基于斜投影结合HPLCUV分析滴眼液中的苯扎氯铵.docx

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基于斜投影结合HPLCUV分析滴眼液中的苯扎氯铵

普通本科毕业设计（论文）说明书

课题名称基于斜投影结合HPLC-UV分析滴眼液中的苯扎氯铵

摘要

通过高效液相色谱-紫外光谱联用获取苯扎氯铵标准品溶液和滴眼液样品三维数据，用MATLAB计算平台进行数据处理，构建标准品溶液中十二烷基二甲基苄基氯化铵（1227）的数据矩阵，并分别获取苯扎氯铵标准品溶液、滴眼液样品中不含有1227的背景数据矩阵；采集苯扎氯铵标准品溶液和滴眼液样品的紫外光谱数据。

利用斜投影算子建立含量计算模型，完成对市售滴眼液样品中苯扎氯铵含量的测定。

实验结果表明：

在1-20µg/mL浓度范围内，斜投影提取的十二烷基二甲基苄基氯化铵SKS值与对应浓度呈良好的线性关系（r>0.999）。

与高效液相检测结果对比，根据斜投影算法的市售滴眼液检测结果相对误差在0.100%-0.732%之间，精密度实验RSD在0.131%-0.156%之间，实验的回收率在99.41%-100.41%之间。

结果显示，通过斜投影算子建立的模型具有良好的稳健性，可准确检测低浓度苯扎氯铵的含量。

斜投影结合液相色谱-紫外光谱联用的方法具有分析速度快、操作简便、易于普及等优点。

在未来的日常药物分析和监督管理中有广阔的应用前景。

关键词：

斜投影；HPLC-UV；苯扎氯铵；滴眼液

Abstract

ByusingHPLC-UVgetbenzalkoniumchloridestandardsolutionandeyedropssamplethree-dimensionaldata,thecomputingplatformfordataprocessingusingMATLAB,tobuildbenzalkoniumchloridestandardsolutionindodecyldimethylbenzylchlorideAmmonium（1227）ofthedatamatrix,respectively,toobtainbenzalkoniumchloridestandardsolution,eyedropssamplewhichdoesnotcontainbackgrounddatamatrixof1227;collectionbenzalkoniumchloridestandardsolutionandeyedropssampleUVspectradata.Theuseofobliqueprojectionoperatortoestablishcontentmodel,completedeterminationofthecommerciallyavailableeyedropssamplebenzalkoniumchloridecontent.Theresultsshowthat:

inthe1-20μg/mLconcentrationrange,dodecyldimethylbenzylammoniumchlorideSKSvaluecorrespondstotheconcentrationoftheextractedobliqueprojectionshowedagoodlinearrelationship（r>0.999）.TheresultscontrastwithHPLCdetection,basedonacommerciallyavailableeyedropsobliqueprojectionalgorithmtestresultsrelativeerrorbetween0.100%-0.732%precisionexperimentsRSDbetween0.131%-0.156%,recoveryexperimentsat99.41%-100.41%between.Theresultsshowedthatthemodelestablishedbytheobliqueprojectionoperatorhasgoodstability,canaccuratelydetectlowconcentrationsofbenzalkoniumchloridecontent.themethodofObliqueProjectioncombinedwithHPLC-UVhasgreatadvantages,suchasanalysisfast,easytooperate,easytospread.Therearebroadprospectsinthenextroutinedruganalysisandsupervisionandmanagement.

Keywords:

obliqueprojection；HPLC-UV;benzalkoniumchloride;drops

目录

摘要I

AbstractII

目录III

1绪论1

1.1国内外对防腐剂的研究现状分析及发展动态1

1.1.1高效液相色谱法（HPLC）1

1.1.2气相色谱法（GC）2

1.1.3紫外分光光度法3

1.1.4薄层层析法3

1.1.5其他方法3

1.2测定对象防腐剂的选择4

1.3论文研究的目的及意义4

1.4本课题研究的内容5

1.5本课题的创新点5

2相关理论知识6

2.1斜投影原理及算法6

2.1.1斜投影原理6

2.1.2斜投影算法7

2.2MATLAB程序软件8

3实验部分9

3.1实验仪器与药品9

3.2实验方法9

3.2.1研究流程9

3.2.2.1采集苯扎氯铵标准品和市售滴眼液紫外光谱数据9

3.2.2.2苯扎氯铵标准品溶液液相色谱-紫外光谱联用数据的获取10

3.2.2.3采集不同市售滴眼液样品溶液的紫外光谱数据10

3.2.2.4市售滴眼液样品液相-紫外联用色谱光谱数据的获取11

3.2.2.5高效液相色谱法获取苯扎氯铵标准品和市售滴眼液色谱数据11

3.2.3精密度和加标回收率实验11

3.2.4数据的处理方法12

4结果与讨论14

4.1.1比较苯扎氯铵标准品溶液和市售滴眼液光谱数据14

4.1.2液相色谱-紫外光谱联用得到的苯扎氯铵标准品溶液三维数据15

4.1.3各个浓度标准品溶液与SKS值的线性方程15

4.1.4市售滴眼液样品的液相-紫外联用色谱光谱三维数据17

4.2斜投影模型计算滴眼液中1227含量17

4.3高效液相色谱法对滴眼液中1227的测定结果18

4.4斜投影算法结果和高效液相结果对比20

4.5精密度和加标回收率实验结果20

5结论与展望22

5.1结论22

5.2展望22

致谢23

参考文献24

1绪论

日常生活中越来越多的人由于不注重爱护眼睛，长期学习或工作导致眼睛疲劳。

为了减缓眼部疲劳，滴眼液普遍应用于我们的日常生活中，也成为更多人依赖的对象。

滴眼液开封之后不能一次性使用完，就容易被微生物污染。

于是多数滴眼液或多或少会添加一定剂量的防腐剂来抑制微生物的生长繁殖。

长期使用含有防腐剂的滴眼液会损害人体的眼角膜细胞，所以人们对滴眼液中防腐剂的添加剂量也越来越关注。

为使滴眼液使用者不受到过量防腐剂的危害，国内外对滴眼液中防腐剂添加剂量的控制也越来越严格。

传统的防腐剂分析方法有高效液相色谱法，气相色谱法，薄层层析法等，高效液相色谱法具有高效、准确、快速等分析优点，但是仪器价格昂贵，操作较繁琐。

气相色谱法具有快速分析的优点，但是检测具有高挥发性质的物质时受到了限制。

薄层层析法对设备仪器的要求不高，操作起来较简便，而薄层层析法需要对待测物进行复杂的前期预处理。

因此，找到一种快速简便，准确且耗材低的滴眼液中防腐剂分析方法具有重要的现实意义。

1.1国内外对防腐剂的分析研究现状及发展动态

随着科学技术的进步，人们对科研不断尝试和创新，以及近年结合计算机的应用，色谱分析在食品、药物、化妆品等成分含量的分析得到了迅速的发展[1]。

色谱技术具有分离效率高、重复性良好、样品用量少、灵敏度高、应用范围广等特点。

随着人们对分析的要求不断提高，色谱分析被应用到更多的领域当中，色谱分析在分析化学中已占有独特的地位。

色谱分析方法也是食品、药品、化妆品等中防腐剂含量检测的主要手段。

而近年来，随着分析仪器不断改进、更新及信息技术的飞速发展，要找到一种快速简便且耗材低的分析手段成为人们关注的焦点。

分析化学已经不再是单纯地从仪器和物质上长时间和大量损耗资源来获取有关实验数据，而是逐步发展成为化学信息科学[2]。

化学计量学是结合数学、统计学、计算机科学的理论和方法，优化化学量测过程，并可以从化学量测数据中把有用的化学信息最大限度地提取出来[3]。

因此，化学计量学在分析化学领域中发挥着越来越重要的作用。

目前对日用品和药品中防腐剂的检测方法多种多样，而比较常用的方法有：

高效液相色谱法（HPLC）、气相色谱法（GC）、紫外分光光度法、薄层层析法。

1.1.1高效液相色谱法（HPLC）

在20世纪70年代，高效液相色谱法被应用于分析化学领域中，并开始慢慢发展起来的一种高效、快速、准确的分离分析技术。

液相色谱法是指选取液体作为流动相的一种色谱分离分析技术。

它是通过混合物中各组分溶解度不同在两相间进行分配，不同物质在固定相中有不同的停滞时间从而进行分离。

在技术上采用了高压泵、高效固定相和高灵敏度检测器，实现了分析速度快，分离效率高和操作自动化。

根据大多数文献报道，在对药物防腐剂含量的监督和检测分析中，高效液相色谱法是目前人们普遍使用的方法，该方法的快速准确也普遍被人们认可。

这种方法常使用甲醇-水进行超声提取，以甲醇-磷酸或者乙腈-乙酸铵进行不同的组合和配比来作为流动相。

由于大多数防腐剂于紫外波段有特征响应，所以常采用紫外检测器进行检测。

根据不同样品中物质流出的不同时间和相同物质不同含量响应值的不同进行对防腐剂含量的测定。

刘吉起等[4]使用RP18色谱柱，用乙腈+水+三氟乙酸（70+29.9+0.1）作为流动相，紫外检测器的波长为263nm,完成了复方消毒剂中防腐剂苯扎氯铵含量的测定，RSD小于5%，回收率为92.0%-96.4%。

刘艳琴等[5]采用了高效液相色谱-二极管列阵检测器（HPLC-DAD）的方法，采用0.5%甲酸的甲醇超声提取，使用色谱柱为CAPCELLPAKSCX（250*4.6mm,5µm）柱进行分离，乙酸铵水溶液+乙腈（pH为4.0）来作为流动相，检测波长为260nm。

在这些条件下同时进行测定化妆品中的3种苯扎氯铵同系物的含量。

该方法得出的线性拟合度良好，加标回收和相对标准偏差也呈现良好的效果，方法快速，准确并可以同时测定出化妆品中3中苯扎氯铵同系物。

黄志元等[6]用HypersilCN为色谱柱，使用磷酸二氢钠-乙腈（57：

4）并调节pH至7.0作为流动相来检测硝酸毛果芸香碱中苯扎氯铵的含量，结果显示苯扎氯铵在一定的浓度范围内呈良好的线性关系，r=0.9999，回收率也达到99.7%-101.9%，RSD=0.66%，使用该法操作简单，准确并且灵敏度高。

宴菊娇等[7]利用C18柱，再以醋酸铵，冰醋酸-乙腈不同的配比来作为流动相，完成了对依诺沙星滴眼液中防腐剂苯扎溴铵和苯扎氯铵含量的测定，得出的线性和回收率也达到满意的效果。

高效液相色谱法操作简便，分离效果好，精密度高，可满足一般检测的需要[8]。

但是高效液法的前期预处理较复杂，并且耗时长，价格昂贵，仪器笨重，使日常药品，食品现场检测应用受到了一定的阻碍。

1.1.2气相色谱法（GC）

气相色谱法是采用气体作为流动相的一种色谱分析方法，气相色谱法具有高分离效能，高检测性能、分析速度快的特征，它在分析化学中也成为一种重要的分析方法。

它的分离原理是根据各个组分具有不同挥发性质在两相间进行分配，从而对组分进行分离。

但对于一些热稳定性差和挥发性高的物质，用气相色谱法进行分析就会有局限性，不能达到满意的分离效果。

侯瑞霞等[9]用弱极性毛细管色谱柱DB-5分离，FID进行检测，成了食品中11种防腐剂的同时测定，首先对样品进行酸化，用乙酸乙酯提取，结果显示防腐剂在一定的浓度范围内具有良好的线性关系，相关系数r达到了0.999以上，这11种食品中防腐剂的检出限也较低，平均回收率达到70.1%-98.2%，该方法快速，检测效率较高。

马淑飞等[10]采用FID作为检测器，温度为220度，载气为氢气，利用聚乙二醇（PEG）-20M填充柱实现了对复方托卡吡胺滴眼液中三氯叔丁醇含量的测定，该法得出三氯叔丁醇在0.5423-4.5195mg/mL范围内线性良好，RSD和平均回收率也达到了满意的效果。

1.1.3紫外分光光度法

紫外分光光度法在当今的分析化学中己经得到普遍应用，由于不用对待测液进行复杂的预处理和分析，分析过程更加快速简便，且所用时间少、耗材低，在食品和药物检测中得到了更多人的认可。

它是根据朗伯比尔定律，对在紫外波段范围内不同波长下有吸收峰的物质进行检测。

但朗伯-比尔定律只适用于被测组分特征峰不受其他组分干扰的情况，在检测多组分复杂体系时，紫外分光光度法受到了很大限制。

徐新等[11]采用紫外分光光度法测定滴眼液中苯扎溴铵的含量。

以262nm为测定波长来进行对苯扎溴铵吸光度的测定。

结果显示苯扎溴铵不受滴眼液样品中其他组分的干扰，波峰不出现重叠现象。

苯扎溴铵在0.1-0.6mg/mL之间呈良好的线性关系，r达到了0.998，平均回收率为99.7%，RSD为0.45%，该方法快速简便准确，不用前期预处理，耗材和耗时都较短。

寻找对日用品，药品食品的快速简便、准确而又不耗材的分析手段一直是人们最关注的热点，紫外分光光度法正好满足了这一需求。

然而大多数的被测物中所含组分复杂，容易出现各组分吸收峰严重重叠。

因此，多数文献文献报道中对于防腐剂含量的测定，采用紫外分光光度法的报道较少。

1.1.4薄层层析法

薄层层析法能进行多组分的定性分析，且不需特殊仪器，便于推广，也可以用于检测苯甲酸及其盐类防腐剂，但是只限于测定一两种防腐剂[12]。

在定量分析方面也比不如高效液相色谱法准确。

有相关文献[13]报道这种方法可以同时进行多种防腐剂的含量测定，但是步骤比较复杂且前期预处理过程相当繁琐。

然而，王萍[14]建立了一种同时测定化妆品中8种不同防腐剂的方法，用于不同类型化妆品中常用防腐剂的定性及半定量的测定方法，该法只需一种展开剂无需显色剂就可以对苯甲酸、水杨酸等8种防腐剂的定性和半定量分析，结果呈现良好的精密度和回收率，但该方法对于定量分析还需要有进一步的研究。

因此薄层层析法在定量分析中有一定的缺陷，且在前期处理时对展开剂有一定的限制，在较高的分析要求下薄层层析法也受到了一定的阻碍。

1.1.5其他方法

检测日用品及药品中的防腐剂，除了上述所列举的几种方法还有报道较少的其他方法，如毛细管电泳法[15]，伏安法[16]，衍生气相色谱法[17]等，但是这些方法重现性，选择性和灵敏度等还有待提高，在分析要求较高的情况下受到了一定的阻碍。

国内外对防腐剂的研究报导很多，方法也是多种多样。

但是在这些方法中，大多数都是采用一定的方式将待测物的单一组分从待测物混合体系中提取或者分离后对其进行含量测定。

面临着分析效率，抗干扰性，前期预处理和仪器昂贵等多种困扰，分析成本大已经不能满足形势的发展需求。

近年来，涉及药品中防腐剂检测方面的大多数文献也仅集中于前期处理方法的改进、色谱柱的变化和仪器设备的更新等等。

因此，面对药品中防腐剂的检测技术研究还需要更加广泛深入地持续开展下去。

1.2测定对象防腐剂的选择

根据多数文献的报道情况，应用于滴眼液中的防腐剂多种多样。

但是大多数药品说明书都不会提及添加防腐剂的种类以及添加剂量。

这对滴眼液使用者造成严重威胁，对药品的质量监督造成阻碍。

苯扎氯铵呈蜡状固体或胶状体，易溶于水，微溶于乙醇。

具有芳香气，味其苦，振摇时能产生大量气泡，性质稳定，耐光耐压耐热无挥发性，在空气中容易吸潮。

苯扎氯铵在水溶液中解离成阳离子活性基团，具有洁净，杀菌，消毒防腐作用。

由于它比较安全和性质稳定的特点，是滴眼液中使用较多的一类防腐剂。

有研究表明[18]，防腐剂苯扎氯铵对眼角膜会造成伤害，长期使用含有苯扎氯铵的滴眼液会导致眼泪腺分泌受损。

为使人们免受长期不适当使用含有过量苯扎氯铵的滴眼液所带来的伤害。

本文选择苯扎氯铵作为研究对象进行含量测定。

苯扎氯铵（BAC）又称为洁尔灭，它是由3种正烷基取代基（C12，C14，C16）二甲基苄基氯化铵同系物组成的混合物（国产的苯扎氯铵几乎不含有C16取代基二甲基苄基氯化铵（1627），主要成分是C12取代基二甲基苄基氯化铵（1227）,C14取代基二甲基苄基氯化铵（1427）），对其进行含量测定时会因对照品与滴眼液产品中同系物组成不一致而对分析组分造成困扰；另一方面，滴眼液生产单位所用的苯扎氯铵中三种烷基比例未知，不能用某烷基取代基苄基氯化铵的百分比反推BAC的含量。

因此本文以测定滴眼液样品中苯扎氯铵混合物中十二烷基二甲基苄基氯化铵的含量，来代替苯扎氯铵的含量从而完成苯扎氯铵的定量分析。

1.3论文研究的目的及意义

随着化学计量学的发展，借助于多元分析方法，二维光谱可以用于复杂体系的定性和定量分析。

葛军等[19]采用多变量体系中纯信号的分析方法，通过光谱数据的转换，在Matlab软件平台进行数据处理，通过斜投影算子建立模型，得到分析样本中被测组分的纯光谱数据，并对被测组分的光谱信号进行分析得到被测组分的含量，斜投影算法可以用最简单的方法获取最满意的结果。

本文用斜投影结合HPLC-UV联用的方法检测滴眼液中苯扎氯铵的含量，通过建立的斜投影模型，样品不需要复杂的前期处理，只需要对待测样品进行一定倍数的稀释，并获取其紫外光谱数据，再利用HPLC-UV联用得到的三维数据就可以完成对混合体系中被测单一组分的含量分析。

本方法可以降低分析时间及仪器、材料的损耗。

分析效率大大提高，可以达到方便，现场快速检测的需要。

对未来滴眼液中成分的含量检测提供一种便捷手段。

研究对提高人们对眼睛的保护意识及保障人类的眼部健康具有重要的意义。

1.4本课题研究的内容

本课题以测定滴眼液中常见防腐剂苯扎氯铵研究案例来验证斜投影-结合HPLC-UV方法的可行性。

上述提及到苯扎氯铵为三种同系物的混合物，所以本文以测定滴眼液样品中苯扎氯铵混合物中十二烷基二甲基苄基氯化铵的含量来代替苯扎氯铵的含量。

研究主要内容如下：

（1）以高效液相色谱-紫外光谱连用，紫外可见分光光谱仪为数据采集平台，以斜投影算法为理论基础，以苯扎氯铵标准品溶液中十二烷甲基二甲基苄基氯化铵为（以下简称1227）分析对象，液相-紫外连用获得苯扎氯铵标准品溶液的波长、时间、吸光度三维数据，紫外分光光谱仪采集苯扎氯铵的紫外光谱数据，用MATLAB计算平台对采集的数据进行处理，利用斜投影算子，得到不同浓度苯扎氯铵中（1227）的SKS值，建立（1227）SKS值与对应浓度的线性关系。

（2）根据七种不同市售复杂滴眼液体系，利用液相-紫外联用分别采集不同滴眼液的背景数据矩阵（即不含有（1227）），利用紫外分光光谱仪分别采集不同市售滴眼液的紫外光谱数据，以Matlab为计算平台，斜投影算法为理论基础，计算得到滴眼液样品中（1227）的SKS值。

再由上步得到的线性关系求得滴眼液中（1227）的含量值。

（3）以苯扎氯铵标准品为研究对象，利用高效液相色谱采集不同浓度下苯扎氯铵标准品溶液的色谱数据，找出（1227）对应的保留时间，按峰面积外标法做液相条件下不同浓度（1227）与峰面积的线性方程。

（4）根据七种不同市售复杂滴眼液体系，利用高效液相色谱为分析仪器，采集不同滴眼液的色谱图，找出滴眼液中（1227）对应的保留时间，带入已经做好的（1227）线性方程，得到每种样品（1227）的含量。

（5）斜投影算法对市售滴眼液样品中（1227）含量的计算结果和高效液相得出的结果进行对比，计算每种样品的相对误差。

再者，利用斜投影算法，对市售滴眼液样品的重复性和加标回收率实验结果进行分析，进一步验证斜投影算法的有效性和准确性。

1.5本课题的创新点

课题依据提出的一种新的化学计量学计算判据，建立基于“斜投影结合HPLC-UV”分析滴眼液中防腐剂苯扎氯铵含量的快速检测方法。

该方法简单、快速、准确，并可推广到不同背景样本中防腐剂的分析，并且目前在该学科领域内查阅到很少类似文献和研究报告。

基于斜投影结合HPLC-UV，通过建立可观、稳健的模型后，只要对样品进行一定的稀释后,采集待测样品的紫外吸收光谱数据，利用斜投影模型就可以对样品混合体系中单一组分的含量进行快速检测混合体系中单一组分的含量，对未来的药物分析具有重大的意义。

2相关理论知识

2.1斜投影原理及算法

2.1.1斜投影原理

投影分为两种，一种是正交投影，一种是斜投影。

正交投影可以表示为一个向量V沿着两个正交平行方向的向量到另一个空间的投影V1，那么另V1所在的另一空间是由两个子集S和H张成的一个闭合子空间，并且s和h可以满足从V中所观察到的数据张成的闭合子空间V1,那么V1就是s和h之和，假如沿着的方向向量不再正交时的投影即为斜投影。

也就是说正交投影只是斜投影的一种特殊情况。

简单来说斜投影描述的是向量或者矩阵沿着一个子空间到另一空间的投影[20]，它是根据正交投影理论演变而来的。

正交投影的简单几何意义如图1和图2。

图1正交投影几何图

图2斜投影几何图

2.1.2斜投影算法

斜投影算法是根据斜投影理论发展成为的一种分析方法，它应用的原理和斜投影的理论是一样的。

一份分析样本所含有的组分比较多，体系比较复杂。

现在以数据空间来描述复杂体系中的多变量体系，把数据空间用M来描述，数据空间被划成两部分，由两部分来构成数据空间M,一部分是由含有被测组分所张成的子空间S，另一部分是由不含有被测组分张成的其他相邻的子空间H。

S是混合体系中的被测组分的信号，H是表示混合物中不含有被测组分的背景信号。

所以数据空间这可这样来表述:

要从复杂体系中把被测组分分离出来，就需要构建一个纯信号分离的模型，通过构建的模型，就可以从M中把被测组分S的信号提取出来。

再通过对分离出来的纯信号S进行计算就可以得到被测组分的含量为：

那么可以从混合体系中把被测组分纯信号S分离出来的模型就是斜投影算子E:

其中：

上标T代表矩阵的转置，PH是沿着子空间H到子空间S的投影算子，C为被测组分纯信号的含量值，I为与PH维数相同的单位矩阵，S被测组分的向量张成的子空间（即被测组分光谱数据），s被测组分的单位向量，H为不含被测组分的向量张成的相邻子空间（即背景光谱数据）。

2.2MATLAB程序软件

MATLAB（MatrixLaboratory）是美国MathWorks公司自80年代中期推出的一种数学软件，它是一种用于算法开发、数据可视化、数据分析以及数值计算的高级技术计算语言[21]，它是1984年由美国MathWorks公司发布的主要面对科学计算、可视化及交互式程序设计的高科技计算环境。

化学计量学是化学的一门分支学科[22]，它可以通过MATLAB软件来实现对数据的处理达到选取数据的最优化，得到有效的数据，为实验过程数据的整理和选取