GC+LC 实验讲义05.docx
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GC+LC实验讲义05
仪器分析实验讲义
实验1气相色谱分析条件的选择和色谱峰的定性鉴定1
实验2苯、甲苯、乙苯的气相色谱定量分析5
实验3饮料中山梨酸和苯甲酸的测定8
实验1气相色谱分析条件的选择和色谱峰的定性鉴定
一、目的要求
1.了解气相色谱仪的基本结构、工作原理与操作技术；
2.学习选择气相色谱分析的最佳条件，了解气相色谱分离样品的基本原理；
3.掌握根据保留值，作已知物对照定性的分忻方法。
二、基本原理
气相色谱是对气体物质或可以在一定温度下转化为气体的物质进行检测分析。
由于物质的物性不同，其试样中各组份在气相和固定液液相间的分配系数不同，当汽化后的试样被载气带入色谱柱中运行时，组份就在其中的两相间进行反复多次分配，由于固定相对各组份的吸附或溶解能力不同，虽然载气流速相同，各组份在色谱柱中的运行速度就不同，经过一定时间的流动后，便彼此分离，按顺序离开色谱柱进入检测器，产生的讯号经放大后，在记录器上描绘出各组份的色谱峰。
根据出峰位置，确定组分的名称，根据峰面积确定浓度大小。
对—个混合试样成功地分离，是气相色谱法完成定性及定量分析的前提和基础。
而真正实现对—个混合试样成功地分离，色谱条件的选择中最为关键的是色谱柱的选择、柱温的选择、载气的选择及其流速的确定、燃气和助燃气的比例等。
衡量气相色谱分离好坏的程度可用分离度R表示：
式中，tR2，Y2和tR1，Y1分别是两个组分的保留时间和峰底宽，如图所示。
当R＝1.5时，两峰完全分离；当R=1.0时，98％的分离。
在实际应用下，R＝1.0时一般可以满足需要。
用色谱法进行定性分析的任务是确定色谱图上每一个峰所代表购物质。
在色谱条件确定时，任何一种物质都有确定的保留值、保留时间、保留体积、保留指数及相对保留值等保留参数。
因此，在相同的色谱操作条件下，通过比较已知纯样和未知物的保留参数或在固定相上的位贸，即可确定未知物为何种物质。
当手头上有待测组分的纯样时，作与已知物的对照进行定性分析极为简单。
实验时，可采用单柱比较法、峰高加入法或双柱比较法。
单柱比较法是在相同的色谱条件下，分别对已知纯样及待测试样进行色谱分析．得到两张色谱图，然后比较其保留参数。
当两者的数值相同时，即可认为待测试样中有纯佯组分存在。
双柱比较法是在两个极性完全不同的色谱住上，在各自确定的操作条件下，测定纯样和待测组分在其上的保留参数，如果都相同，则可准确地判断试样中有与此纯样相同的物质存在。
由于有些不同的化合物会在某一固定相上表现出相向的热力学性质，故双柱法定性比单柱法更为可靠。
影响色谱分离的主要因素涉及以下几个方面：
1.载气对柱效的影响：
载气对柱效的影响主要表现在组分在载气中的扩散系数Dm（g）上，它与载气分子量的平方根成反比，即同一组分在分子量较大的载气中有较小的Dm（g）。
根据速率方程：
（1）涡流扩散项与载气流速无关；
（2）当载气流速u小时，分子扩散项对柱效的影响是主要的，因此选用分子量较大的载气，如N2、Ar，可使组分的扩散系数Dm（g）较小，从而减小分子扩散的影响，提高柱效；
（3）当载气流速u较大时，传质阻力项对柱效的影响起主导作用，因此选用分子量较小的气体，如H2、He作载气可以减小气相传质阻力，提高柱效。
2.载气流速（u）对柱效的影响：
从速率方程可知，分子扩散项与流速成反比，传质阻力项与流速成正比，所以要使理论塔板高度H最小，柱效最高，必有一最佳流速。
对于选定的色谱柱，在不同载气流速下测定塔板高度，作H-u图。
由图可见，曲线上的最低点，塔板高度最小，柱效最高。
该点所对应均流速即为最佳载气流速。
在实际分析中，为了缩短分析时间，选用的载气流速稍高于最佳流速。
3.固定液的配比又称为液担比。
从速率方程式可知，固定液的配比主要影响Csu，降低df，可使Csu减小从而提高柱效。
但固定液用量太少，易存在活性中心，致使峰形拖尾；且会引起柱容量下降，进样量减少。
在填充柱色谱中，液担比一般为5％～25％。
4.柱温的选择
柱温是影响气相色谱分离的重要参数之一，主要影响来自于K、k、Dm（g）、Ds（l）；从而直接影响分离效能和分析速度。
柱温与R和t密切相关。
提高t，可以改善Cu，有利于提高R，缩短t。
但是提高柱温又会增加B/u导致R降低，r21变小。
但降低t又会使分析时间增长。
在实际分析中应兼顾这几方面因素，选择原则是在是在难分离物质对能得到良好的分离，分析时间适宜且峰形不托尾的前提下，尽可能采用较低的柱温。
同时，选用的柱温不能高于色谱柱中固定液的最高使用温度（通常低20-50℃）。
对于沸程宽的多组分混合物可采用“程序升温法”，可以使混合物中低沸点和高沸点的组分都能获得良好的分离。
4.气化温度的选择
气化温度的选择主要取决于待测试样的挥发性、沸点范围。
稳定性等因素。
气化温度一般选在组分的沸点或稍高于其沸点，以保证试样完全气化。
对于热稳定性较差的试样，气化温度不能过高，以防试样分解。
5.色谱柱长和内径的选择
能使待测组分达到预期的分离效果，尽可能使用较短的色谱柱。
一般常用的填充柱为l～3m。
填充色谱柱内径为3～4mm。
7.进样时间和进样量的选择
进样迅速（塞子状）以防止色谱峰扩张；
进样量要适当：
在检测器灵敏度允许下，尽可能少的进样量：
液体样0.1～10ul，气体试样为0.1～10ml。
8.燃气和助燃气的比例
在气相色谱分析中，燃气和助燃气的比例会严重的影响组分的分离，一般两者的比例为1：
8~1：
15。
三、仪器和试剂
1.气相色谱仪带FID检测器
2.氮气或氢气钢瓶
3.微量进样器10μL，医用注射剂5ｍＬ，10ｍＬ
4.色谱条件
色谱柱：
苯系物专用检测柱（2mm×2m不锈钢填充柱，其最高耐受温度105℃），
气化室温度：
150℃，检测器温度：
150℃，载气（N2）流速：
30mL/min，燃烧气（H2）流速：
40mL/min，助燃气（空气）流速：
400mL/min，柱温：
80℃。
5.苯、甲苯、乙苯、邻二甲苯、CS2（脱水）等均为分析纯。
四、试验步骤
1.样品的配制：
分别取苯、甲苯、乙苯、邻二甲苯各0.5mL，用脱水CS2稀释至50mL容量瓶中，密封摇匀。
2.样品的测定：
先按照初始条件设定色谱条件，待仪器的电路和气路系统达到平衡，基线平直时既可进样。
吸取0.4μL标准样品注入汽化室，采集色谱数据，记录色谱图。
重复进样两次。
注意每做完一种标准溶液需用后一种待进样标准溶液洗涤微量进样器5~6次。
3.柱温的选择：
改变柱温：
70℃、90℃、100℃，同上测试，判断柱温对分离的影响。
五﹑数据及处理
1.记录初始实验条件下的色谱条件及色谱结果（各自组分及对应保留时间）。
并根据单一标准样的保留时间确定混合样品中各峰的物质名称。
记录各色谱图上各组分色谱峰的保留时间值，并填入下表中。
编号
t苯
t甲苯
1
2
3
平均值
1
2
3
平均值
单标
混合样
编号
t乙苯
t邻二甲苯
1
2
3
平均值
1
2
3
平均值
单标
混合样
2.采用混合标样作为样品，改变柱温：
65℃、75℃、85℃，同上测试，记录各色谱图上各组分色谱峰的保留时间值，并填入下表中。
判断柱温对分离的影响。
温度
t甲苯
t乙苯
1
2
3
平均值
1
2
3
平均值
70℃
80℃
90℃
100℃
3.如果时间许可，可以以混合标样作为样品尝试改变不同的载气流速，改变燃气和助燃气的比例，判断柱温对分离的影响。
六、思考题
1.气相色谱定性分析的基本原理是什么？
本实验中怎样定性的？
2.试讨论各色谱条件（柱温等）对分离的影响。
3.本实验中的进样量是否需要准确，为什么？
4.简要分析各组分流出先后的原因。
实验2苯、甲苯、乙苯的气相色谱定量分析
一、目的要求
1.学习气相色谱法测定样品的基本原理、特点。
定性、和定量分析的基本方法。
2.学习外标法定量的基本原理和测定方法。
二、基本原理
外标法定量的基本原理
用待测组分的纯品作对照物质，以对照物质和样品中待测组分的响应信号相比较进行定量的方法称为外标法。
此法可分为工作曲线法及外标一点法等。
工作曲线法是用对照物质配制一系列浓度的对照品溶液确定工作曲线，求出斜率、截距。
在完全相同的条件下，准确进样与对照品溶液相同体积的样品溶液，根据待测组分的信号，从标准曲线上查出其浓度，或用回归方程计算，工作曲线法也可以用外标二点法代替。
通常截距应为零，若不等于零说明存在系统误差。
工作曲线的截距为零时，可用外标一点法（直接比较法）定量。
外标一点法是用一种浓度的对照品溶液对比测定样品溶液中i组分的含量。
将对照品溶液与样品溶液在相同条件下多次进样，测得峰面积的平均值，用下式计算样品中i组分的量：
W＝A（W）／（A）
式中W与A分别代表在样品溶液进样体积中所含i组分的重量及相应的峰面积。
（W）及（A）分别代表在对照品溶液进样体积中含纯品i组分的重量及相应峰面积。
外标法方法简便，不需用校正因子，不论样品中其他组分是否出峰，均可对待测组分定量。
但此法的准确性受进样重复性和实验条件稳定性的影响。
此外，为了降低外标一点法的实验误差，应尽量使配制的对照品溶液的浓度与样品中组分的浓度相近。
外标法是色谱分析中的一种定量方法，它不是把标准物质加入到被测样品中，而是在与被测样品相同的色谱条件下单独测定，把得到的色谱峰面积与被测组分的色谱峰面积进行比较求得被测组分的含量。
外标物与被测组分同为一种物质但要求它有一定的纯度，分析时外标物的浓度应与被测物浓度相接近，以利于定量分析的准确性。
三、仪器和试剂
1.气相色谱仪（配有氢焰离子化检测器）
2.氮气或氢气钢瓶
3.微量进样器10μL
4.医用注射剂5ｍＬ，10ｍＬ
5.色谱条件
色谱柱：
苯系物专用检测柱（2mm×2m不锈钢填充柱，其最高耐受温度105℃），
气化室温度：
150℃，检测器温度：
150℃，载气（N2）流速：
30mL/min，燃烧气（H2）流速：
40mL/min，助燃气（空气）流速：
400mL/min，柱温：
80℃。
6.苯、甲苯、乙苯、邻二甲苯、CS2（脱水）等均为分析纯。
四、试验步骤
1.标准曲线的测定
（1）标准样品的配制：
分别按下列比例移取苯、甲苯、乙苯、邻二甲苯于50mL容量瓶中，用脱水CS2稀释定容，密封摇匀。
编号
苯/mL
甲苯/mL
乙苯/mL
邻二甲苯/mL
1
0.1
0.1
0.1
0.1
2
0.2
0.2
0.2
0.2
3
0.3
0.3
0.3
0.3
4
0.4
0.4
0.4
0.4
5
0.5
0.5
0.5
0.5
（2）标准曲线的测定：
将色谱仪按仪器操作步骤调节至可进样状态，待仪器的电路和气路系统达到平衡，基线平直时既可进样。
吸取0.4μL标准样品注入汽化室，采集色谱数据，记录色谱图。
重复进样3次。
注意每做完一种标准溶液需用后一种待进样标准溶液洗涤微量进样器5~6次。
2．样品的测定：
将样品摇匀后，在与测定标准曲线相同的色谱条件下对样品进行测定，记录各组分样品的色谱图和色谱数据，并重复进样3次。
五﹑数据及处理
1.将各色谱图上各组分色谱峰面积Ai值，并填入下表中。
绘制各组分的标准曲线，并求出回归方程。
编号
苯
A苯
甲苯
A甲苯
浓度
1
2
3
平均值
浓度
1
2
3
平均值
1
2
3
4
5
编号
乙苯
A乙苯
邻二甲苯
A二甲苯
浓度
1
2
3
平均值
浓度
1
2
3
平均值
1
2
3
4
5
2.在相同的色谱条件下对样品进行分析，填下表。
根据回归方程计算样品中各组分的含量。
编号
A苯
A甲苯
1
2
3
平均值
1
2
3
平均值
未知
编号
A乙苯
A二甲苯
1
2
3
平均值
1
2
3
平均值
未知
六、思考题
1.外标法定量的基本方法？
2.外标法定量实验中是否要严格控制进样量，实验条件若有所变化是否会影响测定结果，为什么？
注：
苯、甲苯、乙苯、邻二甲苯的密度分别取以下值（20℃）：
苯的密度：
0.8786g/mL
甲苯的密度：
0.8669g/mL
乙苯的密度：
0.87g/mL
邻二甲苯的密度：
0.8802g/mL
实验3饮料中山梨酸和苯甲酸的测定
一、目的要求
1．学习高效液相色谱仪的基本结构和基本操作。
2．了解反相色谱法的原理、优点和应用。
3．掌握采用高效液相色谱法进行定性和定量分析的基本方法。
二、基本原理
高效液相色谱法是以液体作为流动相的色谱法，它是利用样品中各组分在色谱柱中固定相和流动相相间分配系数或吸附系数的差异，将各组分分离后进行定性、定量分析。
按固定相和流动相的极性不同可分为正相色谱法和反相色谱法。
其中反相色谱法在现代液相色谱中应用最为广泛，据统计，它占整个HPLC应用的80%左右。
一般用非极性固定相（如C18、C8）；流动相为水或缓冲液，常加入甲醇、乙腈、异丙醇、丙酮、四氢呋喃等与水互溶的有机溶剂以调节保留时间。
适用于分离非极性和极性较弱的化合物。
山梨酸和苯甲酸作为防腐剂，具有抑制细菌生长和繁殖的作用，广泛用于饮料、果汁、蜜饯、果酒、食醋、酱油等的防腐，但它们的过量食用会对人体的肝脏造成损害。
山梨酸（己二烯-（2,4）-酸）作为防腐剂，毒性较苯甲酸低。
ADI为0～25mg.kg-1。
山梨酸微溶于冷水，易溶于乙醇和乙醚，沸点228℃，M（C6H8O2）=112.13g.mol-1（山梨酸），M（C6H7O2K）=150.22g.mol-1（山梨酸钾）。
苯甲酸又称安息香酸，其钠盐、钾盐可用作防腐剂，其毒性较山梨酸大，ADI为0～5mg.kg-1。
苯甲酸微溶于水，易溶于乙酸，具有酸性，沸点249.2℃，100℃即开始升华，M（C7H6O2）=122.12g.mol-1。
本实验以山梨酸和苯甲酸为测定对象，以反相HPLC来分离检测未知样中山梨酸和苯甲酸的含量。
用反相液相色谱法将山梨酸和苯甲酸分离。
以山梨酸和苯甲酸标准系列溶液的色谱峰面积对其浓度做工作曲线。
再根据样品中山梨酸和苯甲酸的峰面积，由工作曲线算出其浓度。
三、仪器和试剂
1．高效液相色谱仪；AgilentXDB-C18色谱柱（4.6mm×150mm）；填料粒径5μm；微量注射器。
2.容量瓶（50mL、10mL）；移液管，烧杯
3.色谱条件：
检测波长230nm，柱温25℃，流动相：
5%乙腈—95%醋酸铵（0.02M），流速0.8mL/min
4.甲醇、乙腈为色谱纯，纯水为超纯水。
四、试验步骤
1.标准曲线的测定
（1）标准样品的配制：
准确称取50mg左右的山梨酸和苯甲酸标准样品置于100mL烧杯中，先用适量无水乙醇溶解，然后用超纯水定容于50mL容量瓶中，摇匀。
分别吸取1mL、2mL、3mL、4mL、5mL标准溶液于10mL容量瓶中，定容至刻度，摇匀。
（2）仪器平衡：
打开电脑、仪器，更换色谱柱，纯乙腈平衡30min；然后换流动相平衡色谱柱30min，观察基线是否平稳。
待基线平直时既可进样。
（3）标准曲线的测定：
待基线平直时既可进样。
吸取10μL标准样品进样，采集色谱数据，记录色谱图。
重复进样3次。
注意每做完一种标准溶液需用后一种待进样标准溶液洗涤微量进样器5~6次。
2.样品的前处理：
碳酸饮料：
取碳酸饮料于小烧杯中，置于超声波中超声处理15min至无气泡以除去饮料中的二氧化碳。
冷却后经0.45μm滤膜过滤，稀氨水调pH为中性备用。
果汁：
取果汁10mL于塑料离心管，设定10000r/min，离心10min将上清液过布氏漏斗抽滤。
取滤液经0.45μm滤膜过滤，稀氨水调pH为中性备用。
3.样品测定：
用微量进样器吸取上述处理好的样品10μL按照测定标准系列的方法和条件，进样测定，重复进样3次，取平均值，从标准曲线上查出苯甲酸和山梨酸含量。
4.仪器维护与关机：
（1）关机前，用95%的水-乙腈溶液冲洗系统约20min，然后用纯乙腈同法清洗20-30min，然后关泵。
（2）清洗进样器：
将进样器扳至Load的位置，用纯水冲洗进样口，同时扳动进样阀数次，每次数毫升。
后用装约5mL溶剂冲洗进样器。
（3）关闭仪器电源、退出工作站、关闭计算机。
五﹑数据及处理
1.标准曲线的绘制：
根据标准曲线的浓度和样品峰面积绘制各组分的标准曲线，并求出回归方程。
2.样品含量的计算：
按照回归方程求出样品中山梨酸和苯甲酸的含量。
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