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基因工程抗体概述和基本技术
基因工程抗体概述和基本技术
（GeneticEngineeringAntibody）
一、概述
以生物高技术为手段，将动物淋巴细胞产生的抗体基因，人为地使其在非淋巴细胞中表达，所产生的抗体称基因工程抗体。
产生抗体的基因工程是建立在单克隆抗体（McAb）技术之上的，如果说后者是生物科学的一场革命，那么抗体的基因工程技术无疑是这场革命的拓宽和延续。
1975年，Khler和Milstein等创立的B淋巴细胞杂交瘤技术给抗体技术的深入研究及应用带来了突破，单克隆抗体作为临床诊断、治疗、预防及基础理论研究的新型制剂，已日益显示出重要的作用和广阔的应用前景，尤其是McAb或“McAb复合物”对临床某些疾病如肿瘤的治疗作用更引人注意。
将McAb与化疗药物、毒素或同位素等连接后，借助McAb的特异性识别，可有效地将治疗性药物运送到靶细胞，这种称为魔弹（magicbullets）的导向药物疗法的出现，曾令人们兴奋不已，以为找到了攻克癌症的尖端武器。
尽管这一技术有许多不可比拟的优点，随着研究的深入，也暴露出许多问题，其中最主要的就是难以获得大批量的人类杂交瘤抗体，致使用于临床治疗的McAb绝大多数都来源于小鼠和大鼠。
由于人和鼠之间遗传背景的差异，在人体内使用鼠源McAb，会被作为外源性蛋白抗原而产生人抗鼠抗体（humananti-murineantibodies,HAMA），这种抗体会被迅速清除，如由静脉注入人血液中的小鼠单抗，会妨碍小鼠McAb与抗原或靶细胞的结合，从而降低McAb的治疗效应，更为重要的是HAMA可在人体内与小鼠McAb结合，可产生类似血清病的超敏反应，因而限制了鼠源McAb在临床上的反复使用。
最好的办法是应用人源性单抗。
但人-人杂交瘤技术尚未出现重大的突破，存在着建株困难、Ig产量太低、稳定性和亲和力差，以及本身还分泌一些杂蛋白等问题。
基因工程抗体技术依赖于两个基础：
一是抗体的结构功能关系以及抗体多样性的遗传机制，二是分子生物学技术进展，特别是PCR技术，为基因片段的大量扩增提供了简单有效的途径。
基因工程抗体技术的基本原理是，首先从杂交瘤细胞、免疫脾细胞或外周血淋巴细胞中提纯mRNA，逆转录为cDNA，再经PCR分别扩增抗体的重链和轻链可变区编码基因，经适当方式将二者连接形成单链抗体可变区基因片段（single-chainvariablefragments,ScFv），在一定的表达系统中得以表达。
另外，重链和轻链可变区基因还能在同一宿主的两个载体中分别表达，然后在胞浆内组装成单链抗体可变区片段（ScFv），或二价抗体片段。
这种单链抗体在其N末端或C末端可进一步与毒素、葡萄球菌蛋白A、碱性磷酸酶、T细胞受体及单链抗体片段本身融合，这些蛋白质既有抗原结合能力，又有其融合蛋白的生物活性，因此这类蛋白被称为“双功能抗体”。
二、抗体的基因结构
抗体是由二硫键相连的两条轻链（L链）和两条重链（H链）构成的活性多肽蛋白分子。
具有两个功能区：
一为特异性结合抗原区，位于抗体L、H链的可变区（V区），一为稳定区（C区）。
免疫球蛋白的轻链和重链是由两个不同类型的基因分别编码的，属于多基因家族。
Ig的V基因和C基因均由多个外显子组成，Ig分子的每一个多肽区由不同的外显子编码，尤其是重链基因，有多个外显子供选择，这也是抗体形成多样性的物质基础，如编码Ig重链VH的基因有多个基因片段（VH1～VHn）供选择，与VH基因连接的还有多样性基因节段（DHa～DHx），连接链基因片段（JH1～JH6）和决定重链种类的恒定区基因片段（Cµ～Cε）。
这些基因在DNA水平上切断、重组，在RNA水平上拼接，根据与哪一类C基因片段连接，即组成哪一类Ig，Tonegawa（1976）和Early（1980）等先后证明免疫球蛋白肽链的合成由位于常染色体上彼此不相连锁的三个基因群（重链、γ链和κ链基因群）所编码。
而且重链和轻链的C区和V区以及V区基因本身也不是连续的基因编码。
V区由V、J两个基因控制。
另外，胚胎DNA的V基因还有一个引导基因（leadergene）称为L基因，编码约17～20个氨基酸的疏水引导肽段。
当有抗原刺激时，B细胞分化伴有突变发生，编码Ig的DNA经过V、J和V、D、J（编码H链基因）基因的随机重排方能形成功能的Ig基因，使编码的IgV区具备独特、多变的结构。
转录成RNA，经加工剪接后形成成熟的mRNA，方能翻译出Ig的L链和H链。
杂交瘤技术使得从分泌特异性鼠McAb的杂交瘤细胞中获得特异活性Ig基因组成成熟的mRNA成为可能，蛋白质基因工程技术使得两种来源不同的编码Ig的结构基因重组相嵌，获取目的性基因片段，舍弃非目的性基因片段。
从而构建成嵌合Ig基因克隆，经表达而制成嵌合McAb。
三、制备基因工程抗体的基本技术路线
从宏观上看，目前基因工程抗体主要在酵母、大肠杆菌、动物非淋巴细胞中表达有功能活性的Ig。
其生产的技术路线与重组性细胞因子相类似，但由于抗体分子结构复杂，并且具有自己的一些特性。
因此，基因工程抗体的操作过程也有自己一些独特的地方。
在技术上包括三大环节：
①分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株的建立；②构建McAb的基因文库及其表达载体；③转化到非淋巴细胞中进行表达。
（一）抗体基因的克隆及重组进行基因工程抗体制备的首要任务是获得能表达抗体肽链的基因片段。
C区基因的序列比较恒定，可以很容易地获得，关键是准确地获得编码抗体可变区（特别是抗原结合位点区）的基因。
目前可能从分泌特异性抗体的杂交瘤株的cDNA文库和基因组文库中进行筛选。
正常情况下V区基因不表达，只有经过重排使VJ相连接后的基因才可以表达出具有抗原结合能力的Fv段。
因此，人们勿需事先弄清V区的氨基酸排列顺序，只需使用J链基因（该基因的核苷酸序列变异小，可用于共用探针）探针即可从构建的cDNA文库中筛选出含V区基因外显子的基因克隆。
遗憾的是，杂交瘤细胞系经常会有一些异常重排的V区基因，其中的部分还可以具有转录活性。
因此为获得正确的目的基因，还有必要进一步的鉴定。
利用基因组文库的优点在于所获得的V区基因含有完整的转录单位，包括自身的起动子、增强子成分及剪接功能，有助于重组后的顺利高效表达。
而利用cDNA文库时（由于不含较长的内含子序列），可通过PCR技术合成较多的V区基因，较容易获得目的基因。
Ig的V基因和C基因均由不同的外显子构成，抗体的每个功能区蛋白均由独自的外显子编码，这给体外加工和重组抗体基因组V和C区的基因带来了便利，可较容易地进行缺失（dalating）、插入（inserting）、交换（exchanging）及改变外显子的次序。
（二）抗体基因表达载体的构建为了能运载Ig基因，并得以在持续稳定转染的相容细胞中分泌表达，必须构建相应的真核表达载体质粒，这种质粒须具备如下特点：
①具备完整的真核转录单位，可以整合到宿主细胞染色体中，并表达或能自行复制其DNA；②因为只有约103～106的真核细胞被转染，因此要从中筛选出被转染的阳性表达细胞，所以该质粒应具备选择性基因标记，其基因产物可在选择性培养基中进行鉴别；③其DNA片段容易被修饰，可进行适宜的插入或剪接；④内含适宜的限制酶的酶切位点，使适宜的DNA片段容易克隆。
根据表达时选用的受体细胞类型，可构建各自相应的载体。
为生产出具有功能活性的新型抗体分子，需将编码轻、重链的H和L基因同时导入受体细胞，并使之等量（或接近等量）地表达和装配。
目前采用了两种方法：
①分别构建表达H基因和L基因的载体，并用两个载体同时转染受体细胞，该法便于遗传学操作，但只有两种载体同时转染成功并产生等量轻、重链时，才能有效地装配成功能性抗体，因此两种载体应载有不同的抗性基因（多采用neo基因-转染的细胞表现为G418抗性和gpt基因转染的细胞表现为霉酚酸mycophenolicacid抗性），并同时使用两种制剂做双重抗性筛选；②将轻、重链基因插入同一载体，该法利于筛选，但插入的基因序列过长，给基因操作带来一定的困难。
（三）抗体基因的表达抗体结构较复杂，与其他单链蛋白或多肽（如细胞因子等）相比，高效表达功能性抗体分子尚有很大困难。
目前，许多学者主要是利用哺乳类动物非淋巴细胞，导入用质粒重组的目的基因，表达后，制备基因工程抗体，这是目前制备这类抗体的主要方法。
四、基因工程抗体的种类
现将已研制出的多种不同类型的基因工程抗体分述如下：
（一）嵌合抗体（chimericantibody）又称“杂种抗体”（hybridantibody），是指在同一抗体分子中含有不同种属来源抗体片段的抗体。
目前构建的嵌合抗体多为“鼠-人”类型，即抗体的Fab或F（ab′）2来源于鼠类，而Fc段来源于人类。
与小鼠源抗体相比，鼠-人嵌合抗体至少有两个优点：
一是用人源Fc段替代鼠源Fc段，可在一定程度上减少体内治疗时所诱导的抗异种球蛋白反应，实验还显示这种嵌合体还有助于减低抗独特型反应（anti-idiotypicresponse）；二是抗体重链C区所代表的免疫球蛋白即同种型（包括类和亚类）的差异可影响抗体的体内功能，如产生补体依赖的细胞毒作用（CDC）、抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用（ADCC）及免疫调节作用等。
在构建嵌合抗体时，可有目的地改变抗体的类型或亚类（如IgGl和IgG3比其他种抗体具有更强的CDC和ADCC效应，可更有效的杀伤肿瘤细胞），增加体内治疗的效果。
例如大鼠抗CAMPATH-1抗原（该抗原表达于人淋巴细胞和单核细胞表面，但其他类型血细胞及造血干细胞均无此抗原表达）单抗具有抗人淋巴细胞和单核细胞特异性，已被用于体外处理骨髓移植物，清除其中免疫细胞，防止骨髓移植后产生移植物抗宿主反应（GVHR）。
为能在体内使用抗CAMPATH-1，Riechmann等构建了含不同类型人IgG亚类的大鼠F（ab′）2人IgG1、2、3、4Fc片段“嵌合抗体”，并比较了不同亚类嵌合抗体的CDC和ADCC效应。
结果显示，人IgGl、CH与小鼠抗CAMPATH-1F（ab′）2嵌合型抗体激活补体，溶解靶细胞的能力比较强（与小鼠抗CAMPATH-1相同），但该嵌合抗体介导的ADCC作用比天然抗体更强。
（二）重构抗体（reshapedantibody,RAb）RAb是指利用基因工程技术，将人抗体可变区（V）中互补决定簇（complementaritydeterminativeregion,CDR）序列改换成鼠源单抗CDR序列。
重构成既具有鼠源性单抗的特异性又保持抗体亲和力的人源化抗体。
RAb亦叫“改型抗体”，因其主要涉及CDR的“移植”，又可称为“CDR”移植抗体（CDRgraftingantibody）”。
RAb的产生和发展，使得多种特异的鼠源单抗有可能应用于临床治疗，包括通过人体免疫难以诱生的特异性的抗人抗原抗体，因而有诱人的前景。
尽管鼠人嵌合抗体有一些优点，但该类抗体中仍有近50%的成分来源于小鼠，在人体内应用时，仍有可能诱导产生HAMA。
从而限制嵌合抗体的反复使用。
为此许多学者都在试图减少鼠源蛋白在嵌合抗体内的含量。
Riechmann等将大鼠抗人淋巴细胞单抗CAMPATH-1的超变区基因置入单抗（IgG）的重链和轻链基因中，这种重构型单抗在人抗体可变区基因序列内嵌入了鼠源抗体超变区基因序列，通过置换3个发夹状环（loops）的鼠抗体超变区，为人类抗体提供了一个新的抗原结合部位。
为提高该重构型抗体与靶抗体的亲和力，作者还用苯丙氨酸（Phe）替换了第一个超变区中第27位的丝氨酸（Ser27→Phe）。
增加了该突变型单抗与CAMPATH-1抗原的结合力。
在人补体存在时，溶解人淋巴细胞的能力也增强。
1．重构抗体的分子设计运用序列分析及X线晶体衍射方法显示，抗体分子的V区是由CDR和骨架区（frameworkregion,FR）两部分构成。
重链V区（VH）和轻链V区（VL）各有3个CDR和4个FR。
6个CDR折叠成环，从V区的一端有外突出形成抗原结合位点，抗体的特异性和亲和力主要由其决定的，尤其是VH。
FR序列基本保守，在不同抗体间具有较高的同源性，同一抗体的FR可适用于不同抗原结合位点的移植。
抗体分子的上述结构特性提供了设计和构建RAb的基础。
众多研究表明，仅仅保留鼠源McAb的CDR是远远不够的，常常会导致人源化改形抗体亲和力急剧下降。
鼠源McAb的FR中存在一些重要的残基，它们对于正确有效形成抗原结合部位是有重要的作用，因此也应被保留以确保改形抗体最大限度地保留原抗体的亲和力，正确解决骨架区对其影响是成功的关键。
一般来说，首先应选择人源化改形抗体的FR模板，确定模板之后，应尽可能地确定FR中影响抗原结合特性的，而要保留重要的鼠源残基；随后根据FR模板，鼠源McAb的CDR和需要保留的重要鼠源残基来确定人源化改形抗体的氨基酸顺序并构建该基因，将该基因连接到合适的表达载体上，并表达人源化改形抗体分子。
设计RAbV区的关键在于选择合适的人抗体重链和轻链作为鼠CDR的移植框架，到目前为止有两种策略。
一种是选择并固定一种V区结构已知的人Ig作为RAb的通用FR，在构建V区时将鼠单抗FR中的某些特殊氨基酸残基置换人FR相应残基，通过反复调换直至亲和力恢复。
该策略费时，且选择鼠源单抗CDR移植时受到同源程度的限制，仅适合于未建立人抗体基因库时运用。
另一种策略是运用计算机分析比较人和鼠抗体V区核苷酸序列：
从已知抗体序列的数据库中选出与鼠抗体FR有最大同源性的人抗体FR，作为RAb的FR，并用计算机模拟分析人和鼠抗体V区的空间构象，确定特殊的氨基酸残基，将这些残基与CDR一起移植到人抗体FR上，这是目前常用的策略。
无论何种策略，均是充分利用FR序列在进化上的保守性，通过某些特殊氨基酸残基的“突变”来减少免疫原性，提高抗体亲和力之目的。
下面总结一下在选择正确的骨架区应遵循以下几点原则：
①从已知的人可变区数据库选择与亲本抗体同源性最高的序列，以最大可能维持原有的构象；②将骨架区内可影响抗原结合部位的氨基酸改为亲本鼠单抗的残基，这包括：
在立体构象中与CDR有接触的残基，它们涉及到抗原结合部位结构的形成；参与了VH-VL相互接触的残基，它们可影响CDR的相互位置；以及埋在功能区内部和外界接触很少的残基；③紧邻CDR两侧的骨架区序列往往比较重要。
另外，可变区N端数个残基，可能涉及与抗原结合。
2．抗体新的“人源化”方法近年来又提出了其他的一些可变区人源化的设计方案，包括：
表面残基人源化（resurfacing）和表位导向选择法（epitopeguidedselection）的表面残基人源化。
对已有抗体结构和序列的系统分析发现，人和鼠可变区的氨基酸残基的立体构象位置有98%是保守的，将一个表面残基改为一个相近的人的模式，不一定要改动很多氨基酸残基，鉴于抗原抗体反应仅涉及分子表面，因此有人提出将鼠单抗的可变区表面氨基酸残基人源化的构思。
有研究在构建N901（anti-CD56）时，发现人-鼠之间，在轻链仅有3个氨基酸不同，在重链边仅有7个氨基酸区别；而在构建Anti-B4时，发现人-鼠之间轻重链分别仅有6个和10个氨基酸残基区别，而在这16个残基中，仅发现有3个可影响CDR构型。
分别对这些残基进行修饰，就可以很好地维持改形抗体的亲和力。
但这方面报道尚不多。
对鼠单抗可变区基因序列进行较小变动，这样更有利于维持抗原结合功能，而对其人源化效果尚需进一步观察。
表位导向选择法：
以鼠单抗为模板，将鼠单抗轻链或重链可变区基因与人重链或轻链可变区基因库配对，形成杂合抗体库，用相应抗原进行筛选，选出能和鼠源配对并保留其结合活性的人重链或轻链可变区基因，再用所获人可变区基因与另一条链的人可变区基因库配对，筛选出完整的人可变区基因，这个方法的优点可得到完全人源化抗体。
3．重构抗体的基因构建在确定了需要保留的鼠源残基后，根据所选定的模板和原抗体可变区的氨基酸顺序就可设计出人源化改形抗体可变区的氨基酸顺序。
再根据氨基酸顺序，参照人抗体中各氨基酸使用的最大频率的密码子就可确定改形抗体可变区基因的核苷酸序列。
早期的研究在构建人源化改形抗体可变区基因时多采用寡核苷酸定点诱变技术，甚至全部化学合成该基因，这些方法费时费力成功率低，费用昂贵且需要所选作模板的人抗体基因。
现在均采用长引物重叠PCR技术合成人源化改形抗体可变区基因。
这样不仅使构建变得迅速、经济、简便和成功率高，而且可方便地在基因两端引入合适的酶切位点或其他核苷酸序列以便以后的克隆和表达。
4．改形抗体的特点和应用前景与嵌合抗体相比，改形抗体的免疫原性显著减少，这是因为改形抗体依据同源性原理选择FR后，减少了异源性蛋白质的部分，同时在将鼠源CDR移植于人FR的过程中丢失了许多抗独特型抗体能够识别的独特型结构，后者很可能在体内诱导人抗鼠抗体（HAMA）产生的那些抗原决定簇。
由于在构建RAb时联合应用了骨架修饰方法，使RAb亲和力明显提高，还可通过重构选择活性较高的IgC区而改善其效应功能。
目前已构建30余种针对不同抗原的RAb，有些已用于临床诊治并取得令人满意的效果，如消除肿瘤，延长器官移植的生存期，改善类风湿性关节炎，全身性脉管炎，感染性疾病及免疫紊乱性疾病的临床症状等。
虽然目前人源化改形抗体取得了这些成功，但还应该看到，想要达到最小的免疫原性，即最小限度地保留鼠源残基的问题还没有妥善解决；而且改形抗体主要存在亲和力下降问题，这些问题的解决均有待于对CDR、FR及抗原与抗体结合位点之间复杂的相互作用进一步深入研究。
（三）重组单链抗体（ScFv）又称Fv分子，因抗体分子量较大，在体内的穿透力差，不易进入组织中发挥作用，而用基因工程手段构建更小的具有结合抗原能力的抗体片段（Fv分子或单链蛋白），可避免这一限制。
结合抗原的单链蛋白由抗体VL区氨基酸序列和VH区序列经肽连接物（linker）连接而成。
此外，肽链连接物还可将药物、毒素或放射性核素与单链抗体蛋白相融合，可用于临床诊断（成像检查）和治疗。
最近，Chaudhary等成功地将抗TacFc基因与假单胞菌外毒素基因（PE40）重组到一起，经转染大肠杆菌，生产出单链免疫毒素“抗Tac（Fv）-PE40”，该分子可有效地杀伤IL-2Ra+细胞系，而对不表达IL-2Ra+的细胞系则无作用。
1．单链抗体的基因构建单链抗体与IgG不同，是通过连接肽将VL和CH连接而成的分子。
鼠源抗体的VH和VL的基因分别由4个相对恒定的骨架区（FR）和3个高度可变的抗原互补决定区（CDR），共同构成抗原结合位点，它决定了每一种抗体的特异性。
制备ScFv的关键是得到可变区基因，引物的设计非常重要，因此可以根据FR-１和FR-４的碱基组成和顺序分别合成扩增VH和VL基因的PCR引物。
用PCR技术从杂交瘤细胞的基因组DNA或其RNA逆转录后的cDNA中扩增出VH和VL基因，用编码寡核苷酸接头（linker）将两者连接成ScFv基因。
目前有两种拼接方法，一种是将接头设计在表达载体上，两端各有限制内切酶供VH和VL的插入。
另一种拼接方法是通过将接头的编码序列分别设计在扩增VH和VL引物中，用PCR直接合成ScFv基因，此方法被称为重叠延伸拼接法，这种方法简单易行，而且不必因第一种拼接法中设计内切酶位点而引入不必要的氨基酸残基。
将构建基因导入原核或真核表达载体中表达。
目前常用的接头为（Gly4Ser）3。
在ScFv中，接头承担了与CL和CH1稳定作用相同的功能，维持VH和VL间的构象。
接头必须使重、轻链可变区自由折叠，使抗原结合位点处于适当的构型。
在单链抗体基因构建中，单链抗体基因C末端可引入C-myc尾、组氨酸尾、脂类标签等，使表达产物更易于检测和纯化。
如引入亮氨酸拉链、半胱氨酸等结构可用于构建双价抗体分子与双特异抗体（bispecificantibody,BsAb）或双功能抗体。
单链抗体基因与其它基因如蛋白A、蛋白激酶、毒素等基因结合，还可构建成有新功能的抗体融合蛋白基因。
2.重组单链抗体的表达
（1）在大肠杆菌中表达：
目前重组单链抗体大多在大肠杆菌中表达，与真核表达系统相比，大肠杆菌不能对表达产物进行糖基化修饰，但目前尚无证据表明糖基化与抗原结合能力有直接关系。
尽管完整Ig已在大肠杆菌中获得表达，但活性抗体产量低。
相反，微生物系统适合抗体片段的产生，特别是Fab、Fv和ScFv。
重组单链抗体在大肠杆菌中的表达主要有三种形式：
①直接在细胞质中表达；②与其他菌体蛋白融合，表达融合蛋白；③分泌表达具有功能的单链抗体。
近来重组单链抗体的表达主要采用分泌表达方式。
重组单链抗体基因与引导分泌的信号肽Mel,OmpA,PelB,PheA等基因相连接，使表达产物分泌至大肠杆菌外周或培养液中，获得有活性的可溶性表达产物。
分泌型表达系统的优点在于：
直接产生功能性产物；细菌蛋白酶对产物降解大大降低。
重组单链抗体表达与其它外源基因表达一样，受到基因拷贝数、mRNA的产生速率、mRNA的稳定性和翻译效果、启动子类型、基因结构、诱导条件、宿主环境等因素的影响。
（2）在噬菌体内表达：
一种含有信号肽序列的噬菌体显示系统能用于克隆ScFv，并在大肠杆菌中，使ScFv基因与gpⅢ融合，以融合蛋白的形式表达于丝状噬菌体表面。
通过噬菌体呈现技术（phagedisplay）产生亲和力和特异性更强的ScFv。
3.重组单链抗体的应用具有结合特异性抗原作用的单链抗体蛋白分子量很小，便于连接其他辅助性物质，临床应用时有许多优点：
①在血清中比完整单抗或F（ab′）2片段能更快地被清除；②作为外源性白的免疫原性较低；③没有Fc段，不能与细胞（Fc受体阳性细胞）结合，在体内治疗时避免非特异性杀伤，成像定位检查时，能使图像更清晰；④能进入实体瘤周围的微循环，因而治疗实体瘤的效果优于完整抗体。
由于ScFv分子量小，免疫原性小，且易穿透致密的肿瘤屏障，进入实体瘤周围的微循环，缺乏Fc片段，去除Fc介导的受体结合，使得其快速地向肿瘤集中，因此通过与毒素基因重组，抗体将毒素定位于靶细胞，对靶细胞进行特异杀伤。
通过重组技术在抗体分子上联接毒素、酶以及细胞因子等，这些复合物对肿瘤细胞有特异杀伤作用，被称为免疫毒素，常用的毒素为绿脓杆菌外毒素，蓖麻毒素及白喉毒素，细胞因子中IL-2和TNF都显示了较好的效果。
单链抗体免疫毒素易于大量生产以满足临床治疗需要。
单链抗体在组织中清除速度快，去除Fc介导的受体结合，本底低，图像清晰，用于肿瘤的影像研究明显优于完整的抗体。
①“细胞内免疫”（intercellularimmunization）是在细胞内表达特异性识别某一蛋白抗体，干扰特定基因产物活性，例如，抗癌基因ras的单链抗体，在细胞浆表达后可阻断ras功能；抗艾滋病病毒外壳蛋白的ScFv可抑制HIV细胞内复制等；②在基础研究中，应用于抗原结合位点的高分辨率X射线晶体图研究，同时由于ScFv基因易于操作，也是研究基因结构与功能关系的理想系统，ScFv基因与编码一些已用于免疫试验的酶基因融合，可以大大提高检测的灵敏度。
另外，设计一段“亲和臂”与抗体片段共表达，是纯化抗体蛋白的一种非常有用的方法。
例如将5个组氨酸残基连到VH的C末端，进行固相金属离子亲和层析，或在抗体C末端融合葡萄球菌蛋白A，进行抗体的亲和层析等。
（四）Ig相关分子又称为免疫粘附素。
将抗体的部分片段（例如V区或C区）连接到与抗体无关的序列上（如毒素），就可创造出一些Ig相关分子。
例如用有治疗肿瘤价值的毒素或化疗药物取代抗体的Fc段，通过高变区结合特异性抗原，连接上的毒素可被直接运送到靶细胞表面，起“生物导弹”作用。
有人用多聚酶链反应快速克隆抗体可变区基因的方法，成功地在大肠杆菌中表达了一个含抗体可变区和绿脓杆菌外毒素片段的免疫毒素。
Williams等用酶置换了单抗的Fc段，构建了具有新的功能的Ig相关分子，可用于免疫测定。
也有人设想将限制性内切酶连接到抗体的可变区
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