食品酶学第36章课件内容.docx
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食品酶学第36章课件内容
第三章酶的生产、分离和纯化
酶来自生物体，包括动物、植物和微生物。
酶的生产：
经过预先设计，通过人工操作控制而获得所需要酶的过程。
酶生产的方法：
1、提取
2、化学合成
3、发酵法
第一节酶的发酵生产
50年代后期酶生产的主要方法，指利用动植物细胞或微生物细胞，主要是微生物细胞的生命活动而获得人们所需要的酶的过程，称为酶的发酵生产。
1894年，日本人高峰让吉首次用米曲霉固体发酵生产淀粉酶作为消化剂。
1917年，Boidin与Effront以枯草杆菌生产淀粉酶用于织物退浆。
1947年，日本开始采用液体深层发酵生产a-淀粉酶。
利用微生物发酵方法制取酶的优点是：
1）微生物种类繁多，酶种丰富，且菌株易诱变，菌种多样；
2）微生物生长繁殖快，发酵周期短，易提取酶，特别是胞外酶；
3）微生物培养简单，培养基来源广泛，价格便宜。
4）可采用微电脑等技术控制酶发酵生产过程，生产可连续化、自动化，经济效益高。
5）可利用以基因工程为主的现代分子生物学技术，选育新菌种、增加酶产率和开发新酶种。
1、产酶菌的获得
1）生产菌的要求
◆安全可靠，不是致病菌，在系统发生上与病原体无关，也不产生毒素。
FDA（FoodandDrugAdministration）鉴定、审核后认为可用于食品工业和医药工业的生产菌有：
枯草杆菌（Bac.subtilis）、黑曲霉（Asp.niger）、米曲霉（Asp.oryzae）、啤酒酵母（Sac.cereusia）、脆壁酵母（Sac.fragieis）。
◆不易变异退化、不易感染噬菌体，产酶稳定性好。
◆产酶量高，酶的性质符合应用需要，最好是产胞外酶的菌株。
◆能利用廉价原料，发酵周期短，容易培养。
产酶菌可从菌种保存机构如ATCC（AmericanTypeCultureCollection）和有关研究机构获得；一般都是通过筛选（screening）得到。
筛选包括以下环节：
菌样采集，菌种分离、纯化和生产性能鉴定。
2）常见的产酶微生物
细菌：
枯草杆菌淀粉酶制糖、脱浆
大肠杆菌青霉素酰化酶制备青霉素母核
异型乳酸杆菌葡萄糖异构酶制果糖
短小芽孢杆菌碱性蛋白酶皮革脱毛
酵母：
假丝酵母脂肪酶、尿酸酶等乳品增香、绢丝脱脂等
啤酒酵母用于酿造啤酒、饮料酒和酒精等
霉菌：
黑曲霉酸性蛋白酶啤酒澄清、医药
红曲霉葡萄糖淀粉酶制葡萄糖
米曲霉糖化酶和蛋白酶制果糖
青霉葡萄糖氧化酶、苯氧甲基青霉素酶、果胶酶等
木霉纤维素酶
根霉淀粉酶、酸性蛋白酶、脂肪酶、纤维素酶等
毛霉蛋白酶、糖化酶、果胶酶、凝乳酶等
3）菌样采集
相近菌种产生的酶在性质上一般相近或相似。
胞外酶的稳定性和最适反应条件通常和菌的最适生长条件一致；但胞内酶的热稳定性通常比菌的最适生长温度稍低。
为获得能够降解某种物质的产酶菌株，一般可从该物质比较丰富的地方寻找。
4）菌种分离、纯化和生产性能的鉴定
产酶菌可采用平板划线法或直接稀释法分离纯化。
初筛多采用平板透明圈法。
如筛选水解酶的生产菌，可以该酶的底物作为平板培养基的主要碳源或氮源，这样如果菌株包含所需要的酶，经过一段时间的培养后，就会在菌落的周围形成一透明的水解圈（clearingorlysiszone），从透明圈的大小可大致判断出菌株的产酶能力。
5）产酶菌的筛选：
主要依靠其催化的反应的性质、底物和产物的特异性等进行设计。
胞外酶筛选：
使待检测的微生物在含有酶作用的不溶性底物如淀粉、纤维素、酪素、细胞壁等作为培养基中生长，培养后，根据菌落周围产生的透明圈的大小可以晒选到产淀粉酶、纤维素酶、蛋白酶和溶菌酶的高活性菌株。
（平板透明圈法）
根据催化反应的产物的酸碱性，在培养基中加入底物和酸碱指示剂，培养后，依据产生酸或碱，依据菌落周围变色圈的大小和颜色深浅进行判断，从而进行产目标酶菌株的晒选。
设计特定的底物，使其在酶的作用下产生产物，产物遇底物有颜色的变化，菌落周围产生色圈，则可筛选到产酶的菌株。
胞内酶筛选：
对于酶作用的底物分子质量较小，能透过细胞膜在细胞内发生反应，可以将其加在培养基中，根据菌落的颜色进行筛选。
对于大多数的胞内酶，是采用培养细胞或细胞破碎物作酶源，经酶反应后，根据酶反应产物的特点，利用产物对紫外的吸收，如辅酶NAD，直接用紫外分光光度法测定；或通过产物的显色反应等。
2.产酶菌的保存和培养
1）菌种的保存
防止污染，尽量减少转移次数；避免对种子培养基进行长时间高热灭菌，以防对种子产生不良影响。
菌种保存的基本原理：
通过采用低温、干燥与缺氧的条件，以中止菌种的繁殖，降低其新陈代谢，使之处于休眠状态。
菌种保存的方法很多，常用的为斜面低温保存法，液体石蜡保存法等。
有条件的还可采用冷冻真空干燥保存法。
2）菌种的活化和扩大培养
将保藏状态的菌种放入适宜的培养基中培养，逐级扩大培养以恢复菌种的活力，这就叫菌种活化。
为了发酵时有足够的菌种，活化了的菌种一般要经过一级至数级的扩大培养。
3）培养方法
固体培养。
又称表面培养（surfaceculture）、曲式培养，即以麸皮、米糠等为基本原料，再加入适量的无机盐和水分（通常50%左右）作为培养基进行的一种培养方式。
设备简单，便于推广，特别适于霉菌类的培养，因为菌丝体在这种培养基中能较好地伸展、生长，产酶率高。
如曲霉和毛霉生产淀粉酶和蛋白酶，青霉和曲霉生产果胶酶，木霉生产纤维素酶；
缺点是：
物料利用不完全，劳动量大，易染菌，而且不适于胞内酶的生产
液体培养。
又称浸没式培养（submergedculture），采用液体培养基，在发酵罐内进行的一种搅拌通气式培养，是目前酶制剂和其它发酵产品的主要培养方式。
液体发酵需要一定的设备和技术条件，动力消耗也较大，但原料利用率和产量都较高，而且培养条件容易控制。
3）培养条件
培养基的组成：
◆碳源。
不宜使用葡萄糖等易被利用的碳源为培养基，也不宜提供太丰富的碳源营养。
某些碳源是酶的诱导物，定向地促进某些酶地合成，如淀粉可诱导淀粉酶的合成。
◆氮源。
氮源是菌体蛋白质和核酸的原料。
各种微生物对氮源的利用情况相当复杂，有的喜欢无机氮，有的喜欢有机氮，氮源的性质，使用的浓度都能对菌的生长和酶的形成带来不同程度的影响。
◆碳氮比。
在某些情况下，对菌的生长和产酶也有直接关系。
◆无机盐。
这些离子直接参与细胞物质的组成，或者作为酶的活性组成部分与活化剂发挥作用。
◆生长因子。
一些微量有机物质，主要是B族维生素。
它们对微生物的代谢起调节作用，有时作为辅酶的构成部分，影响酶的活性。
在玉米浆、酵母膏和麦芽浸液等天然物质中通常含有这些生长因子，不需要另外添加。
◆产酶促进剂。
指在培养基中添加某种少量物质,能显著提高酶的产率,这类物质称为产酶促进剂。
通常有两种:
一种是诱导物，可以是底物、产物或底物类似物。
如纤维二糖诱导纤维素酶。
另一种是表面活性剂，如吐温-80的浓度为0.1%时能增加许多酶的产量,增加细胞的通透性，改善氧的传递速度,还可保护酶的活性
影响菌种产酶的因素：
◆培养温度。
产酶菌生长繁殖和产酶的最适温度往往不一致。
培养温度也可能直接影响酶合成后的稳定性，特别是酶的耐热性。
如：
55℃下培养形成的α-淀粉酶的热稳定性比35℃培养的高许多。
◆pH。
培养基的酸碱度对产酶影响很大。
相当多的水解酶，产酶的最适pH与酶作用的最适pH相近；有些水解酶和氧化酶则相距甚远。
很多微生物能同时产生几种相关的酶，改变培养基的pH，可能影响到各种酶的合成比例。
◆通气量。
大多数产酶菌是好气菌，因此调节通气量对提高酶产量往往有直接意义。
采用液体深层发酵时，较小的通气量有利于霉菌的孢子萌发和菌体生长。
而较大的通气量则常可促进酶的形成。
固体发酵时，菌体生长通常要求通以空气，而较小的通气量却能显著提高酶的产量。
◆湿度。
对于固体发酵比较重要，它直接影响产酶率，也与产酶达到高峰的时间有关。
第二节提高酶发酵产量的方法
1、酶的合成调控机制
酶和其它蛋白质一样，它的合成可在复制（replication）、转录（transcription）和翻译（translation）等各种水平上进行调节控制。
原核生物的转录调节机制现在普遍接受的是操纵子模型。
这是通过调节酶的合成来调控。
另外可通过抑制酶的活性来调控。
细胞所生产的物质的合成有两个负的调节系统，即通过抑制酶的活性和阻遏酶的合成来调节。
1）诱导酶合成的调节（添加诱导物提高酶产量）
适用于可诱导的酶类，食品工业应用的酶如淀粉酶、蛋白酶、纤维素酶、葡萄糖异构酶、乳糖酶等均属于诱导酶。
在酶合成时最好的诱导物为该酶的作用底物或其结构类似物。
加入诱导物后，通常要经过一个极短暂的潜伏期（例如几分钟），诱导才会出现，除去诱导物后，诱导立即停止。
2）酶合成的反馈阻遏（通过降低阻遏物浓度提高酶产量）
反馈阻遏是指酶作用的终产物对酶合成产生的阻遏作用，引起反馈阻遏的终产物往往是小分子物质，也称为共阻遏物。
调节基因产生立体阻遏物，当终产物或共阻遏物存在时，两者相互结合并与操纵基因结合，RNA聚合酶不起作用，使操纵基因关闭，酶合成受到反馈抑制。
若解除阻遏物即无终产物,RNA聚合酶起作用，使操纵基因开启，酶合成继续.
3）分解代谢对酶合成的阻遏作用
分解代谢阻遏作用（或称为葡萄糖效应）是指培养基中由于葡糖糖的存在微生物虽然能迅速生长，但明显抑某些分解代谢诱导酶的形成。
葡萄糖的存在影响细胞内环腺苷酸（cAMP）的产生，cAMP是启动RNA聚合酶作用中不可缺少的辅助因子，cAMP的缺少导致对分解代谢的酶形成阻遏作用。
4）酶合成的细胞膜透性调节
调节胞外酶的分泌
主动运输的调节（透性酶或表面酶）
间隔作用调节（酶的催化速率受到亚细胞器结构的影响）
2、通过发酵条件的控制提高酶产量
菌种产酶性能是决定发酵效果的重要条件。
为了提高酶产量，需对发酵过程的参数进行优化。
（1）通过控制pH来提高酶产量
（2）通过控制温度来提高酶产量
（3）通过中间补料提高酶产量
（4）通过溶解氧来提高酶产量
溶氧速率的调节方法：
◆调节通气量
◆调节氧分压
◆调节气液接触时间和面积
3、通过基因突变提高酶产量
基因突变（genemutation）可发生在结构基因上，也可发生在操纵子其它部位上。
前者往往导致酶的结构和性质改变，而后者则通常引起酶产量升高或降低。
基因突变可自发地发生，即自然育种，但机率很小，故在实际工作中需采用某些方法进行诱变，即诱变育种：
物理方法：
紫外线、γ-射线（Co-60）及快中子辐射等。
直接引起核酸分子中四种脱氧核苷酸，特别是C、T发生变化，造成DNA损伤和畸变。
化学方法：
5-溴尿嘧啶等，通过代谢渗入到DNA中引起突变；亚硝胍等，直接和DNA中地A、C、G等反应而导致异变；口丫啶黄染料等，能引起DNA链中核苷酸的插入或缺失而造成移码突变。
生物诱变剂：
噬菌体
用来进行诱变的出发菌株选择时应注意以下几点：
（1）有一定的目标产物的生产能力
（2）对诱变剂敏感的菌株变异幅度大
（3）生产性能好的菌株
（4）可选择已经诱变后的菌株
筛选的目的
（1）高产菌株的筛选
（2）抗分解代谢阻遏突变株的筛选
（3）无孢子突变株的筛选
（4）药物抗性突变株的筛选
4、通过基因重组提高酶产量
体内基因重组（generecombination），包括通过接合、转导、转化等方法进行的少数或者个别基因的重组；也包括通过原生质融合进行的整个染色体的重组。
如：
质粒（plasmid）整合、噬菌体转导（phagetransduction）、转化、原生质融合（protoplastfusion）。
体外基因重组（generecombinationinvitro），简称DNA重组技术（recombinatantDNAtechnique），或基因工程（geneengineering）。
它是利用酶学方法将外源基因与载体DNA在体外进行重组，然后将形成的重组子转化到受体细胞，使所需要的外源基因在受体细胞中复制表达，从而达到改造生物遗传特性目的的一种技术与方法。
5、其他提高酶产量的方法（改变碳氮比，添加产酶促进剂等）
添加表面活性剂。
表面活性剂，特别对胞外酶来说，可能因为能增大细胞膜的通透性，从而提高酶产量。
常用的表面活性剂有:
Tween80、TritonX-100（聚氧乙烯异辛基苯基醚）、油酸等。
或是酶的诱导物。
食品常用酶发酵生产举例：
α-淀粉酶的生产枯草杆菌
糖化酶的生产黑曲霉
蛋白酶的生产
脂肪酶的生产假丝酵母
果胶酶的生产臭曲霉固态法
第三节酶的分离纯化方法
酶分离纯化的基本原则：
1）防止酶失活（denaturation-deactivation），操作必须在低温下进行，避免过酸过碱，重金属能使酶失效，有机溶剂能使酶变性，微生物污染以及蛋白质水解酶的存在能使酶分解破坏；
2）选择有效的纯化方法；
3）酶活力测定贯穿纯化过程的始终
1.酶的抽提
1）预处理与细胞破碎
提取酶前，通常对原材料进行适当的预处理（pretreatmention）。
例如：
动物材料要先剔除结缔组织、脂肪组织；油质种子最好先用乙醚等脱脂；种子研磨前应去壳；微生物材料应将菌体和发酵介质分离；部分酚类物质含量高的材料如茶鲜叶在细胞破碎的同时应避免多酚吸附蛋白质。
动植物材料先要进行细胞破碎（celldisruption），一般采用匀浆器（homogenizer）或加砂研磨。
许多材料研磨后可先制成丙酮粉（acetonepowder）。
材料粉碎后，低温下加入5~10倍预冷的丙酮，搅拌均匀后过滤，低温干燥。
丙酮处理一方面能有效地破坏细胞壁（膜），有利于除去大量脂质，使某些与膜结合的酶易于溶解，此外丙酮粉含水量低，便于保存。
但有些酶不能采用此法。
细胞破碎的方法：
（1）机械（匀浆）法
（2）超声波法
（3）冻融法
（4）渗透压法
（5）酶消化法
（6）化学破碎法（有机溶剂处理和表面活性剂处理riton、Tween）
2）抽提方法
大多数酶属于球蛋白类，一般都溶于稀盐、稀酸或稀碱的水溶液。
抽提液的选择要考虑酶的溶解性、稳定性以及如何最有利于切断酶和其他物质的联系。
选择的pH不能超出酶的稳定范围，远离目的酶的等电点。
大多数蛋白质在低浓度的盐溶液中有较大的溶解度，所以一般采用等渗盐溶液。
抽提温度多控制在0-4℃左右。
根据酶抽提时采用的溶剂或溶液的不同,酶的提取方法有以下几种:
（1）盐溶液提取
（2）酸溶液提取
（3）碱溶液提取
（4）有机溶剂提取
（1）盐溶液提取
大多数酶溶于水,而且在一定浓度的盐存在的条件下,酶的溶解度增加,这称之为盐溶现象,但是盐浓度不能太高,否则溶解度反而降低,出现盐析现象。
一般采用稀盐溶液进行酶的提取，盐浓度一般控制在0.02~0.5mol/L的范围内。
（2）酸溶液提取
有些酶在酸性条件下溶解度较大而且稳定性好，这种酶宜用酸溶液提取。
（3）碱溶液提取
有些酶在碱性条件下溶解度较大且稳定性较好，应采用碱溶液提取。
（4）有机溶剂提取
有些与脂质结合比较牢固或分子中含非极性基团较多的酶,不溶或难溶于水、稀酸、稀碱和稀盐溶液中，需用有机溶剂提取。
常用的有机溶剂是与水能够混溶的乙醇、丙酮、丁醇等。
3）浓缩
浓缩（concentration）一方面减少纯化操作容积，同时酶的稳定性也能提高。
工业上可用真空减压浓缩、薄膜浓缩、冷冻浓缩和逆向渗透作用进行浓缩。
对于少量酶液下述方法浓缩更合适：
超过滤浓缩（ultrafiltration）；凝胶浓缩；聚乙二醇浓缩法。
2.酶的纯化原理与方法
1）根据溶解度的不同，有盐析法、有机溶剂沉淀法、共沉淀法及选择性沉淀法和等电点沉淀法等。
2）根据分子大小的差别，有凝胶过滤（层析）法、筛膜分离法和离心法等。
3）根据分子的解离性质和所带正负电荷的种类及量的不同，有吸附（层析）法、离子交换层析法、电泳法以及聚焦层析法。
4）基于酶和底物、辅助因子以及抑制剂间具有专一亲和作用的特点而建立的各种亲和分离法等。
5）利用稳定性差别而建立的的分离方法有选择性热变性法、酸碱变性法和表面变性法等。
6）色谱法。
7）结晶。
在酶蛋白质提纯过程中，当酶的纯度达到一定浓度就可以进行酶蛋白质的结晶。
现在，对蛋白质结晶的兴趣主要在于制备适合于X-射线衍射研究、中子衍射研究的晶体。
适用于这种研究的单晶（最小晶体），其线性大小至少在0.2毫米以上。
要培养出这样的单晶，必须寻找适宜的结晶条件。
常用的分离方法
（1）沉淀法:
盐析法、等电点沉淀法、有机溶剂沉淀法、非离子型聚合物沉淀法、聚电解质沉淀法和高价离子沉淀法等。
（2）凝胶过滤
（3）亲和层析
（4）染料层析
（5）疏水层析
（6）电泳法
（1）沉淀法
沉淀法是最古老的分离和纯化生物物质的方法。
但目前仍然广泛应用在工业上和实验室中。
沉淀法由于成本底、收率高，因而通常作为初步分离的一种手段。
根据所加入的沉淀剂的不同,沉淀法又分为:
盐析法、等电点沉淀法、有机溶剂沉淀法、非离子型聚合物（PEG）沉淀法、聚电解质沉淀法和高价离子沉淀法等。
（2）凝胶过滤（gelfiltrationchromatography）
凝胶过滤又称凝胶层析、凝胶排阻层析、分子筛层析等，它是根据溶质分子的大小进行分离的方法。
在酶纯化中占有重要位置。
优点：
操作方便、物质不变性、可反复使用等。
应用：
脱盐、生物大分子按分子的大小分级分离以及分子量的测定。
凝胶的种类
1、葡聚糖凝胶白色粉末,不溶于水和盐溶液,因具有大量羟基,亲水性大,在水中即显膨胀,它对弱酸和弱碱稳定,其商品名是SephadexG-X。
G-后的数字表示每克干胶吸水量的10倍。
2、聚丙烯酰胺凝胶以丙烯酰胺为单体，通过交联剂共聚而成的凝胶物质，其商品名是Bio-GelP-X，P-后的数字乘以1000表示其分离的最大分子量。
3、琼脂糖凝胶琼脂糖是琼脂抽去琼脂胶之后所得半乳糖自动缔合而成的网眼结构物质,孔径大小由胶的浓度决定。
有商品Sepharose2B、4B、6B等规格,SepharoseCL,Bio-GelA。
凝胶层析的操作
1.凝胶的选择
2.装柱
3.加样
4.洗脱
5.凝胶的再生和保养
（4）染料层析：
用染料做亲和配基，这些染料结构中都含有三嗪环。
（5）疏水层析：
将疏水性基团固定到介质上，这些基团与蛋白质生物大分子上的疏水区亲和。
同一疏水基团对不同蛋白质的亲和力存在差异，从而达到分离的效果。
（6）电泳法:
是靠溶质在电场中移动速度不同而分离的方法。
在电泳中，常伴有电渗现象。
在电场中，液体相对于一个固定固体的相对移动，称为电渗。
3.酶分离、纯化的评价
酶纯化收支表
步骤酶活力蛋白浓度总体积总活力总蛋白比活力产量纯化倍数
（U/ml）（mg/ml）（ml）（U）（mg）（U/mg）（%）
一般用电泳法检测酶的纯度，最终的纯度标准，当然是唯一的氨基酸顺序，但很少用它来鉴定纯度。
SOD酶纯化过程
新鲜动物血分离红血球生理盐水洗涤
破裂红细胞有机溶剂萃取沉淀热变形盐析过离子交换树脂柱透析冷冻干燥酶制剂
4.酶分子量的测定
一般采用超离心沉降速度、凝胶层析和聚丙烯酰胺凝胶电泳方法和基质辅助激光解吸附电离飞行时间质谱法（MALDI-TOF）测定酶的分子量。
5.酶的剂型与保存
酶制剂常以四种剂型供应：
◆液体酶制剂。
在除去菌体后不再纯化而直接制成或加以浓缩，比较经济，但不稳定，而且成分复杂。
◆固体酶制剂。
发酵液经过杀菌后直接浓缩干燥制成，有的则加有淀粉等填充料。
◆纯酶制剂。
包括结晶酶在内，通常用作分析试剂或用作医疗药物，要求有较高的纯度。
◆固定化酶制剂。
是借助物理方法或化学方法将酶固定于水不溶性或者水溶性载体而制成的一种酶制剂形式。
影响酶保存期的因素
（1）温度:
在低温条件下（0~4℃）使用、处理和保存。
（2）pH值:
pH应在酶的pH稳定范围内，采用缓冲液保存。
（3）酶蛋白的浓度:
一般酶浓度高较稳定,低浓度时易于解离、吸附或表面发生变性失效。
（4）氧:
有些酶易于氧化而失活。
（5）为提高酶的稳定性常加入稳定剂。
（底物、抑制剂和辅酶；对巯基有保护作用的保护剂；Ca2+保护淀粉酶；Mn2+保护溶菌酶）
共价调节酶
共价调节酶（covalentregulatoryenzyme）是一类由其它酶对其结构进行可逆共价修饰，使其处于活性和非活性的互变状态，从而调节酶活性。
共价调节酶一般都存在相对无活性和有活性两种形式，两种形式之间互变的正、逆向反应由不同的酶催化。
磷酸化是可逆共价修饰中最常见的类型。
蛋白激酶的调节作用能被催化水解磷酸基团的蛋白质磷酸酶逆转。
通过磷酸化和脱磷酸化作用，使酶在活性形式和非活性形式之间互变。
此外还有腺苷酸化/脱腺苷酸化、甲基化/脱甲基化，乙酰基化/脱乙酰基化等。
抗体酶（Abzyme）
具催化能力的免疫球蛋白称为抗体酶或催化抗体。
通过改变抗体中与抗原结合的微环境，并在适当的部位引入相应的催化基团，所产生的具有催化活性的抗体。
由两种途径获得抗体酶：
①采用过渡态的底物类似物诱导；②在现有的抗体基础上，通过化学修饰或通过蛋白质工程向其配体结合部位导入催化基团。
1986年——Pollack,S.J.等人报道了具有催化活性的抗体，被认为抗体酶。
抗体酶具有典型的酶反应特性；抗体酶还具有与天然酶相近的米氏方程动力学及pH依赖性等。
第四章酶的稳定性和固定化
第一节酶的稳定性的分子原因
酶的稳定性是指酶抵抗各种因素的影响，保持其活性的能力。
酶的催化活性是由其特殊的空间结构决定的。
稳定的酶的空间结构是由稳定酶空间结构的力决定的。
稳定蛋白质构象的力：
◆盐键、氢键和范德华力
蛋白质中盐键的数目较少，但因为它能维持二级结构，对蛋白质的稳定性作用显著。
◆二硫键、酯键
蛋白质分子内形成二硫键，使伸展蛋白质的熵急剧降低，因而天然蛋白质和变性蛋白质的自由能间的差别增加。
◆疏水作用
带有非极性侧链的氨基酸大约占蛋白质分子总体积的一半，蛋白质的非极性部分总是趋向于使其不与水接触，并尽可能地隐藏在蛋白质的内部。
这种疏水作用使蛋白质稳定性增加。
酶稳定的分子原因：
◆稳定蛋白质构象的力（盐键、氢键、二硫键、酯键、范德华力和疏水作用）。
◆金属离子、底物、辅助因子和其他低相对分子量配体和酶相互作用使酶蛋白构象稳定。
金属离子由于结合到多肽链的不稳定部分（特别是拐弯处），可以显著增加酶的稳定性。
◆酶蛋白质与其它的生物大分子尤其是蛋白质与脂的作用。
在生物体内，蛋白质常与脂类或多糖相互作用形成复合物，屏蔽了蛋白质表面的疏水区域，从而显著增加蛋白质的稳定性。
◆氨基酸残基的坚实装配
蛋白质分子中存在约25%的体积的空隙，这些空隙通常为水分子所充满。
由布朗运动调节的极性水分子与蛋白质疏水核的接触会导致蛋白质不稳定。
◆对氧化修
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