血清蛋白质的分离纯化与鉴定.docx

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血清蛋白质的分离纯化与鉴定

血清蛋白质的分离纯化与鉴定

刘欢1张唯2赵澜2彭垠婷2徐波2郭小李2

（1．生化专业细胞生物学51041300069导师：

张红锋;2．华东师范大学生命科学学院）

摘要：

通过系统的生化制备与分析实验，让学生基本掌握了包括脱盐、亲和层析、醋酸纤维薄膜电泳、SDS-PAGE、HPLC和冷冻干燥在内的生化技术。

从而为以后的科研工作打好基础。

关键词：

层析；电泳；SDS-PAGE

Abstract:

Bydoingbiochemichalpreparingandanalyzingexperiment,technologiessuchasproteinconcentrationdetecting,enzymeactivitytesting,chromatography,acetategreenelectrophoresis,HPLC,SDS-PAGEandotherbiotechnologicaltechniquesaremastered.Studentsaremadequalifiedtotheirresearchwork.

Keywords:

chromatography;electrophoresis;SDS-PAGE

一、前言

生命物质的制备和分析是现代生物化学中必不可少且又非常实用的技术。

本实验通过对兔血清蛋白的分离，让我们基本掌握常用的技术，初步了解了纯化技术的整体步骤和整个生化技术的整体流程，为我们以后自己分离纯化蛋白质产物建立了一个基本的概念，以及为以后的研究工作打下基础。

这些技术都是常用而成熟的技术，但是一个多世纪以来，尽管生物技术有了飞速发展，它们仍一直在发挥着重要的，不可替代的作用。

这些技术包括：

（一）．蛋白质检测技术——电泳技术

Hardy[1，2，3]发现，许多生物胶体，如蛋白质、酶等有特征的电泳迁移率（electrophoreticmobilities）。

此迁移率在很大程度上取决于溶液的pH。

因此利用电泳特征作为对物质的鉴定引起人们广泛的兴趣。

20世纪的20年代和30年代，电泳理论和实践有了很大的发展。

Tiselius教授首先证明了血清是由白蛋白，α、β和γ球蛋白组成的[4]。

人血清蛋白用界面移动方法分离的最佳条件是0.1mol/L（pH8.6）的巴比妥缓冲液，此时白蛋白具有最快的迁移速度，接着依次为α1、α2、β和γ球蛋白[5~8]。

生物大分子如蛋白质、核酸、多糖等常以颗粒分散在溶液中，它们的净电荷取决于介质的H+浓度或与其他大分子的相互作用。

在电场中，带电颗粒向阴极或阳极迁移，迁移的方向取决于它们带电的符号，这种迁移现象即所谓电泳。

迁移的方式目前可分为三类：

根据分子尺寸大小、分子所带的电荷或分子的生物学与化学特征。

电泳迁移率（mobility）m规定为在电位梯度E的影响下，颗粒在时间t中的迁移距离d。

聚丙烯酰胺凝胶（plyacrylamidegel,PAG）是由丙烯酰胺（acrylamide）和交联试剂N,N＇-甲叉双丙烯酰胺（N,N＇-methylenebisacrylamide）在有引发剂和增速剂的情况下聚合而成的。

聚丙烯酰胺的单体形成长链，由N,N＇-甲叉双丙烯酰胺的双功能基团和链末端的自由功能基团反应而发生交联。

其化学结构已经清楚[9]。

聚丙烯酰胺的特性，包括其机械性能、弹性、透明度、粘着度以及孔径大小均取决于两个重要的参数T和C。

T是两个单体的总百分浓度。

C是与总浓度有关的交联百分浓度。

Hjerten教授[10]在1962年引入以下两个公式来进行计算。

T=（a+b）/m·100（%）

C=b/（a+b）·100（%）

A为丙烯酰胺的克数（g），b为N,N＇-甲叉双丙烯酰胺的克数（g），m为水或缓冲液的终体积（ml）。

其中a和b的比例是很重要的[11]。

PAGE电泳根据原理，需要在以下方面做选择：

1）pH的选择考虑原则有：

合适的分离胶缓冲系统、先导离子、尾随离子、浓缩胶缓冲系统、反向离子及电泳缓冲液[12,13]。

2）离子强度的选择。

一般来说，离子强度在0.01~0.1mol/L[14],最常用的为0.05mol/L[15]。

3）凝胶浓度的选择。

浓度太大则孔径较小，样品留在加样位置；太小则不能很好分离。

所以必须通过实验来选择最佳的浓度。

4）分子量的测定。

1964年Feerguson[16]首先在淀粉凝胶中证明了蛋白质分子的迁移率m的对数或相对迁移率Rf的对数对凝胶浓度T%作图，可以得到一条直线。

这个现象接着在1968年由Hedrick和Smith[17]在聚丙烯酰胺凝胶中证实。

SDS-PAGE技术首先在1967年由Shapiro[18]等建立，1969年由Weber和Osborn[19]进一步完善。

他们发现在样品介质和聚丙烯酰胺凝胶中加入离子去污剂和强还原剂后，蛋白质亚基的电泳迁移率主要取决于亚基分子量的大小，而电荷因素可以被忽略。

SDS是一种阴离子去污剂，作为变性剂和助溶性试剂，它能断裂分子内和分子间的轻键，使分子去折叠，破坏蛋白质分子的二级和三级结构。

强还原剂，如巯基乙醇（β-mercaptoethanal）和二硫苏糖醇（dithiothreitol,DTT）则能使半胱氨酸残基之间的二硫键断裂，消除了分子间原有的电荷差异。

（二）．蛋白质的分离提取

蛋白质是一种极具多相性的生物大分子，离开其天然环境，蛋白质分子极不稳定，在细胞中和抽提液中的蛋白质的性状也不尽相同。

蛋白质有多种类型，通过不同的方法我们可区分为可溶性蛋白、膜结合蛋白、具有催化功能的蛋白或结构蛋白及转录调节蛋白。

从正常生物基质中提取各种蛋白质均需要有特定的条件。

如果不能满足这一条件，蛋白将很快的失去生物学活性，其生物半衰期也将迅速降低。

因此，在蛋白质的特性研究中，确定提取条件是一个关键问题。

在不同实验中遇到的困难也各不相同，有些式样中的困难是如何维持酶的活性。

在不同实验中要针对不同的情况来解决不同的问题。

然而对蛋白质研究而言却有着一些共同的参数。

1）.缓冲液。

缓冲液可以抗衡蛋白质溶液中的pH值的改变，选择合适的缓冲液对于维持一定pH值下蛋白质的稳定及保证实验的重复性十分重要[20,21]。

a.应对pKa相近的一些缓冲液进行实验，以避免有的缓冲液与所研究的蛋白质之间发生不良的相互作用[22]。

b.当选定一种缓冲溶液后，一般使用其最低的浓度以避免非特异性的离子强度的影响。

通常以50mmol/L的缓冲液浓度作为实验的起始浓度。

c.当缓冲液pKa值的变化超过一个1pH单位时其有效的缓冲能力明显降低。

而许多酶在极限pH值时往往发生不可逆的变性[23]。

d.大多数动物细胞在37℃的生理状况下的pH值为7.0~7.5，而在温度下降至接近0℃时可达8.0[24]。

e.要根据所选用的分离方法选用缓冲溶液：

凝胶过滤方法大多数缓冲液均可适用。

阴离子交换层析，阳离子缓冲液首选Tris缓冲液。

阳离子交换和羟基磷灰石层析，阴离子缓冲液首选磷酸盐缓冲液[22]。

f.混合缓冲液在一定的离子强度下往往具有更宽的缓冲范围[25]。

g.在低温时缓冲液和冰点溶剂的情况可参考文献[26]。

h.所采用的化学试剂应该达到试剂级或更高纯度。

2）盐、金属离子和螯合剂

必须保证保持酶活性所需的离子。

同时用螯合剂来螯合对酶保存不利的金属离子。

3）还原剂

可以添加一定还原剂来保证酶的还原环境。

4）去垢剂

用适当浓度的去垢剂来抽提、沉淀蛋白。

也必须选择合适的浓度。

5）其他条件

包括表面效应、温度、储存条件等。

同时可以用蛋白酶抑制剂来去除蛋白酶对目的蛋白的降解。

常用的抑制剂有：

PMSF、EDTA、pepstatin、leupeptin、aprotinin等。

为了纯化细胞蛋白质，采用有效的方法进行细胞破碎和固液分离是必要的。

它是全过程的第一步，通常是将处于细胞不同位置的待纯化蛋白释放出来，溶入已知成分的溶液内。

该步骤是目的蛋白初级分离纯化阶段的重要环节，它直接影响产物的回收率，也可能影响产物的纯度。

目前建立很多破碎细胞，释放细胞内容物的方法。

根据作用方式不同，基本可以分为两大类：

机械法和非机械法。

此类方法和原理可以参看文献[27]和1990年出版的酶学方法（英文）182卷。

（三）蛋白质分离纯化技术

蛋白质分离纯化除了简单的离心、沉淀等方法以外，目前常用和最为有效的方法是层析技术，包括离子交换层析、凝胶过滤层析、亲和层析以及由此技术延伸的HPLC等技术。

1.离子交换层析在纯化蛋白质的层析手段中使用最为广泛。

它对蛋白质的分辨率高，操作简单，重复性好，成本低。

此方法适合于蛋白质粗提物的初始纯化。

a）蛋白质的等电点是进行离子交换层析的重要依据。

b）离子交换剂与蛋白质的结合。

离子交换剂以自身所带相反电荷与蛋白质的净电荷结合。

c）蛋白质纯化的一般程序。

蛋白质溶液进入离子交换柱后，与离子交换树脂无亲和力的蛋白质被洗脱。

d）常用蛋白质洗脱策略。

常用方法是加大反荷离子的浓度。

e）不同反荷离子对洗脱的影响。

f）其他蛋白质洗脱策略。

离子交换时改变液相中缓冲体系的pH值是一种降低蛋白质与树脂亲和力的办法。

g）缓冲液。

离子交换用的缓冲液必须慎重选择，若缓冲能力不够强，导致液相pH值的波动，会影响蛋白质与树脂的结合。

利用离子交换层析纯化蛋白质在一开始时应该作好两个决定：

选择最佳的离子交换树脂和缓冲体系；如何洗脱蛋白质。

2.凝胶过滤层析又称为大小排阻、凝胶排阻、分子筛或凝胶过滤层析[28,29]。

这种方法利用分级分离，明显降低了因不可逆结合所造成的蛋白质损失和失活。

此外，可利用此方法更换蛋白质的缓冲液活降低缓冲液的离子强度。

纯化一个分子量较大的蛋白质。

纯化的第一步可以使用凝胶过滤层析。

溶质分子在移动相和固定相之间的分配系数Kd来表示凝胶过滤层析的特性：

Kd=（Ve-Vo）/Vi。

凝胶过滤层析还可以运用于：

分子量测定，去除低分子量的杂质，从二聚体和其他寡聚体中分离目的蛋白，更换蛋白质的缓冲液，研究蛋白质与配基的结合[30,31]等。

3.亲和层析是一类纯化方法，它包含各种各样的形式，但其共同特征是均以蛋白质和结合在介质上的配基间的特异亲和力为工作基础。

配基可以是生物学特异的，例如一个肽、一个抗体、一个底物、一个抑制剂、一个辅酶或核酸等；配基也可以是具有相对特异相互作用的凝集素、染料或疏水分子等。

很多情况下，蛋白质和某些生物大分子的生物学功能在于它们能够特异地和可逆地与相应配基相互作用。

所以说，亲和层析选择性强、纯化效率高，常常可以一步获得满意的纯化效果。

因为它应用的是生物特异性而不是依赖于物理化学性质，故常用于分离低浓度的蛋白质。

（四）蛋白质的分析方法。

我们得到了很纯的蛋白后就要对其进行一些性质的测定。

本实验我们主要测定了蛋白的浓度、酶活和米氏常数等性质。

1）考马斯亮蓝能与蛋白质的疏水微区相结合[32]，这种结合具有高敏感性。

考马斯亮蓝G250的磷酸溶液呈棕红色，最大吸收峰在465nm。

当它与蛋白质结合形成复合物时呈蓝色，其最大吸收峰改变为595nm，考马斯亮蓝G250-蛋白质复合物的高消光效应导致了蛋白质定量测定的高敏感度。

在一定范围内，考马斯亮蓝G250-蛋白质复合物呈色后，在595nm下，吸光度与蛋白质含量呈线形关系，故可以用于蛋白质的测定。

样品蛋白质含量应该在10-100μg为宜。

一些阳离子和乙醇对测定无影响，而大量的去污剂会严重干扰实验[33,34]。

2）在一定发pH和温度下，待测液中的碱性磷酸酶作用于基质中的磷酸苯二钠，使之水解放出酚。

酚在碱性溶液中与4-氨基安替比林作用并经铁氰化钾氰化，生成红色醌类化合物，根据红色深浅可以测定酶活力高低，从而计算出酶的活力单位。

每克组织蛋白在37℃与基质作用15min产生1mg酚作为一个活力单位。

影响酶促反应的主要因素包括pH、温度、激活剂与抑制剂等[35]。

磷酸苯二钠+H2OAKP苯酚+磷酸氢二钠

4-氨基安替比林+苯酚显色剂（OH-）红色醌衍生物

3）1913年前后，Michaelis和Menten在前人工作的基础上，做了大量的定量研究，积累了足够的实验证据，从而提出酶促动力学的基本原理，并归纳为一个数学式加以表达：

v=Vmax[S]/（Km+[S]）。

这个式子被称为米氏常数，它的前提是酶与底物反应的“快速平衡说”。

Km值是当酶促反应速度达到最大反应速度一半时的底物浓度，它的单位是摩尔/升，与底物浓度的单位一样[36]。

生命物质的制备技术是一种重要的研究手段。

不论科技如何发展，这些技术可能会被改进，但永远不可能被替代。

掌握了这些基本技术及其原理，就掌握了研究生命秘密的的有效武器。

因此本实验的意义不仅在于对本实验涉及的技术和物质的掌握，更重要的是我们能举一反三，在以后的工作中迁移运用这些技术。

二、材料与方法

2.1材料

（1）实验动物：

兔子

（2）试剂：

饱和（NH4）2SO4溶液；0.0175mol/L,PH6.3磷酸盐缓冲液；SephadexG-25；DEAE-纤维素；10%三氯乙酸；钠氏试剂；0.5mol/L,PH6.5醋酸铵缓冲液；0.06mol/L,PH6.5醋酸铵缓冲液；0.02mol/L,PH6.5醋酸铵缓冲液；血清样品；结合缓冲液；缓冲液Ⅰ（PH7.0PBS）；缓冲液Ⅱ（PH3.0PBS）；巴比妥-巴比妥钠缓冲液（PH8.6）；染色液；漂洗液；透明液；溶液A（Acr29.2g，Bis0.8g加蒸馏水至100mL）；溶液B（Tris-HClPH8.8,18.15g加80mL水）；溶液C（0.5mol/LTris-HClPH6.8,6g加60mL）；10%SDS；样品缓冲液；电极缓冲液；

（3）仪器：

层析柱；离心机；恒流泵；紫外检测仪；记录仪；醋酸纤维薄膜等

2.2方法

2.2.1半饱和取硫酸铵粗级分离：

①取兔子血清2mL；

②逐滴加入饱和硫酸铵溶液2.0mL，边加边轻轻振荡混匀；

③室温静置10分钟，3000rpm10分钟；

④上层清液为纯化白蛋白，沉淀物即为γ-球蛋白。

2.2.2白蛋白的分离与纯化

2.2.2.1SephadexG-25层析脱盐：

①平衡：

用3倍体积的0.02mol/L,PH6.5醋酸铵缓冲液平衡；

②上样：

旋下上盖，慢慢打开底口使凝胶床上的液面下降到与床面相齐，夹死底口；加样，用长的吸管吸取1.5mL白蛋白粗制样品，离柱床面1-2cm距离，环壁小心缓慢加样；清洗管壁，用约300uL缓冲液清洗3次；

③洗脱：

以1mL/min的洗脱速度；

④收集：

核酸蛋白检测仪在0.05A档、走纸速度6cm/h、100mV，同时记录吸光度值。

2.2.2.2DEAE-纤维素离子交换层析（梯度洗脱）

①平衡：

用3倍体积的0.02mol/L,PH6.5醋酸铵缓冲液平衡；

②加样：

将经SephadexG-25层析脱盐的白蛋白加到纤维柱上，方法同上；

③洗脱：

用流速为1mL/min，0.06mol/L,PH6.5醋酸铵缓冲液和0.5mol/L,PH6.5醋酸铵缓冲液进行梯度洗脱；

④收集：

同上。

2.2.3γ-球蛋白的分离与纯化

2.2.3.1SephadexG-25层析脱盐：

①平衡：

用3倍体积的0.0175mol/L,PH6.3磷酸盐缓冲液平衡；

②上样：

用长的吸管吸取1.5mLγ-球蛋白粗制样品，缓慢加到柱床上；

③洗脱：

以1mL/min的洗脱速度；

④收集：

同上。

2.2.3.2DEAE-纤维素离子交换层析

①平衡：

用3倍体积的0.0175mol/L,PH6.3磷酸盐缓冲液平衡；

②上样：

同上；

③洗脱：

同上；

④收集：

同上。

2.2.3.3γ-球蛋白的亲和层析法纯化

1平衡：

用2-3倍PH8.9的结合缓冲液平衡，流速为0.5mL/min；

2上样：

将经DEAE纯化的γ-球蛋白溶液上柱；

3洗脱：

用5倍床体积的缓冲液Ⅰ和缓冲液Ⅱ洗脱；

4收集：

每个ep管预先盛有1mol/mLTris-HClPH8.5缓冲液500uL,然后收集吸收峰；

5柱再生：

用PH3.0,0.1mol/L柠檬酸40mL自柱再生。

2.2.4考马斯亮蓝结合法测定蛋白质浓度

①标准曲线的制备（具体参见《生命物质制备与分析技术》）

②样液的测定（具体参见《生命物质制备与分析技术》）

2.2.5SDS-PAGE测定蛋白质相对分子量

①装好垂直平板电泳槽

②分离胶的灌制

③浓缩胶的配置和灌制

④标准蛋白质样品的制备

⑤电泳

⑥染色和脱色

⑦拍照

⑧相对分子量的计算

2.2.6醋酸纤维薄膜电泳分离鉴定蛋白质

①准备和点样

②电泳

③染色

④拍照

2.27高效液相色谱法（HighperformanceLiquidChromatography，HPLC）

1、打开计算机，打开1100LC各模块电源，代各模块自检完成后进入化学工作站。

2、从“Method”菜单中选择“EditentireMethod”项，设置参数如下：

输液泵：

B泵：

H2O+0.1%TFA（70％）

D泵：

ACN（30％）

流速：

0.8ml/min

最大压力：

230bar

最小压力：

30bar

峰宽：

0.05min（/s）

波长：

280nm

梯度洗脱时间（表1）：

（表1）

3、上样准备：

1）清洗进样针：

用CAN吸打进样针3~5次，再用ddH2O清洗数次后凉干。

2）样品用一次性注射器过滤膜过滤。

3）用微量进样器吸ddH2O清洗进样阀（注意避免将气泡注入进样阀，进样针头外沾的水用纸洗干，吸三次）。

4、上样：

上样量为10ul，用微量进样器吸取3～5被上样的体积推入进样阀（load状态），然后迅速有力的扳至inject状态。

至少1min后，扳回进样阀，这时才能将微量进样器拔出。

5、数十分钟后，分析即可完毕，在offline状态分析数据。

6、试验结束：

降低流速，卸柱。

关闭化学工作站和计算机，然后关闭1100LC各模块，各流动相瓶里倒入20%乙醇，以免长菌和微生物堵住塞板。

三实验结果和分析

3.1半饱和取硫酸铵的粗级分离

本次实验准备好了兔血清，可以直接开始用于实验。

由于血清放置时间过长，兔血清经半饱和取硫酸铵粗级分离离心后，可见离心管中底部为白色沉淀，上请液为微红透明。

3.2血清白蛋白的分离与纯化

这一个步骤是比较关键的一步。

从这里我们开始逐渐上手。

因此对于各种仪器和熟练操作，已经整个实验的大体了解都是非常必要的。

①SepHadexG-25层析柱脱盐（100毫安走纸速度6cm/h）（图一）。

数据：

1#12~460.5ml左右

2#46~540.5ml左右

3#54~480.5ml左右

4#47~200.5ml左右

图一：

血清白蛋白脱盐

因为在峰值时，血清白蛋白浓度最大，所以取2#、3#管继续做DEAE-纤维素分离，第四管留做鉴定。

②DEAE-纤维素分离血清白蛋白（图二）

图二：

DEAE-纤维素分离血清白蛋白

数据：

1#4~25

2#26~130

3#130~440

4#440~220

5#220~106

6#106~62

7#62~40

8#31~27

9#27~21

实验最初的结果是比较理想的，因为我们记录到了一个很明显的单峰。

但是后来出现了问题，我们接了九管每管0.5ml左右的样品后，记录仍然没有回到基线处。

经过大家分析其原因可能有两点：

1由于加了两管脱盐的样品导致上样量太大；2仪器本身不稳定。

图三血清γ-球白的分离与纯化

3.3血清γ-球蛋白的分离与纯化：

①血清γ-球蛋白的SepHadexG-25层析柱脱盐（见图三左半部分）

数据：

1#20~69

2#69~70

3#70~60

4#60~20

图三血清γ-球白的分离与纯化

由于峰值在2#3#管，因此取其做DEAE-纤维素柱分离。

在第三管时有一个小小的回峰，大家分析觉得这可能有两种原因，一是由于柱体装的不好引起，另外也可能是洗样时没有洗干净，导致平衡液中仍然遗留了一些样品，过柱产生了时差。

②DEAE-纤维素柱分离γ-球蛋白结果与讨论：

（见图三右半部分）

我们从核酸蛋白检测仪吸收值为1时开始收集，最终得到5管，每管吸收值范围分别是：

1#（1~12）2#（12~6）3#（6~3）4#（3~1）5#（3~0），除5#管量约为0.5ml外，每管约为1.2ml。

开始的时候因为操作不熟练，比较松懈，笔没压好，这样导致前半段出峰未记录。

但大家从所记录的半段峰看，还是能观察到出现一个清晰的蛋白质各组分电荷密度不同，电荷量不一，等电点的差异以及峰形，这样证实粗分离已得到较好的γ-球蛋白！

DEAE-纤维素柱分离白蛋白结果与讨论：

我们从核酸蛋白检测仪吸收值为4时开始收集，最终得到11管，每管吸收值范围分别是：

1#（4~25）2#（26~130）3#（130~440）4#（440~220）5#（220~106）6#（106~62）7#（62~130）8#（40~31）9#（31~27）10#（27~21），11#（21~19）。

每管约为1.4ml。

在记录仪上，显示为一个比较尖的峰，前半段较陡，后边段较平缓。

白蛋白等电点是4.88，本实验用改变盐的浓度，刚开始收集得到的是β-球蛋白和部分的α-球蛋白，接着的既为白蛋白，理论上应该有两个峰，但是只观察到一个，不能区分开。

所以收集得到的白蛋白还含有少量的α-球蛋白。

③亲和层析

亲和层析后结果并不理想，只出现了两个层析峰。

3.4考马斯亮蓝结合法测定蛋白质浓度

标准曲线：

标准曲线应为一条过原点的直线，我们制作标准曲线的值为蛋白质浓度为0~80ug/ml，吸光度为0~0.812之间，可能由于枪不准，导致取样量不准，我们制作的标准曲线略有偏差。

而为了保证样品的吸光度在范围之内，我们把样品稀释了十倍，测出以上结果。

附：

蛋白浓度计算公式：

c=95.2381A-8.647680≤c≤10（ug/ml）

该标准曲线明显不足就是信度较差。

但单从数据趋势来看是比较理想的。

数据波动比较大的主要原因可能有：

由于移液器的精度问题，在移液过程中，标准蛋白的量并不完全符合梯度。

这样由于标准品自身的波动性造成了标准曲线的标准差较大，数据的波动较大。

其次，由于样品比较多，因而可能出现加样时间差异也有所不同，从而导致显色程度不一，因而没有线性规律，造成曲线波动较大。

再次，仍然涉及到仪器的问题。

移液器不准还可能导致考马斯亮蓝染液加入浓度不一。

不过这不是主要的，因为考马斯亮蓝总是过量的，而且没有结合的染料在该波长下没有明显吸收峰。

主要的原因是分光光度计测量精度的问题。

由于使用的人比较多，所以出现要等候的现象，这样必然造成了显色时间过长的现象，因而可以出现显色误差。

最后，由于混合不均或者是加各个试剂的间隔时间的差异，也可能造成了该曲线的不理想。

图四SDS-PAGE

3.5SDS-PAGE

点样顺序从左到右依次为血清、白蛋白脱盐、白蛋白过柱、Mark、γ-球蛋白脱盐、γ-球蛋白过拄、γ-球蛋白亲和层析1和γ-球蛋白亲和层析2。

由于蛋白质定量的问题，血