七国外对蛭弧菌的研概况.docx

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七国外对蛭弧菌的研概况

噬菌蛭弧菌、噬菌体和细菌素

中国医学细菌中心弧菌噬菌体研究室秦生巨

在流行病学和细菌学的研究中，噬菌蛭弧菌（Bdellovibriobacteriovorus，简称蛭弧菌）、噬菌体、细菌素的研究及其应用已越来越引起人们的关注。

蛭弧菌、噬菌体、细菌素是分属于细菌、病毒、抗菌物质3种不同的有机物，但它们有许多相似的生物特性，而且往往引起人们产生错误的概念。

蛭弧菌是一类专门以捕食细菌为生的寄生性细菌，它比通常的细菌小，有噬菌体、细菌素的作用，且具有细菌的特性。

其宿主范围广泛，对大部分阴性菌都有裂解作用，敏感性较高，特异性不强，但作用方式类似噬菌体和细菌素。

蛭弧菌繁殖一代需4~6h，每次可复制6~36个子代细胞。

蛭弧菌可以在死菌上生长而与噬菌体、细菌素有别。

蛭弧菌的作用可吸附到宿主细胞上并进入宿主细胞内，在其中生长繁殖。

最终导致宿主菌裂解。

噬菌体是一类细菌特异性的病毒，它有典型的病毒形态和结构。

噬菌体对宿主有高度的特异性，噬菌体的宿主范围是鉴别菌株的一个有用的特性，但并不是一个不变的特性。

噬菌体的作用方式，是以尾鞘吸附到宿主细胞特定的受点上，向菌体内注射RNA，并在菌体内复制子代，最终类似蛭弧菌溶解宿主的方式，释放子代。

噬菌体不能在停止新陈代谢的宿主内生长繁殖。

细菌素是细菌产生的一类抗菌物质，也是一种具有抑制细菌活性的高分子蛋白质类物质。

但其抑制作用范围比较窄，只对产生细菌素菌株有近缘的相应的受体菌才有抑制作用，和噬菌体一样具有较强的特异性。

细菌素在作用方式上与噬菌体、蛭弧菌相似，但细菌素不能繁殖，对蛋白酶敏感等与蛭弧菌、噬菌体有别。

细菌素吸附在敏感菌株的细胞上将其杀死，但不象蛭弧菌、噬菌体一样引起菌细胞溶解。

本文就蛭弧菌、噬菌体、细菌素的检测方法、形态结构、理化特性、化学组成、作用机理以及其应用范围等异同性作一系统阐述。

一、检测方法

（一）蛭弧菌的检测

蛭弧菌的检测方法及其计数与噬菌体、细菌素所采用的双层琼脂平板是一致的，所不同的是蛭弧菌所利用的宿主菌是经过洗涤的浓缩菌液（400亿/ml）。

培养基采用自来水双层琼脂，不需加入特殊的营养成份。

在自来水双层琼脂的上层中加入浓厚的宿主菌，此时平板呈半透明背景，蛭弧菌可在含有敏感宿主菌细胞的双层琼脂平板上形成噬菌斑。

蛭弧菌在此双层琼脂中形成的噬菌斑可随时间的延长而逐渐的扩大，直至宿主细胞被耗尽。

形成噬菌斑的时间一般为40~48h。

但在死菌上蛭弧菌形成噬菌斑的时间可提前到14~16h。

蛭弧菌在死菌中形成的噬菌斑数目是活菌的35~290倍。

在噬菌体、细菌素的增殖中无这些现象的报道。

蛭弧菌在营养琼脂平板中形成噬菌斑。

蛭弧菌的最适生长温度为25~30℃。

（二）噬菌体的检测

噬菌体的分离可用平板接种法或肉汤培养物的裂解法。

噬菌体的测定目前已普遍采用双层琼平板法。

在这些方法中所采用的宿主菌均为新陈代谢中的细菌，一旦宿主菌停止新陈代谢，则噬菌体的生长繁殖同时停止。

噬菌体的生长温度为37℃。

用检查噬菌体和细菌素的方法，蛭弧菌则不能生长形成噬菌斑，反之用检查蛭弧菌的方法检查噬菌体，也不能形成噬菌斑。

平板接种效率是检测噬菌体颗粒在接种平板后实际形成噬菌斑的比例数的常用方法。

它取决于噬菌体颗粒吸附敏感宿主细胞的能力和被感染宿主释放噬菌体的能力。

影响平板接种效率的因素很多，如培养物中死菌的存在，以及培养基的成份等。

（三）细菌素的检测

检测细菌素的方法和噬菌体基本相同。

把敏感菌株培养物种在平板表面，然后将产生细菌素的细菌培养物或其产物接种在上面，37℃24h后可形成抑菌区。

交叉划线法和三层琼脂法检测细菌素也是理想的方法。

细菌素分型常采用已知的细菌素对待检菌的检测。

细菌素产生菌及敏感菌的筛选可采用交互作用的方法。

把其菌株既作为细菌产生株，又作为敏感菌，配对检测细菌素的活力单位，在标准条件下，细菌素使敏感菌在琼脂上呈现清晰的抑制生长区域的最高稀释度为一个细菌素活力单位。

对不同种和不同型的细菌素，其活力差别很大。

二、形态和结构

（一）蛭弧菌的形态与结构

蛭弧菌革兰染色呈阴性弧杆菌，相差显微镜下，可见呈跳跃式的运动。

电镜观察，蛭弧菌以弧、杆状为主。

其菌体长约0.8~1.2nm。

胞浆常可观察到致密小体，长约150~300nm，宽为70~120nm，呈片状结构。

核区非常明显，周围包绕着数个核糖体颗粒。

在蛭弧菌中还可见到间体及其他许多内含物质，有人认为间体的存在与蛭弧菌附着宿主菌有关。

蛭弧菌鞭毛结构是独特的，它由鞭毛鞘和轴心组成，鞘壁厚约7.5nm，轴心直径约为13nm。

蛭弧菌鞭毛的结构与其它革兰阴性菌的鞭毛结构基本相似，但未发现鞭毛基部有类似于其它革兰阴性鞭毛基部所具有的L环结构。

（二）噬菌体的形态与结构

噬菌体不能在光学显微镜下观察到，因此，对噬菌体形态、结构的认识，得从电子显微镜开始，这一点与细菌素是相同的。

噬菌体个体叫做病毒粒子，它的形状有3种，包括蝌蚪形、微球形和纤丝形。

目前已知大部分噬菌体是属于蝌蚪形，它由头和尾两部分组成。

噬菌体尾部的结构比较复杂，是感染、吸附、侵入宿主细胞的器官。

蛭弧菌、细菌素不具有这种结构上的特殊分化感染器官。

按其尾部形态特征可分为两类，一类尾部较长，有伸缩性尾鞘，如T2、T4和T6等；另一类尾部无伸缩性，并呈现不同程度的易变性，如T1、T3、T5、T7和λ噬菌体等。

以T2噬菌体为例，头呈六角棱柱体，头长95nm，宽65nm。

外壳是蛋白质，由2000个蛋白质亚单位组成。

亚单位的分子量为80kD，外壳厚2.5~3nm,具有弹性、能伸缩，有助于核酸“注射”到宿主菌体内。

尾部至少有尾鞘、尾髓、基板、尾丝、尾针等几部分组成。

微球形噬菌体较小，约20~60nm，电镜可见到呈二十面体的结构，没有尾部或突起。

φ174在二十面体的每个顶角附有一纽结结构。

噬菌体颗粒的蛋白质外壳包着核酸。

纤丝形噬菌体结构较为简单，呈弯曲丝状，长度可达到600~800nm，没有吸附器官，可直接穿过胞壁而侵染宿主。

（三）细菌素的形态与结构

细菌素是一种生物活性很强的蛋白质物质，或是脂多糖蛋白质复合物，可称为有活性的慢白颗粒。

用电镜技术检查，大部分细菌素呈杆形颗粒状，有髓质和鞘组成。

有些细菌素形态与大肠杆菌T系偶数噬菌体的有收缩力的尾部结构相似。

细菌素的形态可分为收缩型和伸长型两种，收缩型的核和壳的直径较短，一般仅为5~50nm。

而伸长型则约为70~130nm。

细菌素大小有很大的差别，V型大肠杆菌可通过火棉胶膜，而A型大肠杆菌素是不能透析的，E型大肠杆菌颗粒较大，20000r/min离心2h不能洗下来。

铜绿假单胞菌产生的绿脓杆菌素可分为3种：

R型，沉降系数90S，分子量1200kD；F型，沉降系数35S，分子量323kD；S型，沉降系数未见报道，分子量在10KD以下。

霍乱弧菌产生的弧菌素呈短杆状颗粒，有一个20nm的鞘和一个直径5nm和外径10nm的髓。

这种弧菌素的颗粒与完整的霍乱弧菌噬菌体有收缩力鞘的尾部相似。

弧菌素有能伸出鞘的尾状结构，其大小是104nm×21nm，尾部的一端有清楚的颈部，另一端则有纤毛可附属物。

收缩鞘长为45nm，宽为24nm，突出的髓部仅宽9nm，长约104nm。

三、理化性质和化学组成

（一）蛭弧菌的化学组成分及其性质

蛭弧菌具有典型的革兰阴性菌的化学组分，含有肽聚糖成分。

肽聚糖成分由胞壁酸葡萄糖胺及其它13种氨基酸组成，其甘氨酸：

谷氨酸：

二异丙基氟磷酸：

胞壁酸：

谷氨酰胺的比例为2：

1：

1：

1：

1。

蛭弧菌的蛋白质含量丰富，可达细胞干重的60%~65%，DNA的含量为5%，含有典型的嘌呤和嘧啶，DNA的G+C百分含量，大部分菌株为50.2%±0.8%~50.8%±0.9%。

到目前为止，除了蛭弧菌的DNA基因位置和装配结构尚不清楚外，还未发现蛭弧菌DNA结构或成分的特殊性。

Thomashow报道，蛭弧菌鞭毛主要是由蛋白质、磷脂和脂多糖组成，其鞭毛轴心由多肽组成。

鞭毛磷脂高达54%~58%，蛋白质含量仅为23%~28%。

与细胞外膜的磷脂、蛋白质的含量有明显的差异。

蛭弧菌Bduki2含有磷脂，其脂质中所含有的鞘脂类是其细菌研究中极为罕见的。

（二）噬菌体的化学组成和理化特性

噬菌体元素组成主要包括碳、氢、氧、氮、硫等。

WH分析表明，碳为42%，氮13.2%，氢6.4%，磷3.7%。

这些元素组成的核酸和蛋白质，占噬菌体重量的90%以上。

核酸组成噬菌体的髓核，是遗传信息的载体，蛋白质组成噬菌体的衣壳，具有保护作用。

核酸和蛋白质约各占一半，随种类的不同而变化。

噬菌体的核酸分DNA和RNA，但在同一噬菌体中不可能同时含有DNA和RNA这是噬菌体分类的基本依据。

其中又分单链和双链。

T偶数噬菌体DNA中的胞嘧啶被5-羟甲基胞嘧啶所取代。

近年来发现大肠杆菌噬菌体和伤寒沙门菌噬菌体都含有5-羟甲基胞嘧啶。

有的噬菌体DNA中的胸腺嘧啶被5-羟甲基尿嘧啶取代。

还有某些噬菌体DNA中含有已糖-葡萄糖，并与5-羟甲基胞嘧啶的羟甲基相联结。

噬菌体中的蛋白质主要组成外壳，氨基酸形成的多肽链组成每个蛋白质亚单位，它们在形态上叫壳粒。

一个壳粒蛋白实际上就是具高级结构的蛋白质，噬菌体颗粒就是其四级结构的核蛋白大分子。

T偶数噬菌体除头部蛋白和可收缩尾部蛋白质外，还有一些功能不明的内部蛋白占总蛋白质的3%，此外还含有少量其他物质，如酸溶性肽类，主要为门冬氨酸、谷氨酸和赖氨酸；两种酸溶性多胺——腐胺和精胺。

（三）细菌素的化学组分及理化性质

细菌素是一种具有生物活性蛋白质类物质。

大多数细菌素是含有蛋白质和脂多糖的复合物多浆体，相当于菌体O抗原。

细菌素抑制菌体的生长作用与蛋白质成分有关，在蛋白酶的作用下，可破坏其抑菌活性，其活性也与糖脂质有关。

弧菌在pH1.3~12.5的范围内作用30min不受影响，56℃环境经5h或煮沸1min不被灭活。

但是37℃，pH8.0的环境中与0.05%的胰蛋白酶接触20min，或100℃10min可灭活。

绿脓菌素在pH6.5—9.5环境中是稳定的，经蛋白酶作用，冻融或蒸镏水透析均可失去活性。

不同的大肠杆菌素有弥散性，对加热和pH的敏感性等特性有很大差别。

V型、D型和E型大肠菌素极易溶于水，能被硫酸胺及有机溶剂沉淀，而对UV，RNA酶及DNA酶是不敏感的。

K型大肠菌素可用75%的乙醇和在pH4.5的环境中用75%的硫酸胺反复沉淀，然后再进行透析，并用氯仿-辛醇处理，可得到纯化和浓缩的大肠菌素。

这样的K型大肠菌素是耐热的。

四、作用机制

（一）蛭弧菌噬菌体特性及生命过程

蛭弧菌为细胞内寄生物，整个生活周期可分为识别、侵染、穿入宿主菌体、生长发育、裂解宿主菌、释放子代蛭弧菌。

蛭弧菌通过自由碰撞，以没有鞭毛的一端直接吸附在宿主菌上，菌体高速运转，此后通过宿主菌的细孔进入细胞间质中。

侵入过程非常的快，几秒钟内即可完成。

蛭弧菌穿入宿主菌后，鞭毛消失，整个过程最长为60min。

穿入方式：

（1）由于蛭弧菌高速运转，使得蛭弧菌在宿主菌细胞壁上机械钻孔，穿入细胞壁。

其动力主要来源于特殊的鞭毛结构。

蛭弧菌在穿入前，宿主菌的吸附位点在细胞内压力作用下使局部凸起，蛭弧菌吸附宿主菌后，在胞壁上钻孔，头部与宿主菌原生质体连在一起，宿主菌细胞壁结构遭到破坏，导致内外渗透压平衡失调，从而引起宿主菌细胞壁和原生质体膨胀，蛭弧菌被动进入膨胀的细胞。

（2）蛭弧菌穿入时宿主细胞壁破坏还有诱导酶的产生，诱导物存在于宿主菌细胞壁内，蛭弧菌穿入宿主细胞壁时，至少有溶菌酶、胞壁酸酶及酯酶的产生。

酶是蛭弧菌穿入宿主细胞壁时的主要原因子。

蛭弧菌穿入过程完成后，对宿主菌细胞结构进行一系列的修饰和改造，形成一个适合蛭弧菌生长的环境。

蛭弧菌在宿主菌细胞内生长时，可直接利用单体前体物质合成生物大分子，从而极大提高其生物的合成速度。

其核酸的合成，是直接利用单核苷酸作前体物质开始合成的途径。

同时蛭弧菌存在胸腺嘧啶脱氧核苷酸合成酶、胸腺嘧啶核苷磷酸酶及胸腺嘧啶激酶，具有从头合成DNA的潜在能力。

蛭弧