包涵体的处理论坛整理.docx

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包涵体的处理论坛整理

关于包涵体的纯化是一个令人头疼的问题，包涵体的复性已经成为生物制药的瓶颈，关于包涵体的处理一般包括这么几步：

菌体的破碎、包涵体的洗涤、溶解、复性以及纯化，内容比较庞杂，尝试整理ing

一、菌体的裂解

1、怎样裂解细菌？

细胞的破碎方法

1.高速组织捣碎：

将材料配成稀糊状液，放置于筒内约1/3体积，盖紧筒盖，将调速器先拨至最慢处，开动开关后，逐步加速至所需速度。

此法适用于动物内脏组织、植物肉质种子等。

2.玻璃匀浆器匀浆：

先将剪碎的组织置于管中，再套入研杆来回研磨，上下移动，即可将细胞研碎，此法细胞破碎程度比高速组织捣碎机为高，适用于量少和动物脏器组织。

3.超声波处理法：

用一定功率的超声波处理细胞悬液，使细胞急剧震荡破裂，此法多适用于微生物材料，用大肠杆菌制备各种酶，常选用50-100毫克菌体/毫升浓度，在1KG至10KG频率下处理10-15分钟，此法的缺点是在处理过程会产生大量的热，应采取相应降温措施，时间以及超声间歇时间、超声时间可以自己调整，超声完全了菌液应该变清亮，如果不放心可以在显微镜下观察。

对超声波及热敏感的蛋白和核酸应慎用。

4.反复冻融法：

将细胞在-20度以下冰冻，室温融解，反复几次，由于细胞内冰粒形成和剩余细胞液的盐浓度增高引起溶胀，使细胞结构破碎。

5.化学处理法：

有些动物细胞，例如肿瘤细胞可采用十二烷基磺酸钠（SDS）、去氧胆酸钠等细胞膜破坏，细菌细胞壁较厚，可采用溶菌酶处理效果更好，我用的浓度一般为1mg/ml。

无论用哪一种方法破碎组织细胞，都会使细胞内蛋白质或核酸水解酶释放到溶液中，使大分子生物降解，导致天然物质量的减少，加入二异丙基氟磷酸（DFP）可以抑制或减慢自溶作用；加入碘乙酸可以抑制那些活性中心需要有疏基的蛋白水解酶的活性，加入苯甲磺酰氟化物（PMSF）也能清除蛋白水解酶活力，但不是全部，而且应该在破碎的同时多加几次；另外，还可通过选择pH、温度或离子强度等，使这些条件都要适合于目的物质的提取。

这是本室的标准配方:

裂解液：

50mMTris-HCl（pH8.5~9.0）,2mMEDTA,100mMNaCl,0.5%TritonX-100,1mg/ml溶菌酶。

（溶菌酶在这个pH范围内比较好发挥作用）

但我个人的经验是:

如果你裂解细菌是为了提取蛋白的话,而且蛋白的分子量又小于20kd的话,尽量减少溶菌酶的用量,会引入溶菌酶这种杂蛋白.一般配60ml裂解液用药匙匙柄盛一点就够.判断裂解好坏的标准是,溶液很粘.

本室的protocol是10ml-50ml缓冲液（菌体洗涤液,裂解液等）/1g湿菌体.

2、表达重组蛋白时，细菌裂解方法都有哪些？

我在表达重组蛋白时，诱导以后跑SDS-PAGE发现表达都很好，但是在裂解细胞时遇到问题。

总是不能彻底裂解细胞。

首先我采用超声裂解，可是不管我如何超声总有部分细菌没有裂解。

我的超声条件如下：

宁波新芝超声细胞破碎仪，功率400W，超5秒，间隔5秒，重复99次。

然后显微镜观察，不彻底时再重复99次。

菌体来自200ml培养液，用20mlPBS重悬。

然后我又尝试加溶菌酶，首先加至终浓度100ug/ml，4C半小时菌液不变粘，加大浓度至1mg/ml，半小时后仍无明显变化。

因为我用的PBS是pH7.4，我怀疑是pH不合适，换用pH8.0TEbuffer，1mg/ml溶菌酶，4C半小时仍无明显变粘。

因为这次使用的溶菌酶是前一天配好的，担心溶菌酶失效，重新称取冻干粉末，直接加入菌液，仍然没有明显变化。

真是郁闷。

到底出了什么事？

请高手解答，并介绍优化的方案。

同时希望能介绍一下如何选择细胞破碎方法，以及如何确定最佳条件。

溶菌酶在pH7.4时是否没有活性了？

可否配成浓缩液保存溶菌酶，如果可以，应如何保存？

请问你是如何知道是没有裂解完全呢？

是不是有目的蛋白的聚集呢？

再加上反复冻融几次。

加入溶菌酶以后，如果细胞壁已破坏，菌液应该变粘吧，因为核酸被释放出来。

而超声破碎细胞，我觉得菌液是不会变粘的，因为超声可以把大分子核酸打碎成小片段。

我判断细胞破碎不完全是因为，在将破碎后样品离心分离上清和沉淀跑SDS-PAGE观察，发现在细胞碎片组分中除了经常出现的一两条带以外，还有菌体总蛋白样品中的很多带出现。

据此可以判断细胞只是部分破碎。

不知我的分析是否正确，请版主和各位高手指教。

如果溶菌酶效果还可以，我觉得先用溶菌酶初步裂解细胞，然后再用超声进一步破碎并断裂大分子核酸以降低粘度的细胞破碎策略可能比较好。

因为超声有可能使蛋白变性，但单用溶菌酶不能确定是否完全破碎，还要再加核酸酶降低粘度。

这种两步法策略应该还可以减少破碎条件优化的时间。

我用的溶菌酶放置时间比较长了，有可能失活了。

我刚从生工又定了一支，不过得后天到货，但愿它有用。

如何观察溶菌酶是否已裂解细胞，通过观察粘度变化是否可以？

只反复冻融是否可以有效裂解大肠杆菌细胞？

你在-70度多反复冻融几次

pengkpwrote:

如何观察溶菌酶是否已裂解细胞，通过观察粘度变化是否可以？

只反复冻融是否可以有效裂解大肠杆菌细胞？

溶菌酶可能是不好用了，看换成新的如何吧。

加了溶菌酶后溶液变粘了，还有一个指标就是PH降低了，检测方法很简单，用普通的PH试纸粘一下就知道了。

菌体胞液的成分是酸的。

我们一般还要边溶菌，边调PH，保持PH=8左右酶的最适PH。

只反复冻融对大肠杆菌效果不太好，壁不易破坏。

可是主任，不完全裂解的话，PH值也应该降低啊，PH要降到什么程度代表完全裂解呢？

反复冻融应该对真核细胞（无细胞壁）更加有效。

我感觉PH是在不断的降低。

比如调PH到8了，搅一会再试，又到5了，再调，再搅，PH就又会降低。

直到PH不降了，说明裂完了。

溶菌酶只有在pH值大于8.0的条件下才能发挥溶菌作用，请务必保持PBS的pH＞8.0，同时溶菌酶的量一定要足！

在加入溶菌酶后，最好放于磁力搅拌器上搅拌30分钟，再进行超声破菌，我的超声条件是：

功率400W，工作2秒，间隔2秒，重复199次。

菌体来自500ml培养物，用30mlPBS重悬，超声效率还是可以的。

哪儿的溶菌酶好用？

我用生工的溶菌酶，称取干粉20mg。

200ml菌液用18mlNaCl重悬，加入2ml25mMTris-HCl（pH8.0），将溶菌酶干粉加入体系，混匀，测pH降低到5－6，加20ul2MTris碱，体系pH升到～8。

4C放置1小时，菌液上层变澄清，摇动发现体系没有变粘。

测pH仍在8左右。

再37C保温1小时，还没有变化，我简直不知如何才好了。

另一瓶200ml培养物，溶菌酶处理1小时后超声。

条件：

300W，超5秒停5秒，重复99次。

菌液有变化，但很不明显。

继续超声400次，从外观来看没有太大区别。

我简直要说tmd了。

见鬼了。

我的操作有什么地方不妥当，请各位指正。

溶菌酶的厂商要求是否很重要？

我的诱导物来自1：

20过夜培养物接种，37C生长3小时后30C诱导2小时（0.8mMIPTG）。

是否菌液太浓，Pharmacia的说明书200ml培养物用10ml重悬，我用20ml，仍然不够稀？

有人告诉我菌液应该稀一些，200ml用30－40ml重悬。

但实际操作也不够理想。

SDS-PAGE总是观察到细胞破碎效果不够彻底。

超声那么多次，蛋白都要被超碎变性了。

细菌破碎有什么关键点？

我哪儿没注意到？

我只有到DXY求助了。

各位快支招啊。

超声效果不太好，冰浴，时间又长，但做到绝对没有不破的菌是不可能的，只要大部分破就可以了。

最好是用压力匀浆机，效果非常好，不过好多地方都没有。

还有一种方法，也许可以，请参考美国专利5,760,189

1.溶菌酶在作用时很多大肠杆菌的株系不产生很明显的溶菌，因只水解胞壁肽聚糖，在壁上打几个小孔，其实已发生效果。

其特征是菌悬液开始是乳浊状象牛奶，加入溶菌酶后很快菌体发生聚集，有细小颗粒状物出现。

２.将表达载体换至BL21（DE3）pLys这种类型的大肠杆菌中去，不会有难溶菌的问题。

它自带溶菌酶，简单冻融就彻底溶菌。

在收集菌体时你速度慢一点都不行，它已经开始溶菌了。

放在液氮重反复冻融几次，效果很好

3、酵母的破碎

用什么方法可以快速简便地裂解酵母细胞壁？

我看到一种用Chloroform/SDS不错，但不知道详细的操作步骤。

请各位指点。

谢谢！

一般应用chloroform/SDS可增大细胞的通透性（Permeabilization），因此要进一步的裂解仍然需要超声辅助。

具体参见：

KevinL.GriffithandRichardE.Wolf,Jr.1，Measuringb-GalactosidaseActivityinBacteria:

CellGrowth,Permeabilization,andEnzymeAssaysin96-WellArrays，BiochemicalandBiophysicalResearchCommunications290,397–402（2002），http:

//www.research.umbc.edu/~wolf/b-gal/b-gal.bbrc.pdf

另外听别人介绍过：

Y-PER™酵母蛋白抽提试剂（简单易用，在20分钟以内温和破碎酵母细胞壁，听起来的确好啊）

作用特点：

1.是常规玻珠研磨法得率的二倍以上

2.避免常规玻珠研磨法的问题（玻珠静电、滚落、破碎）

3.也适用于革兰氏阴性、阳性菌

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酵母是一类单细胞真菌的总称，其成员分别属于不同的真菌纲，细胞壁成分是否会有较大差别，这些都是做破碎酵母细胞前要考虑的。

我归纳了一下，做破碎酵母的几种方法：

1机械的方法：

一般的PROTOCOL都是用glassbeads：

如sigmaG-8772，加玻璃珠后超声，蛋白活性保持较好。

2化学裂解的方法：

10g酵母加1ml的乙酸乙酯，充分搅拌至液体状（希望高手点评

）

3尿素裂解液（尿素8mol/L,NaCl0.5mol/L,Tris20mmol/L,EDTA20mmol/L,2%SDS,PH值8.0）高压匀浆。

（这个好象也该在方法2中）

4液氮冻融并研磨酵母破壁，我认为这种可能在小试中比较合适。

5温和的酶法，可能不会会破坏酵母原生质体

具体参见（我稍稍整理了一下，不过是否准确可信，只有做了才有发言权）：

另外，关于Y-PER破碎酵母细胞壁，也是以前听别人讲的，希望dlzhkkk等用过的园友不吝赐教！

微生物学杂志.2002,22

（1）.-59-59

酵母基因组DNA的两个简易制备方法中介绍的方法不错

制备基因组用于做PCR的话我感觉还是玻璃珠法最好，也非常简单；

我用其他方法抽到大团的GENOME可是PCR拉不出来，如果玻璃珠法抽，沉淀后看不到很明显的GENOME，但PCR能拉出来（2.3KB），可能质量是最关键的吧；菌落法有的能拉出小的非特异性条带（700BP），有的什么都拉不出来，可能拉小片段还是可以的

微生物学报上那篇有点好笑啊，那么罗嗦还称为简单方法

我要做耐药的金黄色葡萄球菌SDS_PAGE,但我没办法把细菌破碎，我试了用超声和上样缓冲液都没成功。

请问高手有什么好的办法将其裂解？

酵母是一类单细胞真菌的总称，其成员分别属于不同的真菌纲，细胞壁成分是否会有较大差别，这些都是做破碎酵母细胞前要考虑的。

我归纳了一下，做破碎酵母的几种方法：

1机械的方法：

一般的PROTOCOL都是用glassbeads：

如sigmaG-8772，加玻璃珠后超声，蛋白活性保持较好。

2化学裂解的方法：

10g酵母加1ml的乙酸乙酯，充分搅拌至液体状（希望高手点评

）

3尿素裂解液（尿素8mol/L,NaCl0.5mol/L,Tris20mmol/L,EDTA20mmol/L,2%SDS,PH值8.0）高压匀浆。

（这个好象也该在方法2中）

4液氮冻融并研磨酵母破壁，我认为这种可能在小试中比较合适。

5温和的酶法，可能不会会破坏酵母原生质体

具体参见（我稍稍整理了一下，不过是否准确可信，只有做了才有发言权）：

另外，关于Y-PER破碎酵母细胞壁，也是以前听别人讲的，希望dlzhkkk等用过的园友不吝赐教！

很全面！

补充一点：

酶法裂解主要用两种酶：

1。

蜗牛酶，可以直接从蜗牛的胃液中获得；2。

lyticase，可以从sigma定购。

这两种酶解法都可以和上面的几种方法结合使用，尤其是glassbeads方法，效果很好。

请教各位，有谁了解pichia酵母的破碎方法。

我的蛋白是胞内表达的，曾用玻璃珠振荡破碎，振60秒冰浴60秒重复10次，裂解液：

EDTA+PMSF+磷酸钠buffer,效果不理想。

真菌DNA的提取，真菌学报上用氯化苄的方法破壁，我做过产率不错。

但是氯化苄有毒，对眼睛的刺激太大了，我在实验室作实验时，害的几个小师妹在旁痛哭流涕，我好内疚。

忘了告诉大家，我的方法如下：

1）取1g菌体样本加入5ml提取液（100mMTris-HCl,pH9.0,40mMEDTA,pH8.0）振荡混匀；2）加入1ml10%SDS,3ml氯化苄，0.5ml蛋白酶K（20mg/ml）,剧烈震荡，使管内混合物呈乳状；3）55℃水浴保温1h,每15min摇匀一次；4）加3ml3MNaAc（pH5.2）混匀，冰水浴15min;5）10000g4℃离心15min;6）取上清液加入等体积氯仿10000g离心10min;7）取上清，加入等体积异丙醇，-20℃沉淀30min;8）12000g离心15min，沉淀用70%乙醇洗2次，吹干溶于灭菌的双蒸水。

4、超声破碎的条件选择

请问超声破碎的最佳条件怎么设置？

我担心超声时间太长、功率太高等等对蛋白活性有影响。

谢谢！

你应该先在右上角的"search"输入"超声破碎"的字样,可以搜到一些旧帖.

如:

在细菌超声破碎时有什么方法能简单准确地判断细菌已经完全破碎？

苦于没有一个标准而无法判断表达的蛋白是形成了包含体还是细胞没有破碎完全。

还有就是超声破碎会不会使可溶的目标蛋白形成沉淀？

请各位高手不吝赐教。

晚辈不胜感激。

另外,最近刚刚有一个关于超声破碎的贴.

我们实验室的经验是超声后菌液不粘稠，可认为破碎完全。

然后在洗涤包含体的过程中收集各步的样品，经sds-page鉴定目的蛋白是以可溶还是包含体形式表达。

超声条件合适的话，可溶性蛋白不会沉淀。

如果条件太剧烈，如超声强度太大或时间过长，蛋白可能发生物理变性。

如果破碎不完全的话,你的样SDS电泳的时候,沉淀跑出来是连续的,许多地方连成一片,破碎完了,要小心电泳,再用新配的染色液和脱色液,染色和脱色,你的条带就会很漂亮.一般说来,破碎不回使可溶的蛋白沉淀.

超声包涵体的话，破碎完全后菌液应该呈现近似灰白色中透清，不是一开始的黄白色。

用枪头吸一些，一滴一滴滴下来时应该没有粘连。

包涵体超声时间过长会出现焦化，即有些黑色。

若包涵体表达量不高，超声时间长了可能会使目标蛋白溶解。

革兰氏染色观察细菌形态，了解破碎情况。

最简单的方法：

涂片--革兰氏结晶紫溶液染色0.5分钟---显微镜观察

切记：

只用结晶紫染色

别忘了染色后再用水稍冲洗一下

染色不一定需要。

枪头滴下来不粘连就可以了

任意一种单染色法染色后显微镜观察均可以快速判定细菌是否已破碎完全。

建议预实验用染色或测定吸光度的方法确定破碎效果

以后就评经验看看好了呵呵

看那么多高手都很有经验，大家能不能给出几个实际的超声条件，我也一直对如何确定超声是否恰好犯愁。

这是一个实验室的超声条件：

300W,超2秒，间隔2秒，重复99次

对于以上的讨论，我的一点理解：

超声后菌液不可能粘稠，因为核酸都被打断成小片段了，根据液体粘稠度变化来判断超声效果可能不太合适。

同样的道理，枪头滴下不粘连可能也不能准确判断。

超声以后，菌液外观确实有变化，一般超声后菌液感觉变得更透明了，可是经常无法准确判断透明到何种程度算是可以了，如果没有标准超声样品，实在不好判断。

染色法可能比较准确，但手头要有显微镜和染液。

吸光度法没试过，从道理来讲应该可以。

染色法应该是比较可靠和准确的方法，显微镜和染液都很容易得到。

以染色法确定最佳超声条件，以后则不需每次都通过染色来判定，只需以摸索得出的最佳条件超声即可。

吸光度法虽理论上可行，但实际应用起来并不能达到最理想的效果。

如果你是新手又不太确定，那么染色也可以。

我们经常做的就凭经验看菌液外观和粘连度就可以了，没有什么问题。

工作量大的时候，为此再染个色太麻烦。

我记得不是600就是640nm（不好意思忘记了）可以检测破碎程度，当然你可以没隔一断时间检测吸光度变化，作个破碎曲线啊。

我做过的包含体破碎后都是灰白色，期间掺杂有黑色，煮了离心电泳可以看到很漂亮的带。

可以根据感官上判别一下，破碎前和破碎后是有很大的区别的，能看出来，做几次后，你可以根据经验判断了，其实也没有一个明确的概念，那种条件是合适的，因为你每次处理的样品不一样，所以可以根据你的经验来定到一种什么样的程度是合适的

我们现在准备超声波破碎小鼠胚胎，但是不知道胚胎放到什么混合液中超声破碎，混合液中应该加什么酶抑制剂！

我们是准备定量分析胚胎中的热休克蛋白

我们是准备定量分析附植前胚胎合成的热休克蛋白

可以使用《edit》功能对原贴进行编辑。

irenedengwrote:

如果破碎不完全的话,你的样SDS电泳的时候,沉淀跑出来是连续的,许多地方连成一片,破碎完了,要小心电泳,再用新配的染色液和脱色液,染色和脱色,你的条带就会很漂亮.一般说来,破碎不回使可溶的蛋白沉淀.

你的意思是说，沉淀也可以跑出漂亮的一条一条的带？

但为什么破碎不完全，沉淀跑出来的是连续的？

我们在跑全菌的时候，条带也是一条一条的呀

是用破碎后，经过离心之后的菌泥做SDS电泳吗，那样的话是不是条带很多？

离心后的上清液要跑电泳吗？

即使破碎不完全的话，只要有目的蛋白的话，条带还是有的，而且可能也很清楚，一条一条的吧。

请问楼上：

检测吸光度变化判断是否破碎完全时，会有什么规律？

若包涵体表达量不高，超声时间长了可能会使目标蛋白溶解。

是真的吗？

我正在做菌体表达蛋白纯化，开始的时候按包含体做的，结果现在发现超声波破碎后目的蛋白留在上清里面，这次的超声波时间是长了些，大家给分析一下是原来本来就是融合性蛋白还是包涵体溶化了？

有活性就可以了呀，不用在乎那么多

sdauwrote:

最简单的方法：

涂片--革兰氏结晶紫溶液染色0.5分钟---显微镜观察

切记：

只用结晶紫染色

用染色法判断，能不能说的具体一些，谢了！

！

当你看了这些帖子,觉得还要疑惑的话再提问,这样的问题因为具体更有价值,才可能得到更多的应助.

要更好地从丁香园获取知识的话,一定要多琢磨应该怎样使用,这样不光是利己也是利人,利人的人才可能获得别人更多的更热忱的帮助啊

求助：

用超生波破碎细胞时，怎样可以不让温度超过４０度？

在破碎的时候，准备一个冰盒，把试管放在里面，超生的时候托着点，这样就能保证温度不高了

我们这是一个超生波水浴锅,不是准备一个可以悬浮的冰盒,装上冰,把管子放在冰上,把冰盒放在水上,这样打超声波可不可以?

BACTERIA11wrote:

在破碎的时候，准备一个冰盒，把试管放在里面，超生的时候托着点，这样就能保证温度不高了

温度高冰会融化，注意及时换冰！

可以做个支架，托住试管，然后整个放在冰水浴中更好，只需要定时补充冰就可以，

首先超声破碎细胞不是用你说的超声水浴锅的，是用一种带探头的超声细胞破碎仪，至少我没有用超声水浴锅破碎细胞过，它主要功能是用来洗涤的。

另外，你们有制冰机吗？

如果没有的话就要多冻一点冰块。

如果用超声细胞破碎仪可以用一个一次性杯子里面装上碎冰，把试管放入，用手从杯子外捏住试管，超声15s,间隔几秒再继续。

如果是用超声水浴锅，直接把碎冰放入其中，加水，制成含冰的水溶液，温度在0-4度即可，如果过程中产热过多则要加冰。

把样品放到小烧杯里，然后放入盛碎冰的大点的烧杯中。

用架子托住。

另外要保证间歇时间大于超声时间，根据相应的文献确定这两个具体的时间。

样品置于冰水混合物中,光用冰达不到效果!

我们那超生波水浴锅本来是用来洗涤用的，但它就不能用来破碎细胞吗？

我门也有一个带探头的超声细胞破碎仪，但它一次只能处理一次样品，好麻烦。

知道的请给点意见！

还是用专门的超声细胞破碎仪吧。

另外，昨天在坛子里看到，有人用乙醇，水的混合物置于冰箱冷冻室，可以代替冰水混合物，更冷。

（哈哈，现学现用）

不知道你破碎什么细胞，通常都不需要破碎很长时间呀！

！

一般都是用冰水浴，工作10S，停10S，就可以维持在较低温度下。

如果你怕温度高，那就工作时间缩短，停止时间增加。

这样就应该可以解决发热升温问题。

当然，时间就要延长了！

！

dingxinhuawrote:

我们那超生波水浴锅本来是用来洗涤用的，但它就不能用来破碎细胞吗？

我门也有一个带探头的超声细胞破碎仪，但它一次只能处理一次样品，好麻烦。

知道的请给点意见！

本来就是这样的啊,都是有一个探头的,一个一个样品破碎.你一次同时处理的管数很多么?

不是还要离心的么

洗涤用的锅子的效果恐怕不好吧

我们是工作10s,停30-60s

听了各位的意见真是收益非浅,谢谢各位了,我破碎的水稻叶片组织,需要15分钟.每工作10s,停30-60,那岂不是要很长时间.我的方法源自下面的方法:

ProtocolforProteinExtraction

Groundtissueinamortarwithliquidnitrogen.Collectgroundedmaterialinaeppendorfftube（tubeweight1.0g）.

Weightthematerial

Add10%w/vtrichloroaceticacidand0.07%v/v2-mercaptoethanolinCOLD（-20C）acetone（approx.1mlfor0.3goftissue

Incubatefor2hsat-20C（Otherprotocolsleaveitovernightat-20C）

Centrifugetheprecipitatedproteinsinmicrofugefor15-20min.at14,000rpm

WashpelletwithCOLDacetoneconta