炭疽防治技术规范.docx
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炭疽防治技术规范
炭疽防治技术规范
炭疽（Anthrax）是由炭疽芽胞杆菌引起的一种人畜共患传染病。
世界动物卫生组织（OIE）将其列为必须报告的动物疫病，我国将其列为二类动物疫病。
为预防和控制炭疽，依据《中华人民共和国动物防疫法》和其它相关法律法规，制定本规范。
1适用范围
本规范规定了炭疽的诊断、疫情报告、疫情处理、防治措施和控制标准。
本规范适用于中华人民共和国境内一切从事动物饲养、经营及其产品的生产、经营的单位和个人，以及从事动物防疫活动的单位和个人。
2诊断
依据本病流行病学调查、临床症状，结合实验室诊断结果做出综合判定。
2.1流行特点
本病为人畜共患传染病，各种家畜、野生动物及人对本病都有不同程度的易感性。
草食动物最易感，其次是杂食动物，再次是肉食动物，家禽一般不感染。
人也易感。
患病动物和因炭疽而死亡的动物尸体以及污染的土壤、草地、水、饲料都是本病的主要传染源，炭疽芽胞对环境具有很强的抵抗力，其污染的土壤、水源及场地可形成持久的疫源地。
本病主要经消化道、呼吸道和皮肤感染。
本病呈地方性流行。
有一定的季节性，多发生在吸血昆虫多、雨水多、洪水泛滥的季节。
2.2临床症状
2.2.1本规范规定本病的潜伏期为20天。
2.2.2典型症状
本病主要呈急性经过，多以突然死亡、天然孔出血、尸僵不全为特征。
牛：
体温升高常达41℃以上，可视黏膜呈暗紫色，心动过速、呼吸困难。
呈慢性经过的病牛，在颈、胸前、肩胛、腹下或外阴部常见水肿；皮肤病灶温度增高，坚硬，有压痛，也可发生坏死，有时形成溃疡；颈部水肿常与咽炎和喉头水肿相伴发生，致使呼吸困难加重。
急性病例一般经24～36小时后死亡，亚急性病例一般经2～5天后死亡。
马：
体温升高，腹下、乳房、肩及咽喉部常见水肿。
舌炭疽多见呼吸困难、发绀；肠炭疽腹痛明显。
急性病例一般经24～36小时后死亡，有炭疽痈时，病程可达3～8天。
羊：
多表现为最急性（猝死）病症，摇摆、磨牙、抽搐，挣扎、突然倒毙，有的可见从天然孔流出带气泡的黑红色血液。
病程稍长者也只持续数小时后死亡。
猪：
多为局限性变化，呈慢性经过，临床症状不明显，常在宰后见病变。
犬和其它肉食动物临床症状不明显。
2.3病理变化
死亡患病动物可视黏膜发绀、出血。
血液呈暗紫红色，凝固不良，粘稠似煤焦油状。
皮下、肌间、咽喉等部位有浆液性渗出及出血。
淋巴结肿大、充血，切面潮红。
脾脏高度肿胀，达正常数倍，脾髓呈黑紫色。
严禁在非生物安全条件下进行疑似患病动物、患病动物的尸体剖检。
2.4实验室诊断
实验室病原学诊断必须在相应级别的生物安全实验室进行。
2.4.1病原鉴定
2.4.1.1样品采集、包装与运输
按照NY／T5612.1.2、4.1、5.1执行。
2.4.1.2病原学诊断
炭疽的病原分离及鉴定（见NY/T561）。
2.4.2血清学诊断
炭疽沉淀反应（见NY/T561）。
2.4.3分子生物学诊断
聚合酶链式反应（PCR）（见附件1）。
3疫情报告
3.1任何单位和个人发现患有本病或者疑似本病的动物，都应立即向当地动物防疫监督机构报告。
3.2当地动物防疫监督机构接到疫情报告后，按国家动物疫情报告管理的有关规定执行。
4疫情处理
依据本病流行病学调查、临床症状，结合实验室诊断做出的综合判定结果可做为疫情处理依据。
4.1当地动物防疫监督机构接到疑似炭疽疫情报告后，应及时派员到现场进行流行病学调查和临床检查，采集病料送符合规定的实验室诊断，并立即隔离疑似患病动物及同群动物，限制移动。
对病死动物尸体，严禁进行开放式解剖检查，采样时必须按规定进行，防止病原污染环境，形成永久性疫源地。
4.2确诊为炭疽后，必须按下列要求处理。
4.2.1由所在地县级以上兽医主管部门划定疫点、疫区、受威胁区。
疫点：
指患病动物所在地点。
一般是指患病动物及同群动物所在畜场（户组）或其它有关屠宰、经营单位。
疫区：
指由疫点边缘外延3公里范围内的区域。
在实际划分疫区时，应考虑当地饲养环境和自然屏障（如河流、山脉等）以及气象因素，科学确定疫区范围。
受威胁区：
指疫区外延5公里范围内的区域。
4.2.2本病呈零星散发时，应对患病动物作无血扑杀处理，对同群动物立即进行强制免疫接种，并隔离观察20天。
对病死动物及排泄物、可能被污染饲料、污水等按附件2的要求进行无害化处理；对可能被污染的物品、交通工具、用具、动物舍进行严格彻底消毒（见附件2）。
疫区、受威胁区所有易感动物进行紧急免疫接种。
对病死动物尸体严禁进行开放式解剖检查，采样必须按规定进行，防止病原污染环境，形成永久性疫源地。
4.2.3本病呈暴发流行时（1个县10天内发现5头以上的患病动物），要报请同级人民政府对疫区实行封锁；人民政府在接到封锁报告后，应立即发布封锁令，并对疫区实施封锁。
疫点、疫区和受威胁区采取的处理措施如下：
4.2.3.1疫点
出入口必须设立消毒设施。
限制人、易感动物、车辆进出和动物产品及可能受污染的物品运出。
对疫点内动物舍、场地以及所有运载工具、饮水用具等必须进行严格彻底地消毒。
患病动物和同群动物全部进行无血扑杀处理。
其它易感动物紧急免疫接种。
对所有病死动物、被扑杀动物，以及排泄物和可能被污染的垫料、饲料等物品产品按附件2要求进行无害化处理。
动物尸体需要运送时，应使用防漏容器，须有明显标志，并在动物防疫监督机构的监督下实施。
4.2.3.2疫区：
交通要道建立动物防疫监督检查站，派专人监管动物及其产品的流动，对进出人员、车辆须进行消毒。
停止疫区内动物及其产品的交易、移动。
所有易感动物必须圈养，或在指定地点放养；对动物舍、道路等可能污染的场所进行消毒。
对疫区内的所有易感动物进行紧急免疫接种。
4.2.3.3受威胁区：
对受威胁区内的所有易感动物进行紧急免疫接种。
4.2.3.4进行疫源分析与流行病学调查
4.2.3.5封锁令的解除
最后1头患病动物死亡或患病动物和同群动物扑杀处理后20天内不再出现新的病例，进行终末消毒后，经动物防疫监督机构审验合格后，由当地兽医主管部门向原发布封锁令的机关申请发布解除封锁令。
4.2.4处理记录
对处理疫情的全过程必须做好完整的详细记录，建立档案。
5预防与控制
5.1环境控制
饲养、生产、经营场所和屠宰场必须符合《动物防疫条件审核管理办法》（农业部[2002]15号令）规定的动物防疫条件，建立严格的卫生（消毒）管理制度。
5.2免疫接种
5.2.1各省根据当地疫情流行情况，按农业部制定的免疫方案，确定免疫接种对象、范围。
5.2.2使用国家批准的炭疽疫苗，并按免疫程序进行适时免疫接种，建立免疫档案。
5.3检疫
5.3.1产地检疫
按GB16549和《动物检疫管理办法》实施检疫。
检出炭疽阳性动物时，按本规范4.2.2规定处理。
5.3.2屠宰检疫
按NY467和《动物检疫管理办法》对屠宰的动物实施检疫。
5.4消毒
对新老疫区进行经常性消毒，雨季要重点消毒。
皮张、毛等按照附件2实施消毒。
5.5人员防护
动物防疫检疫、实验室诊断及饲养场、畜产品及皮张加工企业工作人员要注意个人防护，参与疫情处理的有关人员，应穿防护服、戴口罩和手套，做好自身防护。
附件1
聚合酶链式反应（PCR）技术
1试剂
1.1消化液
1.1.11M三羟甲基氨基甲烷-盐酸（Tris-HCl）（pH8.0）
三羟甲基氨基甲烷12.11g
灭菌双蒸水80mL
浓盐酸调pH至8.0
灭菌双蒸水加至100mL
1.1.20.5M乙二铵四乙酸二钠（EDTA）溶液（pH8.0）
二水乙二铵四乙酸二钠18.61g
灭菌双蒸水80mL
氢氧化钠调pH至8.0
灭菌双蒸水加至100mL
1.1.320%十二烷基磺酸钠（SDS）溶液（pH7.2）
十二烷基磺酸钠20g
灭菌双蒸水80mL
浓盐酸调pH至7.2
灭菌双蒸水加至100mL
1.1.4消化液配制
1M三羟甲基氨基甲烷-盐酸（Tris-HCl）（pH8.0）2mL
0.5mol/L乙二铵四乙酸二钠溶液（pH8.0）0.4mL
20%十二烷基磺酸钠溶液（pH7.2）5mL
5M氯化钠4mL
灭菌双蒸水加至200mL
1.2蛋白酶K溶液
蛋白酶K5g
灭菌双蒸水加至250mL
1.3酚/氯仿/异戊醇混合液
碱性酚25mL
氯仿24mL
异戊醇1mL
1.42.5mmol/LdNTP
dATP（100mmol/L）20µL
dTTP（100mmol/L）20µL
dGTP（100mmol/L）20µL
dCTP（100mmol/L）20µL
灭菌双蒸水加至800µL
1.58pmol/µLPCR引物
上游引物ATXU（2OD）加入701µl灭菌双蒸水溶解，下游引物ATXD（2OD）加入697µL灭菌双蒸水溶解，分别取ATXU、ATXD溶液各300µL，混匀即为8pmol/µL扩增引物。
1.60.5单位TaqDNA聚合酶
5单位TaqDNA聚合酶1µL
灭菌双蒸水加至10µL
现用现配。
1.710×PCR缓冲液
1.7.11mol/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸（Tris-HCl）（pH9.0）
三羟基甲基氨基甲烷15.8g
灭菌双蒸水80mL
浓盐酸调pH至9.0
灭菌双蒸水加至100mL
1.7.210倍PCR缓冲液
1mol/L三羟基甲基氨基甲烷-盐酸（Tris-HCl）（pH9.0）1mL
氯化钾0.373g
曲拉通X-1000.1mL
灭菌双蒸水加至100mL
1.8溴化乙锭（EB）溶液
溴化乙锭0.2g
灭菌双蒸水加至20mL
1.9电泳缓冲液（50倍）
1.9.10.5mol/L乙二铵四乙酸二钠（EDTA）溶液（pH8.0）
二水乙二铵四乙酸二钠18.61g
灭菌双蒸水80mL
氢氧化钠调pH至8.0
灭菌双蒸水加至100mL
1.9.2TAE电泳缓冲液（50倍）
三羟基甲基氨基甲烷（Tris）242g
冰乙酸57.1mlL
0.5mol/L乙二铵四乙酸二钠溶液（pH8.0）100mL
灭菌双蒸水加至1000mL
用时用灭菌双蒸水稀释使用
1.101.5％琼脂糖凝胶
琼脂糖3g
TAE电泳缓冲液（50倍）4mL
灭菌双蒸水196mL
微波炉中完全融化，加溴化乙锭（EB）溶液20µL。
1.11上样缓冲液
溴酚蓝0.2g，加双蒸水10mL过夜溶解。
50g蔗糖加入50ml水溶解后，移入已溶解的溴酚蓝溶液中，摇匀定容至100mL。
1.12其它试剂
异丙醇（分析纯）
70%乙醇
15mmoL/L氯化镁
灭菌双蒸水
2器材
2.1仪器
分析天平、高速离心机、真空干燥器、PCR扩增仪、电泳仪、电泳槽、紫外凝胶成像仪（或紫外分析仪）、液氮或-70℃冰箱、微波炉、组织研磨器、-20℃冰箱、可调移液器（2µL、20µL、200µL、1000µL）。
2.2耗材
眼科剪、眼科镊、称量纸、20mL一次性注射器、1.5mL灭菌离心管、0.2mL薄壁PCR管、琼脂糖、500mL量筒、500mL锥形瓶、吸头（10µL、200µL、1000µL）、灭菌双蒸水。
2.3引物设计
根据GenBank上已发表的炭疽杆菌POX1质粒序列，设计并合成了以下两条引物：
ATXU：
5’-AGAATGTATCACCAGAGGC-3’ATXD：
5’-GTTGTAGATTGGAGC
CGTC-3’，此对引物扩增片段为394bp。
2.4样品的采集与处理
2.4.1样品的采集
病死或扑杀的动物取肝脏或脾；待检的活动物，用注射器取血5～10mL，2～8℃保存，送实验室检测。
2.4.2样品的处理
每份样品分别处理。
2.4.2.1组织样品处理
称取待检病料0.2g，置研磨器中剪碎并研磨，加入2mL消化液继续研磨。
取已研磨好的待检病料上清100µL加入1.5mL灭菌离心管中，再加入500µL消化液和10µL蛋白酶K溶液，混匀后，置55℃水浴中4～16h。
2.4.2.2待检菌的处理
取培养获得的菌落，重悬于生理盐水中。
取其悬液100µL加入1.5mL灭菌离心管中，再加入500µL消化液和10µL蛋白酶K溶液，混匀后，置55℃水浴中过夜。
2.4.2.3全血样品处理
待血凝后取上清放于离心管中，4℃8000g离心5分钟，取上清100µL，加入500µL消化液和10µL蛋白酶K溶液，混匀后，置55℃水浴中过夜。
2.4.2.4阳性对照处理
取培养的炭疽杆菌，重悬于生理盐水中。
取其悬液100µL，置1.5mL灭菌离心管中，加入500µL消化液和10µL蛋白酶K溶液，混匀后，置55℃水浴中过夜。
2.4.2.5阴性对照处理
取灭菌双蒸水100µL，置1.5mL灭菌离心管中，加入500µL消化液10µl蛋白酶K溶液，混匀后，置55℃水浴中过夜。
2.5DNA模板的提取
2.5.1取出已处理的样品及阴、阳对照，加入600µL酚/氯仿/异戊醇混合液，用力颠倒10次混匀，12000g离心10分钟。
2.5.2取上清置1.5mL灭菌离心管中，加入等体积异丙醇，混匀，置液氮中3分钟。
取出样品管，室温融化，15000rpm离心15分钟。
2.5.3弃上清，沿管壁缓缓滴入1ml70%乙醇，轻轻旋转洗一次后倒掉，将离心管倒扣于吸水纸上1分钟，真空抽干15分钟（以无乙醇味为准）。
2.5.4取出样品管，用50µL灭菌双蒸水溶解沉淀，作为模板备用。
2.6PCR扩增
总体积20µl，取灭菌双蒸水8µl,2.5mmol/LdNTP、8pmol/µL扩增引物、15mmol/L氯化镁、10×PCR缓冲液、0.5单位TaqDNA聚合酶各2µL，2µL模板DNA。
混匀，作好标记，加入矿物油20µL覆盖（有热盖的自动DNA热循环仪不用加矿物油）。
扩增条件为94℃3分钟后，94℃30s，58℃30s，72℃30s循环35次，72℃延伸5分钟。
2.7电泳
将PCR扩增产物15µL混合3µL上样缓冲液，点样于1.5%琼脂糖凝胶孔中，以5V/cm电压于1×TAE缓冲液中电泳，紫外凝胶成像仪下观察结果。
2.8结果判定
在阳性对照出现394bp扩增带、阴性对照无带出现（引物带除外）时，试验结果成立。
被检样品出现394bp扩增带为炭疽杆菌阳性，否则为阴性。
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