胶体金的制备方法.docx

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胶体金的制备方法

一、制备胶体金的准备

欧阳光明（2021.03.07）

（一）玻璃器皿的清洁

制备胶体金的胜利与失败除试剂因素以外玻璃器皿清洁是很是关键的一步。

如果玻璃器皿内不干净或者有灰尘落入就会干扰胶体金颗粒的生成，形成的颗粒年夜小不一，颜色微红、无色或混浊不透明。

我们的经验是制备胶体金的所有玻璃器皿先用自来水把玻璃器皿上的灰尘流水冲刷干净，加入清洁液（重铬酸钾1000g,加入浓硫酸2500ml，加蒸馏水至10000ml）浸泡24h，自来水洗净清洁液，然后每个玻璃器皿用洗洁剂洗3～4次，自来水冲刷失落洗洁剂，用蒸馏水洗3～4次，再用双蒸水把每个器皿洗3～4次，烤箱干燥后备用。

通过此办法的处理玻璃器皿不需要硅化处理，而直接制备胶体金。

也可用已经制备的胶体金溶液，用同等年夜不颗粒的金溶液去包被所用的玻璃器皿的概略，然后弃去，再用双蒸水洗净，即可使用，这样效果更好，因为减少了金颗粒的吸附作用。

（二）试剂的配制要求

依照Frens法还可以制备出其它不合颗粒年夜小的胶体金出来。

许多研究证明用该法制备胶体金时金颗粒的年夜小是柠檬酸三钠用量的函数，基本的规律是柠檬酸三钠用量多，胶体金颗粒直径小，柠檬酸三钠用量越少，腔体金颗粒直径越年夜。

（1）所有配制试剂的容器均按以上要求酸处理洗净，配制试剂用双蒸馏水或三蒸馏水。

（2）氯化金（HauCl4水溶液的配制：

将lg的氯化金一次溶解于双蒸水中配成1%的水溶液。

放在4”c冰箱内保管长达几个月至1年左右，仍坚持稳定。

（3）白磷或黄磷乙醚溶液的配制：

白磷在空气中易燃烧，要格外小心操纵。

把白磷在双蒸水中切成小块，放在滤纸上吸于水份后，迅速放入已准备好的乙醚中去，轻轻摇动，等完全溶解后即得饱和溶液。

蕴藏于棕色密闭瓶内，放在阴凉处保管。

柠檬酸三钠还原法（Frens1973）此办法是由Frens在1973年创建的，制备法度很简单，胶体金的颗粒年夜小较一致，广为采取。

该法一般先将0.01%的HAuCl4溶液加热至沸腾，迅速加入一定量1%柠檬酸三钠水溶液，开始有些蓝色，然后浅蓝、蓝色，再加热呈现红色，煮沸7～10min呈现透明的橙红色。

各种颗粒的胶体金制备详见表52。

表52柠檬酸三钠用量与胶体金颗粒直径的关系

0.01%的HAuCl4（ml）

1%柠檬酸三钠（ml）

直径（ml）

100

5.0

10.0

100

4.0

15.0

100

1.5

25.0

100

1.0

50.0

100

0.75

60.0

100

0.60

70.0

100

0.42

98.0

100

0.32

147.0

100

0.25

160

溶液内加入一定量的还原剂使金离子酿成金原子。

目前经常使用的还原剂有：

白磷、乙醇、过氧化氢、硼氢化钠、抗坏血酸、枸橼酸钠、鞣酸等，下面辨别介绍制备不合年夜小颗粒的胶体金溶液。

二、制备胶体金的办法和步调

窄长型膜,依灵敏度及流速的要求,选用孔径不合的合适的膜.自下端至上端（由左至右）由:

1.样品垫（samplepad）

2.载有固相标识表记标帜配体（抗体或抗原）的玻璃纤维素膜条或聚酯膜条（conjugatereleasemembrane）

3.合适孔径的硝酸纤维素膜条（喷涂有显示阳性结果的捕获阐发物的配体线,和阴性对比组线）（nitrocellulosememtrane）

4.吸水垫（absorbentpad）等四部分衔接固定在不干扰免疫反响和流速的簿塑料背板上（backsheet）

胶体金快速黑点结合免疫阐发

   随着免疫阐发日益广泛应用于以临床为主以及非临床领域的诊断工业（diagnosticindustry），免疫阐发向两个标的目的成长：

一类为全自动化的免疫阐发；另一类为以硝酸纤维膜为载体的快速免疫阐发。

前者需要价格昂贵的全自动仪器及与仪器严格配套的各种试剂盒，目前只能在医疗及检测中心应用，虽也能较快速给出结果，但仍需一按时间，不适合远离医疗及检测中心的地区，更不克不及用于“患者床旁检验”（realtimeclinicaldecision）和普查的需要，在酶免疫阐发的基础上，主要以硝酸纤维素膜为载体的快速诊断办法迅速和广泛地成长起来。

这类办法目前在文献及市场上的命名还很不统一。

它实际上属于快速黑点免疫结合阐发（dotimmunobindingassay,DIBA）,始于80年代。

现介绍如下：

1 两种模式1.1 班点免疫渗滤阐发（dotimmunofiltrtionassay,DIFA） 免疫反响是通过垂直穿透固定有配体的硝酸纤维素膜而进行的（flowthroughtype）。

1.2 黑点免疫层析阐发（dotimmunochromatographyassay,DICA） 阐发原理与DIFA相同，只是反响液体的流动不是直向的穿透流动，而是层析作用的横向流动（lateralflowtype）,在1990年开始应用。

   两种类型快速免疫阐发比较见表。

表 免疫渗滤阐发和免疫层析阐发的比较

免疫渗滤阐发（穿透滤过型）

免疫层析阐发（横向流动型）

硝酸纤维素膜的种类及形式组成方法

为圆片膜

孔径0.20.4µm

较简单,由载有配体（抗体或抗原）的硝酸纤维素膜片及底层的吸水垫料组成

为窄长型膜,依灵敏度及流速的要求,选用孔径不合的合适的膜.自下端至上端（由左至右）由:

1.样品垫（samplepad）

2.载有固相标识表记标帜配体（抗体或抗原）的玻璃纤维素膜条或聚酯膜条（conjugatereleasemembrane）

3.合适孔径的硝酸纤维素膜条（喷涂有显示阳性结果的捕获阐发物的配体线,和阴性对比组线）（nitrocellulosememtrane）

4.吸水垫（absorbentpad）等四部分衔接固定在不干扰免疫反响和流速的簿塑料背板上（backsheet）

标识表记标帜配体的形式

为液相形式

根据需要及可能可设计同时

年夜大都为固相形式

多功能性

测定一种以上阐发物加样、洗涤、加标识表记标帜

同左

操纵步调

配体及洗涤等步调

年夜大都只有加样一个步调

   注:

以上标识表记标帜配体均为胶体金或硒标识表记标帜、分离型染料标识表记标帜等。

如为酶标识表记标帜则两者都必须增加“加显色底物”的步调2 标识表记标帜物的种类   标识表记标帜物包含、胶体金属（胶体金，胶体硒）、分离型染料（dispersedyes）和染料标识表记标帜的微球（latexparticles）等，标识表记标帜物各有优缺点，可根据以下的标准选择，如：

灵敏度，所需要的颜色，阐发的模式和操纵步调，制备、包管重复性、急定性及规模及的难易水平和重复性，以及标识表记标帜物所需配体量等。

其中酶虽然有高灵敏度，重复性好及标识表记标帜物易规模化等优点，但它需要洗涤，加底物等步调，需要反响的时间也长些，对技术也有一些要求，故未能作为快速诊断的主要标识表记标帜物（1985年最初的免疫渗滤阐发是以酶作为标识表记标帜物）。

目前应用最广泛的标识表记标帜物为胶体金，包含：

胶体金免疫渗滤阐发（goldimmumofiltraitionassayGIFA）或滴金免疫阐发和胶体金免疫层析阐发（goldimmunochromatographyassay,GICA）。

由于GICA更简便快速，已成为目前最主要的快速免疫阐发办法之一。

3 原理   胶体金免疫渗滤阐发（GIFA）原理与操纵步调基本与ELISA相同：

加样品于固定有配体（抗体或抗原，此处以抗体为例，下同）的硝酸纤维素膜上，通过渗滤在膜中形成抗体抗原复合物，洗涤渗滤后，再加液体的胶体金标识表记标帜抗体。

当结果为阳性时，在膜上固定有抗体抗原胶体金标识表记标帜抗体复合物而呈现红色黑点。

胶体金免疫层析阐发CICA原理与GIFA相同，只是操纵步调有所不合，如反响液体流动标的目的由垂直渗滤改成横向层析流动（见表）：

样品加样品垫

（1）上，样品向吸水垫（4）标的目的流动，途径载有固相胶体金标识表记标帜抗体膜

（2）后，将金标识表记标帜物完全复溶，抗原与金标识表记标帜抗体形成金标识表记标帜抗体抗原复合物，继续向前流动至硝酸纤维素膜条（3）上，固定有捕获抗原的抗体线处。

当结果为阳性时，金标识表记标帜抗体抗原复合物上，就会形成金标识表记标帜抗体抗原固相抗体复合物，呈现红色阳性条带；如样品中无抗原，则不被捕获，就不显色，则结果为阴性。

过剩的游离金标识表记标帜抗体继续前移至固定有抗金标识表记标帜体二抗处，被固定呈现红色的阴性对比。

GICA与GIFA不合之处在于后者只是单一的免疫层析条，不需要其它试剂，一步操纵。

两者与ELISA不合处是反响时间年夜年夜缩短，仅需要数分钟就完成了ELISA需数小时才干显示的结果。

因为在GIFA和GICA中，高浓度的抗体集中固定在纤维素的微孔中，待测抗原在渗滤或层析时，流经微孔与固定的高浓度抗体紧密接触，很快完成免疫结合反响。

这就是以膜为基础的胶体金快速免疫结合阐发中的免疫浓缩作用（immunoconcentraiton）。

在ELISA中，待测抗原要在液相中经过扩散作用，逐渐与吸附在固相概略的抗体结合。

同时，标识表记标帜抗体也需要同样的扩散结合过程形成抗体抗原标识表记标帜抗体复合物，故需时间较长。

4 胶体金块快速免疫结合阐发的应用   应用领域很广，可分为临床应用与非临床应用两类。

目前应用多以前者为主。

   4.1 临床应用 已应用于临床的很多领域。

由于目前它还是定性阐发，故主要用以检测正常体认中不存在的生物活性物质（如沾染病的抗原及抗体），以及正常情况下体液中含量很低而在某些疾病中升高的生物活性物质。

随着技术的进展，对某些可确定诊断的、有正常上限值（cutoff）的生物活性物质也可进行检测。

下面列出国内外已应用的项目。

     4.1.1 沾染病 

（1）各种病毒的相应抗原及抗体：

各种病毒性肝炎、巨细胞病毒抗体，纯真疱疹病毒抗体，风疹病毒抗体，肾综合症出血热抗体，登革热病毒抗体及轮状病毒等；

（2）性病：

爱滋病病毒抗体，梅青螺旋体抗体，淋球菌及泌尿生殖系统的衣原体等；（3）细菌：

结核杆菌抗体，A族乙型溶血链球菌、沙门氏菌、幽门螺旋杆菌抗体等；（4）寄生虫：

疟原虫，血吸虫抗体，包囊虫抗体，弓形虫抗体等。

     4.1.2 激素 目前用于生殖标记物，主要有诊断早早孕的人绒毛膜促性腺激素（HCG）和检测排卵的促黄体生成素（LH）和促卵泡激素（FSH）等。

     4.1.3 心血管病 急性心肌梗死的标记物，包含肌酸激酶的同工酶CKMB，肌红卵白，肌钙卵白T及脂肪酸结合卵白质（PABP）等。

还有与心血管疾病有重要关系的D二聚体（Ddimer）的检测。

     4.1.4 肿瘤 包含对肿瘤进行筛查和早期诊断有意义的肿瘤标记物，如前列腺特异抗原（PSA），AFP，CEA，CA125及CA153，以及对肠道肿瘤筛查有重要意义的年夜便潜血免疫检测（FOB）等。

     4.1.5 自家免疫病 抗双链DNA抗体和诊断甲状腺自家免疫病的甲状腺过氧化物酶（TPO）抗体。

     4.1.6 阿芙蓉 检测尿液中的可卡因、年夜麻、吗啡、海洛因、苯丙胺等。

国外报导有可同时测7种阿芙蓉的GICA。

     4.1.7 其它 检测C反响卵白，半定量检测血清α脂卵白。

   4.2 非临床应用 可用于食品检测，环境污染，生物沾染，还可用于生物战剂的快速检测，兽医学及法医学等方面检测。

5 制作及操纵中需注意的问题      以GICA为例，它将几种组分优化组合成一个整体的免疫层析阐发条，许多条件及条件的组合城市影响到它的质量，包含：

（1）硝酸纤维素膜的性能和质量，膜孔径年夜小及均一性，选定膜孔径的适宜性，结合配体（抗原或抗体）容量的年夜小，非特异吸附性能，亲水性及液体的流动性和流动速度的均一性等；

（2）捕获配体的量及质量（配体的纯度，亲和力及滴度）及在膜上配体的包被量和均一性。

配体划线位置的固定一致性；

（3）固相金标识表记标帜膜中的胶体金和配体的含量和比度，条间的均一性，固相标识表记标帜物的稳定性，复溶性，复溶速度及流动性，所含缓冲物质的种类及有效促溶剂的使用等；

（4）各种膜，甚至包含样品垫是否经过预期处理以减少非特异吸附。

   以上条件都可以综合影响胶体免疫层析的质量控制，主要包含：

灵敏度，阴阳性界限值（cutoff）的准确性和一致性及层析条间的重复性等。

（5）

（1）灵敏度：

因测定主要针对正常人体液中不存在或含量很低的生物活性物质的定性结果。

高灵敏度及其重复性是最重要的质量控制指标。

为此，生产厂家在包管阐发条的各种优化条件外，还应提供能确证灵敏度的标准品，供操纵者检验其灵敏度和重复性。

另外，还应配有相应的阳性及阴性对比血清以供对比之用。

（2）阴阳性界限值的准确性和重复性：

避免产生假阴性人假阳性结果，包管结果的正确。

生产厂家应提供确定界限值的标准品，最好还要提供低于或高于界限值的标准品（注明浓度），以供使用者对结果的判断。

6 应用的重点和展望

临床应用的重点应放在：

（1）急需快速诊断以便进行治疗的急重症，如协助确诊急性心肌梗死的急性心梗标记物就是很好的例子。

有普查意义的检查和流行病学调查：

如各种沾染病（病毒性肝炎，艾滋病，性病及其它各种流行病）流行病调查；某些肿瘤（如前列腺癌，结肠癌，肝癌，乳腺癌）的普查及预防检查；围产期的健康普查等。

它可以作为快速的初筛普查手段，对阳性和可疑的结果再进一步做更细的可靠的检查。

今后的成长：

（1）全面提高质量。

突出质量控制的包管，为进一步成长打好基础。

（2）提高检测的灵敏度。

目前检测的灵敏度都低于相应的定量免疫阐发，应尽量缩小差距。

除使用各种优质的原料，如膜条，高纯度高亲和力的配体（特别是配伍好的优质单抗），优质高比度的标识表记标帜配体以及先进的工艺外，还应引进信号放年夜系统，例如生物素链亲和素系统，用链亲和素作为膜上的捕获配体，辨别用生物素化和胶体金标识表记标帜的配伍良好的优质的特异性单抗与阐发物形成免疫复合物。

应用链亲和素与生物素结合的四价性及极高的亲和常数，可明显提高灵敏度。

另外，链亲和素生物素系统还可以作为一种通用的阐发系统，检测不合的抗原。

由于链亲和素价格较贵，也可用高质量的抗生物素抗体作为通用的检测系统。

（3）实现半定量和定量化。

①可通过精确控制膜上捕获配体的量，使用多条平行捕获配体线的办法，通过显色条带的数目，判断阐发物的浓度区间，获得半定量的结果；②应用反射的光密度计丈量显色带或黑点的颜色强度，换算成浓度值，实现定量的估算。

德国宝灵曼生产的肌钙卵白T及相应的丈量仪（stripreader）即可显示出免疫层析条上肌惊心动魄卵白T的量。

香港研制的FABP胶体金免疫渗滤阐发也配有定量阐发仪，可进行定量测定。

两者均成为患者床旁诊断急性心肌梗死的快速灵敏办法。

（4）检测多种阐发物。

同一个膜上可同时测定几种有相关意义的阐发物，如乙型肝炎不合的抗原及抗体。

国外已有同时测几种心梗标记物及测定多种阿芙蓉的胶体金免疫阐发。

（5）建立检测全血的办法。

主要针对急重症快速诊断之用，以减少别离血清的音间。

德国宝灵曼生产的人肌钙卵白GICA便采取全血检测办法。

检测全血的办法对自检，患者床旁检查和遥远地区的普查都有实际应用意义。

免疫胶体金的制备及其在医学检验中的应用

周友泉

[斑竹]胶体金是一种经常使用的标识表记标帜技术，有其共同的优点。

近年已在各种生物学研究中广泛使用。

在临床使用的免疫印迹技术几乎都使用其标识表记标帜。

同时在流式、电镜、免疫、分子生物学以至生物芯片中都可能例用到。

　　1971年Faulk和Taytor将胶体金引人免疫化学，此后免疫胶体金技术作为一种新的免疫学办法，在生物医学各领域获得了日益广泛的应用。

目前在医学检验中的应用主要是免疫层析法（immunochromatography）和快速免疫金渗滤法（DotimmuogoldfiltrationassayDIGFA），用于检测HBsAg、HCG和抗双链ＤＮＡ抗体等，具有简单、快速、准确和无污染等优点。

免疫胶体金技术的基来源根基理

　　氯金酸（HAuCl4）在还原剂作用下，可聚合成一定年夜小的金颗粒，形成带负电的疏水胶溶液。

由于静电作用而成为稳定的胶体状态，故称胶体金。

胶体金标识表记标帜，实质上是卵白质等高分子被吸附到胶体金颗粒概略的包被过程。

吸附机理可能是胶体金颗粒概略负电荷，与卵白质的正电荷基团因静电吸附而形成牢固结合。

用还原法可以便利地从氯金酸制备各种不合粒径、也就是不合颜色的胶体金颗粒。

这种球形的粒子对卵白质有很强的吸附功能，可以与葡萄球菌Ａ卵白、免疫球卵白、毒素、糖卵白、酶、抗生素、激素、牛血清白卵白多肽缀合物等非共价结合，因而在基础研究和临床实验中成为很是有用的工具。

　　免疫金标识表记标帜技术（Immunogoldlabellingtechique）主要利用了金颗粒具有高电子密度的特性，在金标卵白结合处，在显微镜下可见黑褐色颗粒，当这些标识表记标帜物在相应的配体处年夜量聚集时，肉眼可见红色或粉红色黑点，因而用于定性或半定量的快速免疫检测办法中，这一反响也可以通过银颗粒的聚积被放年夜，称之为免疫金银染色。

胶体金的制备办法

　　胶体金的制备一般采取还原法，经常使用的还原剂有柠檬酸钠、鞣酸、抗坏血酸、白磷、硼氢化钠等。

下面介绍最经常使用的制备办法及注意事项。

　　１、玻璃容器的清洁：

玻璃概略少量的污染会干扰胶体金颗粒的生成，一切玻璃容器应绝对清洁，用前经过酸洗、硅化。

硅化过程一般是将玻璃容器浸泡于５％二氯二甲硅烷的氯仿溶液中１分钟，室温干燥后蒸馏水冲刷，再干燥备用。

专用的清洁器皿以第一次生成的胶体金稳定其概略，弃去后以双蒸馏水淋洗，可取代硅化处理。

　　２、试剂、水质和环境：

氯金酸极易吸潮，对金属有强烈的腐化性，不克不及使用金属药匙，避免接触天平称盘。

其１％水溶液在４℃可稳定命月不变。

实验用水一般用双蒸馏水。

实验室中的尘粒要尽量减少，不然实验的结果将缺乏重复性。

　　金颗粒容易吸附于电极上使之梗塞，故不克不及用pH电极测定金溶液的pH值。

为了使溶液pH值不产生修改，应选用缓冲容量足够年夜的缓冲系统，一般采取柠檬酸磷酸盐（pH3～5.8）、TrisHCL（pH5.8～8.3）和硼酸氢氧化钠（pH8.5～10.3）等缓冲系统。

但应注意不该使缓冲液浓度过高而使金溶胶自凝。

　　３、柠檬酸三钠还原法制备金溶胶：

　　取0.01％氯金酸水溶液100ml加热至沸，搅动下准确加入１％柠檬酸三钠水溶液0.7ml，金黄色的氯金酸水溶液在２分钟内变成紫红色，继续煮沸１５分钟，冷却后以蒸馏水恢复到原体积，如此制备的金溶胶其可见光区最高吸收峰在535nm，Ａ1cm/535=1.12。

金溶胶的光散射性与溶胶颗粒的年夜小密切相关，一旦颗粒年夜小产生变更，光散射也随之产生变异，产生肉眼可见的显著的颜色变更，这就是金溶胶用于免疫沉淀或称免疫凝集试验的基础。

　　金溶胶颗粒的直径和制备时加入的柠檬酸三钠量是密切相关的，坚持其他条件恒定，仅修改加入的柠檬酸三钠量，可制得不合颜色的金溶胶，也就是不合粒径的金溶胶，见附表。

附表100ml氯金酸中柠檬酸三钠的加入量对金溶胶粒径的影响

１％柠檬酸三钠ml0.300.450.701.001.502.00

金溶胶颜色蓝灰紫灰紫红红橙红橙

吸收峰（nm）220240535525522518

径粒（nm）14797.571.54124.515

　　４、柠檬酸三钠－鞣酸混合还原剂：

用此混合还原剂可以获得比较满意的金溶胶，操纵办法如下：

取4ml１％柠檬酸三钠（Na3C6H5O7.2H2O），加入0～5ml１％鞣酸，0～5ml25mmo/LK2CO2（体积与鞣酸加入量相等），以双蒸馏水补至溶液最终体积为20ml，加热至60℃取1ml１％的HAuCl4，加于79ml双蒸馏水中，水浴加热至60℃，然后迅速将上述柠檬酸－鞣酸溶液加入，于此温度下坚持一按时间，待溶液颜色酿成深红色（约需0.5～1小时）后，将溶液加热至沸腾，坚持沸腾５分钟即可。

修改鞣酸的加入量，制得的胶体颗粒年夜小不合。

　　５、白磷还原法：

在120ml双蒸馏水中加入1.5ml１％氯金酸和1.4ml0.1mol/LK2CO3，然后加入1ml五分之一饱和度的白磷乙醚溶液，混匀后室温放置15分钟，在回流下煮沸直至红褐色转变成红色。

此法制得的胶体金直径约6nm，并有很好的均匀度，但白磷和乙醚均易燃易爆，一般实验室不宜采取。

　　要获得年夜小更均匀的胶体金颗粒，可采取甘油或蔗糖密度梯度离心，经分级后制得胶体金颗粒直径的变异系数（ＣＶ）可小于１５％。

免疫胶体金制备

　　１、卵白质的处理：

由于盐类成分能影响金溶胶对卵白质的吸附，并可使溶胶聚沉，故致敏前应先对低离子强度的水透析。

必须注意，卵白质溶液应绝对廓清无细小微粒，不然应先用微孔滤膜或超速离心除去。

一般情况下应避免磷酸根离子和硼酸根离子的存在，因为它们都可吸附于颗粒概略而减弱胶体金对卵白质的吸附。

２、卵白质最适用量的选择：

将待标识表记标帜的卵白质贮存液作系列稀释后，辨别取0.1ml（含卵白质5～40ug）加到1ml胶体金溶液中，另设一管不加卵白质的对比管，５分钟后加入0.1ml10％NaCl溶液，混匀后静置２小时，不稳定的金溶胶将产生聚沉，能使胶体金稳定的最适卵白量再加10％即为最佳标识表记标帜卵白量。

３、标识表记标帜：

在接近并略为高于卵白质等电点的条件下标识表记标帜是比较合适的，在此情况下卵白质分子在金颗粒概略的吸附量最年夜。

下述标识表记标帜步调最为罕见：

①用0.1mol/LK2CO3或0.1mol/LHCl调节金溶胶至所需pH（标识表记标帜ＳＰＡ时调到pH6.0）。

②于100ml金溶胶中加入最佳标识表记标帜量的卵白质溶液（体积为２～３ml），搅拌２～３分钟。

③加入5ml１％PEG20000溶液。

④于10000～100000g离心30～60分钟（根据粒径年夜小选择不合离心条件），小心吸去上清液（切忌倾倒）。

⑤将沉淀悬浮于一定体积含0.2～0.5mg/mlPEG20000的缓冲液中，离心沉淀后，再用同一缓冲液恢复，浓度以Ａ1cm/540nm=1.5左右为宜，以0.5mg/ml叠氮钠防腐，置4℃保管。

⑥包被后的金溶胶也可浓缩后于SephadexG200柱进行凝胶层析别离纯化，以含0.1％ＢＳＡ的缓冲溶液洗脱。

通经常使用IgG包被的金溶胶洗脱液pH为8.2，以Ａ卵白包被的金溶胶洗脱液为pH7.0。

以上操纵中应注意，一切溶液中不该含杂质微粒，可用高速离心或微孔滤膜预处理。

胶体金的稳定性及免疫胶体金的贮存

　　胶体金具有很高的动力学稳定性，在稳定因素不受破坏时自身凝聚极慢，可放置数年不产生凝聚。

影响稳定的因素主要有电解质、溶胶浓度、温度、非电解质等。

　　金溶胶必须有少量电解质作稳定剂，但浓度不宜过高。

高浓度亲水性非电解质能剥去胶粒外面的水化膜使其凝聚。

少量的高分子物质促使溶胶凝聚，但一定量的高分子物质反而可增加溶胶稳定性，如卵白质、葡萄糖、PEG20000等的加入有良好的稳定效果。

　　当金溶胶吸附卵白质后，溶胶的稳定性随溶液pH而变更，而这种变更又取决于吸附卵白质的等电点，如ConA，过氧化物酶等，当pH较低时坚持稳定，提高pH则显得不稳定，接近等电点或略高时又变得稳定了。

标识表记标帜后的胶体金溶液可用0.2～0.5mg/mlPEG20000作为稳定剂。

在4～10℃贮存数月有效，不宜冰冻。

贮存中可能会产生水平不合的凝聚，可离心除去。

免疫胶体金的应用

　　１、胶体金在电镜水平的应用

　　胶体金应用电镜水平的研究最早，成