RT-PCR扩增结果 错误！未定义书签。3.3.6 EMCV-GXLC株各个基因片段的克隆、测序及序列拼接 错误！未定义书签。3.4 讨论 错误！未定义书签。3.4.1 关于EMCV的分离 错误！未定义书签。3.4.2 关于EMCV的鉴定 错误！未定义书签。3.4.3 关于EMCV-GXLC株全基因的扩增 错误！未定义书签。3.5 小结 错误！未定义书签。4. 猪脑心肌炎病毒广西株(EMCV-GXLC)全基因组分子特征分析 错误！未定义书签。4.1 材料 错误！未定义书签。4.1.

20、1 本研究所用EMCV分离株信息 错误！未定义书签。4.1.2 分子生物学分析软件 错误！未定义书签。4.2 方法 错误！未定义书签。4.2.1 基因组结构分析 错误！未定义书签。4.2.2 序列比对 错误！未定义书签。4.2.3 结构蛋白基本特征、表位预测及二级结构 错误！未定义书签。4.2.4 系统进化分析 错误！未定义书签。4.3 结果与分析 错误！未定义书签。4.3.1 EMCV-GXLC株的基因组组成和结构分析 错误！未定义书签。4.3.2 EMCV各基因片段同源性分析 错误！未定义书签。4.3.3 EMCV多聚蛋白各基因片段连接处氨基酸分析 错误！未定义书签。4.3.4 EMCV-

21、GXLC株 VP1分子特征 错误！未定义书签。4.3.5 EMCV-GXLC株 VP2、VP3分子特征 错误！未定义书签。4.3.6 EMCV-GXLC株 5-UTR二级结构预测 错误！未定义书签。4.3.7 EMCV-GXLC株 3-UTR二级结构预测 错误！未定义书签。4.3.8 EMCV系统发育进化树绘制 错误！未定义书签。4.4 讨论 错误！未定义书签。4.4.1 EMCV-GXLC株基因组序列比较 错误！未定义书签。4.4.2 EMCV-GXLC株的变异特点 错误！未定义书签。4.4.3 EMCV-GXLC株VP1的抗原性 错误！未定义书签。4.4.4 病毒基因组的系统发育进化关系

22、错误！未定义书签。4.5 小结 错误！未定义书签。5. 结论 11附录 12附录1：SYBR Green I real-time PCR用重组质粒测序结果 12附录2：SYBR Green I real-time PCR重复性试验数据 12附录3：EMCV-GXLC株第1 5代细胞毒TCID50测定结果 56附录4：EMCV-GXLC株全基因组序列 58致谢 63攻读学位期间发表论文情况 64申明 65参考文献 66插图和附表插图清单图1- 1 EMCV 基因组结构和多聚蛋白裂解图 2Fig. 1-1 Organization and polyprotein of the genome of

23、EMCV 2图1-2 近年来EMCV全球流行情况 7Fig. 1-2 The recent global epidemic of EMCV 7图21 PCR扩增产物 错误！未定义书签。Fig. 2-1 Product of PCR 错误！未定义书签。M. DNA Marker DL2 000；1. PCR产物 错误！未定义书签。M. DNA Marker DL2 000；1. PCR product 错误！未定义书签。图22重组质粒鉴定 错误！未定义书签。Fig. 2-2 Identification of the recombinant plasmid 错误！未定义书签。图23 SYBR G

24、reen I real-time PCR的扩增曲线(A)、熔解曲线(B) 错误！未定义书签。Fig. 2-3 Dynamic curve(A) and melting curve(B) of SYBR Green I real-time PCR 错误！未定义书签。图24 SYBR Green I real-time PCR的标准曲线 错误！未定义书签。Fig. 2-4 Standard curve of SYBR Green I real-time PCR 错误！未定义书签。图25 SYBR Green I real-time PCR特异性试验 错误！未定义书签。Fig. 2-5 Specif

25、icity assay of SYBR Green I real-time PCR 错误！未定义书签。图31 EMCV在BHK-21细胞上产生的细胞病变 错误！未定义书签。Fig. 3-1 CPE of EMCV in BHK-21 cells 错误！未定义书签。图32 EMCV-GXLC株3D基因片段的RT-PCR鉴定 错误！未定义书签。Fig. 3-2 Identification of 3D gene of EMCV-GXLC strain 错误！未定义书签。图33 EMCV-GXLC株的间接免疫荧光抗体试验鉴定结果 错误！未定义书签。Fig. 3-3 IFA identificatio

26、n of EMCV-GXLC strain in BHK-21 cells 错误！未定义书签。图34 EMCV-GXLC株基因组各片段扩增结果 错误！未定义书签。Fig. 3-5 The amplified fragments the genome of EMCV-GXLC strain by RT-PCR 错误！未定义书签。图41 EMCV-GXLC株的序列信息 错误！未定义书签。Fig. 4-1 Sequence information about EMCV-GXLC strain 错误！未定义书签。图42 EMCV-GXLC株基因组组成简图 错误！未定义书签。Fig. 4-2 The g

27、enome organization diagram of EMCV-GXLC strain 错误！未定义书签。图43 EMCV-GXLC株与EMCV参考毒株VP1蛋白氨基酸序列比对 错误！未定义书签。Fig. 4-3 Alignment of the predicted amino acid sequences for VP1 of EMCV 错误！未定义书签。图44 EMCV-GXLC株 VP1蛋白特性预测 错误！未定义书签。Fig.4-4 Prediction on antigen sites and some characters of VP1 protein of EMCV-GXLC

28、 strain 错误！未定义书签。图45 EMCV-GXLC株 VP2和VP3氨基酸序列 错误！未定义书签。Fig. 4-5 Predicted amino acid sequences of VP2 protein and VP3 protein of EMCV-GXLC strain 错误！未定义书签。图46 EMCV-GXLC株 VP2蛋白特性预测 错误！未定义书签。Fig. 4-6 Prediction on antigen sites and some characters of VP2 protein of EMCV-GXLC strain 错误！未定义书签。图47 EMCV-GX

29、LC株 VP3蛋白特性预测 错误！未定义书签。Fig. 4-7 Prediction on antigen sites and some characters of VP3 protein of EMCV-GXLC strain 错误！未定义书签。图48 EMCV-GXLC株与部分EMCV参考株的5-UTR二级结构预测 错误！未定义书签。Fig. 4-8 Prediction of the 5-UTR secondary structure of EMCV-GXLC strain and reference EMCV 错误！未定义书签。图49 部分EMCV分离株的ploy（C）结构域基因片段比

30、对结果 错误！未定义书签。Fig. 4-9 Alignment of the nucleotide sequences for ploy(C) of EMCV 错误！未定义书签。图410 EMCV-GXLC株与部分EMCV参考株的3 -UTR二级结构预测 错误！未定义书签。Fig. 4-10 Prediction of the 3-UTR secondary structure of EMCV-GXLC strain and reference EMCV 错误！未定义书签。图411 EMCV 全基因组、ORF核苷酸序列系统发育进化树 错误！未定义书签。Fig. 4-11 Phylogeneti

31、c trees derived from EMCV complete genome and ORF nucleotide sequences 错误！未定义书签。图412 EMCV CCR、VP3/VP1、VP2和VP1核苷酸序列绘制的系统发育进化树 错误！未定义书签。Fig. 4-12 Phylogenetic trees derived from four EMCV datasets，i.e. CCR，VP3/VP1，VP2 and VP1 nucleotide sequences 错误！未定义书签。图413 EMCV P2、P3、2A、3D核苷酸序列绘制的系统发育进化树 错误！未定义书签。Fig. 4-13 Phylogenetic trees derived from four EMCV datasets，i.e. P2，P3，2A and 3D nucleotide sequences 错误！未定义书签。图414 EMCV 3-UTR、5-UTR核苷酸序列绘制的系统发育进化树 错误！未定义书签。Fig. 4-14 Phylogenetic trees derived from EMCV 3-UTR and