刺山柑耐高温相关基因cDNASRAP差异筛选 14526.docx

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刺山柑耐高温相关基因cDNASRAP差异筛选14526

2014届毕业生毕业论文

刺山柑耐高温相关基因的cDNA-SRAP差异显示

学生姓名史杰

学号2051210227

所属学院动物科学学院

专业动植物检疫

班级14-2班

指导教师杨丽娟

塔里木大学教务处制

二〇一四年五月

目录

1前言1

1.1刺山柑简介1

1.2本研究目的意义1

1.3cDNA-SRAP技术1

1.4cDNA-SRAP筛选差异基因研究进展2

2材料与方法2

2.1材料2

2.2主要试剂及仪器设备2

2.2.1主要试剂2

2.2.2主要药品配制2

2.2.3主要仪器设备3

2.3方法3

2.3.1总RNA提取3

2.3.2RNA完整性及纯度检测4

2.3.3第一链cDNA合成4

2.3.4cDNA-SRAP扩增4

2.3.5cDNA-SRAP扩增产物检测5

2.3.6差异片段的回收及测序6

2.3.7生物信息学分析6

3结果与分析6

3.1RNA提取及检测6

3.2cDNA-SRAP扩增及差异基因筛选7

3.3差异表达片段的分析和功能预测7

4结论与讨论9

4.1cDNA-SRAP技术9

4.2cDNA-SRAP差异条带扩增结果分析9

4.3差异表达基因筛选9

4.4差异表达基因功能预测9

致谢10

参考文献10

刺山柑耐高温相关基因的cDNA-SRAP差异显示

史杰

（塔里木大学动物科学学院新疆阿拉尔843300）

摘要：

探寻高温胁迫下刺山柑基因差异表达，为分离刺山柑耐高温相关基因奠定基础。

以刺山柑幼苗为材料，45℃高温胁迫（25℃为对照）处理，分别提取总RNA，采用cDNA-SRAP技术进行基因差异表达分析。

结果表明，30对引物共扩增到约334条差异片段，大小50-1000bp的cDNA片段，对其103个稳定序列进行了测序，47个差异片段与NCBI中已有序列同源，功能涉及逆境诱导、信号传导以及运输蛋白等，这为刺山柑耐高温分子机理的进一步研究奠定了基础。

另外有56个无同源序列或同源性低差异片段，因此预测其为一些未知功能基因。

因此，cDNA-SRAP适用于刺山柑高温胁迫差异表达分析及分子机理研究。

关键词：

刺山柑；cDNA-SRAP；差异基因

DisplaythecDNA-SRAPdifferenceofCapparisspinosaresistantrelatedgenes

shijie

（CollegeofAnimalScience,TarimUniversity,Alar,Xinjiang843300）

Abstract:

Toexplorethedifferencesunderhightemperaturestressthorncapersgeneexpression,tolaythefoundationofhightemperatureresistantrelatedgenesfortheseparationofCapparisspinosa.Withcapersseedlingsasmaterials,45℃hightemperature（25℃ascontrol）treatment,thetotalRNAwereextractedfromtheanalysis,thedifferenceofgeneexpressionusingcDNA-SRAPtechnology.Theresultsshowedthat,30primerpairstoapproximately334differentfragments,fragmentsizeofcDNA50-1000bp,the103stablesequencesweresequenced,thesequencesofthe47fragmentshomologouswithNCBI,functionrelatestothestressinduced,signaltransductionandtransportproteins,whichlaysafoundationforfurtherstudyofthemolecularmechanismofresistancetohightemperaturecaper.Inadditionthereare56nonhomologoussequencesorlowhomologousfragments,sothepredictionforsomegeneswithunknownfunction.Therefore,cDNA-SRAPissuitableforCapparisspinosahightemperaturestressstudyofdifferentialexpressionanalysisandmolecularmechanism.

Keywords:

Capers;cDNA-SRAP;Differentialgene

1前言

1.1刺山柑简介

刺山柑（CapparisspinosaL）又称野西瓜、老鼠瓜、瓜儿菜、槌果藤、菠里克果和伯格-塔乌孜，维语称“波里克果”或“卡盘”[1]，为白花菜科（Capparaceae）山柑属（CapparisL）藤本植物。

它极耐高温、耐干旱，生于荒漠地带的戈壁、沙地，石质低山和山麓地带，是一种研究抗逆基因不可多得的材料。

在我国主要分布于新疆的北疆、南疆,甘肃西部及西藏境内[2]。

在国外主要分布从地中海地区穿过印度到达菲律宾群岛和太平洋诸岛中海的一些地区，目前主要栽培国家有西班牙、土耳其、摩洛哥、意大利[3]。

刺山柑用途广泛不仅仅抗击风沙、降低风速和防止土壤风蚀的生态价值等价值，此外还具有园林价值[4]。

1.2本研究目的意义

当今，随着全球气候变暖，臭氧层的破坏和“温室效应”迫使气温的持续上升。

高温胁迫对植物的影响也日趋严峻，因此，提高植物的耐高温能力已成为现代植物研究的重点。

目前国内外对刺山柑的研究大多都主要集中在其化学成分和药理研究方面，本研究采用cDNA-SRAP技术，分离刺山柑耐高温相关差异表达基因，旨在探索刺山柑耐高温分子机理，为进一步克隆刺山柑优良耐高温基因奠定基础。

1.3cDNA-SRAP技术

SRAP（sequence-relatedamplifiedpolymorphism）由美国加州大学蔬菜作物系LiG与QuirosCF[5]博士于2001年提出的一种基于PCR的新型分子标记相关序列扩增多态性技术,又叫基因序列扩增多态性。

SRAP的原理是利用独特的引物设计对开放读码框进行扩增，他们针对基因外显子中富含GC而启动子中富含AT的特点来设计引物。

正向引物中的CCGG序列瞄准ORF区的外显子；反向引物中的AATT，序列瞄准启动子和内含子，即分为17个碱基的正向引物和18个碱基的反向引物进行PCR扩增,揭示DNA序列的多态性[6]。

在不同个体中外显子，内含子和间隔子之间的长度变化较大，使用这两个引物进行PCR扩增可产生丰富的多态性。

SRAP技术主要用于生物多样性的鉴定评价、遗传图谱的构建、重要性状基因标记、指纹分析、基因克隆和杂种优势利用等方面[7]。

目前已在其他作物如马铃薯、水稻、生菜、油菜、大蒜、苹果、樱桃、报橘、序菜、丹参、豌豆等植物中也成功扩增。

常规作物水稻、大麦、小麦、黑麦、甜菜等进行了遗传图谱等已有研究报道[8]。

SRAP分子标记系统最早是在芸薹属作物幵发出来，是一种新的DNA分子标记，具有简便、稳定、中等产率和容易得到选择条带序列的特点[9]，cDNA-SRAP产生的差异片段大多和性状有关,可以看成是潜在的功能基因。

1.4cDNA-SRAP筛选差异基因研究进展

Li等发现SRAP技术可以用于cDNA的分析，但cDNA-SRAP技术的应用还相对较少，目前只有在水稻、甘蓝、甜瓜等植物上得到应用。

目前cDNA–SRAP技术已经应用于不同物种、品种之间及相同品种处理之间的差异表达研究,说明SRAP-cDNA方法亦适用于植物基因差异表达分析[10]。

马爱芬等[11]选用培育7年的重组自交系群体,利用cDNA-SRAP法进行了差异显示研究,996对SRAP引物组合扩增出2100条带,2次扩增重复率为65.2%,其中在黄黑籽材料之间重复稳定出现的差异片段有12条,发现2个片段分别与拟南芥的NAD+ADP核糖转移酶及小肽转移蛋白3具有很高的同源性。

Gui等[12]检测自然甘蓝基因表达程度的改变。

用6个品种的cDNA的样品,包括3个异源四倍体和3个同祖先的二倍体,进行cDNA-SRAP分析,结果共得到1496条差异片段,经过筛选测序发现,有92条受到沉默,而19条被激活。

卢泳全[13]等利用12对SRAP引物分析盐胁迫条件下大米草根中基因差异表达，结果表明，在对照和盐处理的转录本之间存在81.65%的差异。

进一步用Northernblotting鉴定了一个差异片段的表达，该片段编码的氨基酸序列与水稻的β-1,3-葡聚糖酶之间存在30%的相似性。

桂琴[14]等将cDNA-SRAP方法用于比较芸薹属不同物种及品种之间的基因差异表达，发现大量物种内和物种间的差异条带。

马爱芬等用cDNA-SRAP分析了甘蓝型油菜黄黑籽之间的种皮色泽的差异表达，获得的2条差异片段可能与甘蓝型油菜的种皮色泽基因表达相关。

2材料与方法

2.1材料

供试材料为2012年9月底采集新疆和静县巴仑台镇（N：

42°25′48.7″，E：

86°15′01.7″，海拔1315m）刺山柑的成熟种子，将种子浸泡过夜，经适当的处理后，转入铺有滤纸的培养皿中，于光照培养箱中培养，待发芽后用Hoagland营养液进行培养。

待幼苗长至两叶一心时，以30℃为对照，45℃高温胁迫12h，将幼苗于液氮中速冻，-80℃保存备用。

2.2主要试剂及仪器设备

2.2.1主要试剂

植物总RNA提取试剂盒RNAprepPurePlantKit（DP432）购自天根生化科技公司；TIANscriptRTKit cDNA第一链合成试剂盒（KR104-02）购自天根生化科技公司；其他试剂包括：

β-巯基乙醇、琼脂糖、去离子水、丙烯酰胺、N，N'-亚甲双丙烯酰胺、Tris（三羟甲基乙二胺）、硼酸、EDTA、尿素、APS、TEMED、醋酸、AgNO3、NaOH、甲醛。

2.2.2主要药品配制

（1）1%琼脂糖凝胶：

琼脂0.2g，0.5×TBE20mL。

（2）变性PAGE凝胶有关试剂的配制。

1）丙烯酰胺溶液（45%m/V）：

丙烯酰胺（DNA测序级）434g、N，N'-亚甲双丙烯酰胺16g，加水至600mL，加热至37℃以促进溶解。

用蒸馏水调制1升，用硝酸纤维素莫过滤，室温贮存于棕色瓶中。

2）0.5MEDTA（pH8.0）（100mL）：

称取Na2EDTA·2H2O18.6g，溶于双蒸水70mL，用10MNaOH调节pH至8.0，补双蒸水至100mL。

3）10xTBE（1000mL）配制：

Tris（三羟甲基乙二胺）108.0g，硼酸55.0g，0.5M，EDTA（pH8.0）40.0mL。

4）1xTBE：

将10xTBE稀释即可。

5）1.6%APS（10mL）配制:

称取0.16g过硫酸铵加少许水溶解，定容至10mL。

6）8%聚丙烯酰胺变性胶配制：

丙烯酰胺溶液17.8mL；10xTBE缓冲液10mL；尿素，42g。

双蒸水，36.9mL。

用双蒸定容至100mL；1.6%APS，1.65mL；TEMED，25uL。

（3）银染法有关试剂的配制

1）固定液（1500mL）配制:

无水乙醇，200mL；HAc，10mL；双蒸水，1300mL。

2）染色液（1500mL）配制:

AgNO3，3g；双蒸水，1500mL。

3）显影液（1500mL）配制:

NaOH，30g；甲醛，6mL；双蒸水，1500mL。

2.2.3主要仪器设备

LDZX-50KB型立式压力蒸汽灭菌器、DHG-9140A型电热恒温鼓风干燥箱、CXZ-280C智能型光照培养箱、RXZ-300型智能人工气候箱、SW-CJ-2F型双人双向净化工作台、SW-CT-1FD型洁净工作台、Neofuge15R型台式高速冷冻离心机、HMS-350型振动器、QL-901型旋涡混合器、BS124S型精密电子天平、DYY-6D型电泳仪电源、HE-120型水平电泳槽、D8023CTL-K4型微波炉、JYO2S型紫外分析仪、TANON-4100型凝胶成像分析系统、NanoDrop2000/2000C型微量紫外分光光度计、DK-8D数显恒温水浴锅、Mini-14k微型高速离心机、H2O3-100c恒温金属浴、TC-5000梯度PCR仪、DYCZ-30C型垂直电泳槽、STS-3型脱色摇床、WD-9406型胶片观察灯、BCD-228WBC型冰箱、DW-HW328型超低温冷冻储存箱。

2.3方法

2.3.1总RNA提取

分别取对照和处理组刺山柑幼苗，按照植物总RNA提取试剂盒说明书操作[15]。

具体步骤如下：

（1）匀浆处理：

50-100mg植物组织在液氮中迅速研磨成粉末，加入450μLRL（使用前请先检查是否已加入β-巯基乙醇），涡旋剧烈震荡混匀。

（2）将所有溶液转移至过滤柱CS上（过滤柱CS放在收集管中），12,000rpm（~13400×g）离心2-5min，小心吸取收集管中的上清液至RNase-Free的离心管中，尽量避免接触收集管中的细胞碎片沉淀。

（3）缓慢加入0.5倍上清提及的无水乙醇（通常225μL），混匀（此时可能出现沉淀），将得到溶液和沉淀一起转入吸附柱CR3中，12,000rpm（~13400×g）离心30-60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR3放回收集管中。

（4）向吸附柱CR3中加入350uL去蛋白液RW1，12,000rpm（~13400×g）离心30-60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR3放回收集管中。

（5）DNaseI工作液的配制：

取10μLDNaseI储存液，将DNaseI干粉（1500U）溶解在550μLRNase-FreeddH2O中，轻柔混匀，分装后-20℃贮存，放入新的RNase-Free离心管中，加入70uLRDD溶液，轻柔混匀。

（6）向吸附柱CR3中央加入80μLDNaseI工作液，室温放置15min。

（7）向吸附柱CR3中加入350μL去蛋白液RW1，12,000rpm（~13400×个）离心30-60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR3放回收集管中。

（8）向吸附柱CR3中加入500μL漂洗液RW（使用前请先检查是否已加入乙醇），室温静置2min，12,000rpm（~13400×g）离心30-60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR3放回收集管中。

（9）重复步骤8。

（10）12,000rpm（~13400×g）离心2min，倒掉废液。

将吸附柱CR3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。

（11）将吸附柱CR3放入一个新的RNase-Free离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加30-100μLRNase-FreeddH2O，室温放置2min，12,000rpm（~13400×g）离心2min，得到RNA溶液。

2.3.2RNA完整性及纯度检测

取5μL提取的总RNA，用1.0%非变性琼脂糖凝胶进行电泳检测RNA完整性，紫外凝胶成像系统观察并拍照记录；取1μL提取的总RNA，用NanoDrop2000/2000C微量紫外分光光度计检测RNA的OD260/DO280，OD260/OD230值及浓度；计算RNA产率：

RNA浓度（μg/uL）×稀释体积（μL）/样品质量（g）。

2.3.3第一链cDNA合成

将对照组和处理组总RNA起始模板调成浓度一致（1μg），按照TIANscriptRTKit cDNA第一链合成试剂盒（KR104-02）操作步骤合成cDNA[16]：

（1）在冰浴的无核酸酶的离心管中加入如下反应混合物:

总RNA1.5ug，Oligo（dT）152uL，SuperPuredNTPs（2.5mMeach）2uL，RNase-FreeddH2OUpto14.5uL。

（2）70℃加热5min后迅速在冰上冷却2min。

简短离心收集反应液后加入以下各组分：

4uL5×First-StrandBuffer（含有DTT），0.5uLRNase。

（3）加1uL（200U）TIANScriptM-MLV，轻轻用移液器混匀。

（4）42℃温浴50min。

（5）95℃加热5min终止反应，置冰上进行后续实验或冷冻保存。

如果需要用RNaseH处理，进行步骤6；否则，进行步骤7。

（6）加RNasin1uL（2U），37℃温浴20min以降解RNA，然后95℃加热5min使酶失活。

（7）用RNase-FreeddH2O将反应体系稀释到50uL，取2-5uL进行PCR扩增反应。

2.3.4cDNA-SRAP扩增

SRAP-PCR反应体系：

总体积25uL，模板cDNA40ng、dNTPs0.2mmol/L、TaqDNA聚合酶0.75U、引物0.2umol/L、Mg2+1.25mmol/L。

引物见表1。

表1SRAP扩增引物序列

表1PrimersequencesusedinSRAPamplification

引物

primer

序列（5′-3′）

sequence

引物

primer

序列（5′-3′）

sequence

me1

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SRAP-PCR反应程序为[17]：

94℃预变性4min，94℃变性1min，35℃复性1min，72℃延伸30s，共五个循环；然后84℃变性1min，50℃退火1min，72℃延伸45s，共35个循环；循环结束后，72℃延伸7min，4℃停止反应。

扩增产物用8%的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，银染显影，照相统计结果。

2.3.5cDNA-SRAP扩增产物检测

8%变性PAGE凝胶的制备

（1）玻璃板处理：

KOH溶液浸泡玻璃板一定时间，用去污剂和清水清洗干净，最后用双蒸水洗两遍，自然晾干。

（2）电泳仪的组装：

将高低玻璃板小心插入橡胶模框的上下槽中，按正确的顺序将储液槽框和橡胶模框竖直立起，用螺母与螺钉将其固定，注意五只螺栓受力均匀，电泳仪底部缝隙用2%的琼脂糖封严[18]。

（3）制胶：

1）在一个250mL锥形瓶中按照黄培堂等[19]配置试验所需的8%变性PAGE溶液：

45%丙烯酰胺溶液17.8mL；10xTBE缓冲液10mL；尿素，42g；双蒸水，36.9mL。

用双蒸定容至100mL；1.6%APS3.3mL；TEMED50uL。

2）混合所有试剂，在55ºC水浴中加热3min帮助尿素溶解。

（尿素溶解过程十分缓慢，必须依靠外部的热量。

）

3）在水浴中取出溶液，冷却15min至室温，不断搅拌混匀。

4）把烧瓶放在真空装置里抽去气体（防止聚合时产生气泡）。

5）把溶液放入250mL玻璃烧杯中加3.3mL新制的1.6%的过硫酸铵混匀（旧的硫酸铵没有足够的聚合能力，会产生模糊的条带。

）。

6）加50uLTEMED，轻轻旋动容器以混匀溶液。

7）灌胶：

用注射器迅速吸取上述溶液缓慢注入玻璃板中，注意不要有气泡，当胶加入到玻璃板上时，灌胶口插入梳子，防止梳子下部出现气泡，室温聚合1h。

SRAP扩增产物的的电泳：

（1）待PAGE凝胶聚合完全时，在电泳槽中加入1xTBE电泳缓冲液。

（2）上样：

取出梳子，使用移液枪吸