分析方法的确认.docx

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分析方法的确认

2.对已确认方法的验收（Verificationforpreviouslyvalidatedmethods）

对于像ASTM,USEPA,ISO和IP这些已通过合作研究（collaborativestudies）进行确认的方法，且能够适用于方法所要求的范围之内，对于这类的方法则不需要向内部方法（in-housemethod）那样的严格验证，同样适用于出版的带有实验数据的科学文献。

鉴于此，对于使用这些方法的实验室，大体上能够验证（verify）操作者按照方法中要求操作且能够获得相同的结果即可。

方法的验收（verificationofmethod）必须包括对现有已验证方法使用前所进行统计纠正（statisticalcorrelation）。

但需要注意的是，由于不同标准机构或公认的技术组织对于方法标准的文件化（documentation）差异，如果组织在所发布的方法中没有验证报告或缺乏部分性能（performancecharacteristics）或仅对部分性能确认（verify），则实验室不能够直接使用方法，需要确认。

在使用条件下的方法验收不仅仅是要验收体系符合于方法的要求，同样也验收了方法准确度、精确度或其它参数的符合性。

常用以下方式证明方法性能（methodperformance）：

l   空白，评定污染

l   实验控制样品（e.g.化学分析加标），评定准确性

l   重复测定，评定精确度

l   定量的、批次的分析，需要定期验证校准曲线标准溶液

l   监控质量控制样品，常通过使用控制表（SPC）

l   参与能力验证，这些组织可提供与方法要求一致的样品，具有选择代表性的浓度值、基体、分析参数等。

如对原内部方法（in-housemethod）做了微小的改变（换成不同生产商生产的色谱柱，选择不同的生长基质等），则也需要对方法做验收。

验收程序中关键参数依赖于方法的性质和所可能遇到样品的类型。

足够用于统计分析数量的样品，样品浓度类型需要涵盖所要评定/测定结果范围之内。

对于定量分析，至少评定方法偏差和测量精密度，痕量分析则需要考虑方法检出限LOD和LOQ，以确定满足需求。

定性方法，对现有已确认方法或与已经结果对比进行纠正研究（correlationstudies）是需要的。

如果一个机构要对标准方法进行重大的修改，则需要全面的验证。

当然，难以确定哪些因素的改变会导致重大的变化，除非标准中有说明哪些修改会影响测试结果。

但是一般以下几种情形，可视作为重大改变，如使用不同的溶剂、使用HPLC代替GLC、不同的介质、影响繁殖的关键温度或时间。

如果客户需要比已确认的标准更加详细的说明，则需要附加的确认。

3.方法确认和确认参数

非标准方法和内部开发方法需要方法确认。

方法性能基于方法的有意使用（intendeduse）。

如果一个方法用于定性分析，那么就不需要对在设备整个动态范围内确认方法的线性。

在进行验证之前应对方法范围和确认准则进行界定和文件化。

这些包括但不局限于以下问题：

a）            测量目的（要鉴定什么和为什么要鉴定）？

b）           样品的基体可能是什么？

c）            是否有干扰存在，如有，这些干扰物质需要测试吗？

d）           测量范围多少（期望测试浓度含量范围）？

e）            是否特别法律或法规要求？

f）            是否要对仪器设备和环境条件特别考虑吗？

g）           使用什么类型的设备？

方法是否需要特定的仪器或是否其它同类型的仪器也能够用？

h）           是否有样品制备、抽样、处理程序和包括使用设备的方法？

以下工具用于证明有能力满足方法性能的具体要求：

1.            空白：

使用各种各样的空白评价分析物对分析信号的大小和其它因素如干扰物对信号贡献大小。

空白也可用于测量检出限评定。

2.            参考物质（Referencematerials）和有证参考物质（certifiedreferencematerials）：

利用已经性质或含量值的物质评定方法准确性和获得干扰物质的信息。

当把它们作为测量程序中一部分，它们就是我们所熟知的标准物质。

在批量分析过程中，定期将它们安插在批次测量中，可评定分析过程的稳定性。

注意：

同一种标准物质，不能既用于校准（配制曲线）又用于偏差测量。

3.            加标物质（spikedmaterials）和溶液（solution）

4.            残留物质Incurredmaterials:

这类物质关注的被分析物（目标物）也许主要来自外部。

在取样之前，目标物就已经在某个时段引入到样品中。

常用于加标物质的替代。

（与加标物质相比，此方式引入的目标物与基体结合得更加紧密。

目标物的值取决于与基体接触的目标物的量、基体捕获和流失的比例及代谢过程的其他损失。

例子：

肉中的助长剂，用含有助长剂的饲料喂养的动物的肉制备。

）

5.            重复测量（Replication）:

重复测定可评估测量的精密度。

6.            统计技术（Statisticaldataanalysis）:

利用统计技术评估方法准确性、精密度、线性范围、检出限和定量限和测量不确定度。

比对确认（Comparativevalidation）

比对确认（纠正或交叉）常用于生物分析和用于证明使用两个或以上方面测定某些测量参数是否一致（equivalent）。

如果用原已验证的方法作为参考，将修规后的方法与其进行比对。

不存在仅有单一个测试就能评估方法一致性或可接受准则。

一般将灵敏度高或高回收率的方法认为是最好的。

为了证明替代方法（alternativemethodmean）与参考方法之间是没有统计学差异（显著性差异），则可以利用配对t-test检验分析变异性和结果差异性。

定性方法的比对确认研究，可包括对操作性能的鉴定（identification）（灵敏度、选择性、假定假阳性和假定假阴性）。

确认研究可利用外部机构的一些附加技术研究做支持，考虑利用能力验证的数据。

当单一研究（asimplestudy）要在不同地点或不同机构进行时，每一个地点或机构需要利用加标标准物质和subjectsamples进行交叉验证确保实验室内（inter-laboratory）的可靠性。

同样，也可考虑使用不同分析技术的比对实验（如LC-MS-MS与ELISA）。

初步确认Primaryvalidation

对于比对验证无法使用的情况下（如内部开发方法，修改的标准方法可影响最终测试结果，标准方法超出了其使用范围，可替代分离或检测原理使用、以及快速分析方法），则在导入方法之前，必须要进行方法初步确认。

此时，确认成为了确认一个替代、新颖或其它独立特点方法的操作局限性和性能为目的的探索性工作。

会对方法的性能做出大量和/或表示性的说明。

第一步界定要鉴定或测量对象；包括定性表示要测定的实体（entity）和定量（如可能的话）。

然后对规则（说明）和客户的任何要求进行确认方法。

第二步选择某些性能参数（PerformanceParameters）进行测定。

在后续表述。

注意：

不同的国家或国际委员会组织对这些参数的定义不尽相同。

本文件所使用的定义来源于国际测试术语（VIM）（JCGM200,2008）。

在很多情况下，这些术语替代了其它的组织的定义。

但是，一些解释说明应要与其领域相关。

由于在不同的领域，性能参数测试所需要的样品量也不同，但必须要保证足够的量保证实现方法结果统计有效性（statisticallyvalid），如够用于t-test（t检验）评定准确性。

推荐每一个基体中每一个浓度点的每个测试要至少重复7次测定。

实际操作上，这些数量都会超过。

一般而言，越多的样品测试，越大的自由度，对于测量的统计学分析就越可信。

基体变化（matrixvariation）在许多方面是最为重要的因素但是也是测试误差中最难以把握一个因素。

因此，重要的是考虑样品物质性质引起了基体变化。

就某一些程序而言，如LC-MS-MS基本程序，采用合适的措施确保在整个方法过程中降低基体影响，特别是基体的性质在方法确认过程中的变化（FDA,2001）。

方法分析的每一步要调查这些环境的，基体，材料或程序变化，在物质收集过程和分析过程中对基体中分析物测定的影响。

对于方法确认除了后续所列的那些参数之外，同样也要考虑对评定分析物的稳定性。

如许多溶质在色谱分析前易分解，可能发生在溶液制备、萃取、净化、相转移或存放在冰箱的管瓶中或自动进样器。

必须要在样品收集和处理过程，长期或短期贮存，经过循环的冷冻和融化以及处理工程中，考虑到样品分析物的稳定性。

稳定性实验考察试验的条件要与实际样品处理和分析的条件一致，同样也要对储备液中分析物稳定性做评定。

以下是一个方法确认中关于罐装水果中Sn元素稳定性的分析的例子：

例子：

标准溶液中Sn：

准备一个新的标准溶液绘制工作曲线，与之前配制储存的溶液进行比对，以分析在标准溶液中Sn在一段内的稳定情况。

基体中Sn：

在典型的储存条件下，对于水果中的Sn要多次的分析，使用ICP-OES测定其Sn含量是否降低或消失。

消解溶液中Sn：

对含有已经浓度值的水果样品进行消解，并在一周内每日测定。

方法确认参数（PerformanceParameters）

3.1线性范围Rangeinwhichthecalibrationequationapplies（linearityofcalibration）

线性用于表达某个给定参数浓度与其信号（响应）之间比例关系。

利用校准方程度量线性，因此只是涉及到仪器测量。

线性分析同样利用与整个方法，故也用于考察分析物浓度正确度（trueness）的方程。

对于仪器分析，推荐通过以下的草案（方案）（Thompsonetal.2002,LGC,2003）将校准曲线模型的验证作为方法确认的一部分。

l   6个或以上的校准标准点（包括空白或与一个低浓度点零接近的标准点）。

l   校准浓度点理论上要均匀分布（涵盖）目标浓度范围，不同浓度要独立的配制，不从同一母液中配制。

l   校准溶液的浓度范围覆盖到待测分析物浓度0-150%或50-150%，具体根据看哪个会更适合。

l   标准溶液每个浓度点至少要重复两次测定，建议3次或更多次，随机测定浓度点。

响应值与浓度之间的斜率可以快速地表示出现两者之间的关系。

经典的最小二次拟合方程y=a+bx（y，仪器响应值；x,浓度值）常用于测试分析，a,为线性拟合的截距；b,线性拟合方程的斜率）拟合的标准方差（thestandarderror）sy/x用来评判拟合是否良好。

通常使用线性拟合相关系数来表示（correlatingcoefficient），但要注意这种容易产生误导，有不同的争论。

残差用于评估非线性。

绘制拟合数据和残差图表用于证实线性和离群检验。

如果重复方差与浓度成比例，则会选用加权拟合（weightedregression）而不是经典最小二乘法。

在标准曲线拟合时，统计方法非常的有用，如ICP-OES和ICP-MS的二次拟合方程。

例如在Hibbert（2005）在论证测量不确定度与其参数是否呈线性关系时，采用的二次校准方程。

如果在所考查的浓度范围之内不能呈现所期待的线性关系，则应设法消除导致线性差的因素，或者限制（缩小）浓度的范围以确保其线性。

在某些情况下，即便非线性方程是适合的，但也要谨慎使用，需要验证所选用这种模型的可行性。

一般而言，标准曲线仅需要对样品中可能涉及的分析物浓度的范围便可，曲线的标准浓度范围过宽并不是件好事，因为其测量的不确定度随着浓度范围变广而增加。

校准曲线的数据可以用