四大类微生物菌落形态的比较和识别.docx

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四大类微生物菌落形态的比较和识别

四大类微生物菌落形态的比较和识别

一、实验目的和内容

目的：

1熟悉四大类微生物菌落的主要特征

2掌握识别四大类微生物菌落形态的依据和要点，并应用于识别未知菌落

内容：

1观察已知的四大类微生物菌落特征

2辨认未知的四大类微生物菌落特征

实验原理

掌握识别四大类微生物菌落形态的要点对于从事菌种的筛选、杂菌的识别和菌种鉴定等项工作都有重要意义。

菌落是由某一微生物的少数细胞或孢子在固体培养基表面繁殖后所形成的子细胞群体，因此，菌落形态在一定程度上是个体细胞形态和结构在宏观上的反映。

由于每一大类微生物都有其独特的细胞形态，因而其菌落形态特征也各异。

在四大类微生物的菌落中，细菌和酵母菌的形态较接近，放线菌和霉菌形态较相似。

菌和酵母菌的异同

细菌和多数酵母菌都是单细胞微生物。

菌落中各细胞间都充满毛细管水、养料和某些代谢产物，因此，细菌和酵母菌的菌落形态具有尖似的特征，如湿润、较光滑、较透明、易挑起、菌落正反面及边缘、中央部位的颜色一致，且菌落质地较均匀等。

它们之间的区别如下：

细菌：

由于细胞小，故形成的菌落也较小，较薄、较透明且有“细腻”感。

不同的细菌会产生不同的色素，因此常会出现五颜六色的菌落。

此外，有些细菌具有特殊的细胞结构，因此，在菌落形态上也有所反映，如无鞭毛不能运动的细菌其菌落外形较圆而凸起；有鞭毛能运动的细菌其菌落往往大而扁平，周缘不整齐，而运动能力特强的细菌则出现更大、更扁平的菌落，其边缘从不规则、缺刻状直至出现迁居性的菌落，例如变形杆菌属和菌种。

具有荚膜的细菌其菌落更粘稠、光滑、透明。

荚膜较厚的细菌其菌落甚至呈透明的水珠状。

有芽孢的细菌常因其折光率和其他原因而使菌落呈粗糙、不透明、多皱褶等特征。

细菌还常因分解含氮有机物而产生臭味，这也有助于菌落的识别。

酵母菌：

由于细胞较大（直径约比细菌大10倍）且不能运动，故其菌落一般比细菌大、厚而且透明度较差。

酵母菌产生色素较为单一，通常呈矿蜡色，少数为橙红色，个别是黑色。

但也有例外，如假丝酵母因形成籍节状的假菌丝，故细胞易向外圈蔓延，造成菌落大而扁平和边缘不整齐等特有形态。

酵母菌因普遍能发酵含碳有机物而产生醇类，故其菌落常伴有酒香味。

2．放线菌和霉菌的异同

放线菌和霉菌的细胞都是丝状的，当生长于固体培养基上时有营养菌丝（或基内菌丝）和气生菌丝的分化。

气生菌丝向空间生长，菌丝之间无毛细管水，因此菌落外观呈干燥、不透明的丝状、绒毛状或皮革状等特征。

由于营养菌丝伸入培养基中使菌落和培养基连接紧密，故菌丝不易被挑起。

由于气生菌丝、孢子和营养菌丝颜色不同，常使菌落正反面呈不同颜色。

丝状菌是以菌丝顶端延长的方式进行生长的，越近菌落中心的气生菌丝其生理年龄越大，也越早分化出子实器官或分生孢子，从而反映在菌落颜色上的变化，一般情况下，菌落中心的颜色常比边缘深。

有些菌的气生菌丝还会分泌出水溶性色素并扩散到培养基中而使培养基变色。

有些菌的气生菌丝在生长后期还会分泌滴，因此，在菌落上出现“水珠”。

放线菌：

放线菌属原核生物，其菌丝纤细，生长较慢，气生菌丝生长后期逐渐分化出孢子丝，形成大量的孢子，因此菌落较小，表面呈紧密的绒状或粉状等特征。

由于菌丝伸入培养基中常使菌落边缘的培养基呈凹状。

不少放线菌还产生特殊的土腥味或冰片味。

霉菌：

霉菌属真核生物，它们的菌丝一般较放线菌粗（几倍）且长（几倍至几十倍），其生长速度比放线菌快，故菌落大而疏松或大而紧密。

由于气生菌丝会形成一定形状、构造和色泽的子实器官，所以菌落表面往往有肉眼可见的构造和颜色。

根据上述特征可将四大类微生物菌落的识别要点归纳如下：

三、实验材料和用具

已知菌落：

细菌类（大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草杆菌） 酵母（酿酒酵母） 放线菌类（细黄链霉菌） 霉菌类（产黄青霉、黑曲霉、黑根霉）

未知菌落

试剂：

培养基（牛肉膏蛋白胨培养基、马铃薯培养基和高氏1号培养基）

四、操作步骤

1制备已知菌的单菌落

通过平板划线法获得细菌、酵母菌和放线菌的单菌落。

用三点接种法获得霉菌的单菌落。

细菌平板放37恒温培养24~48小时。

酵母菌平板置28培养2~3天。

霉菌和放线菌置28培养5~7天。

待长成菌落后，观察并记录四大类微生物菌落的形态特征。

2制备未知菌的菌落特征    

从环境检测所获得的平板，挑取若干个菌落，逐个编号，作为识别四大类用的未知菌落。

3辨别未知菌落

1. 区分“干”或“湿”：

根据菌落是“干”或“湿”及菌落正反面颜色、中央与边缘颜色是否一致，首先判断某未知菌落是属于细菌、酵母菌类，还是属于放线菌、霉菌类。

2. 细分菌落：

根据上述要点进一步区分未知菌落是属于四大类中的哪一类菌，并将判断结果填入下表中。

3.结果记录

（一）菌落形态特征的描述

1．细菌菌落的描述

菌落表面形态：

有光滑、皱褶、放射状、根状等

菌落边缘形态：

有整齐、波状、丝状、锯齿状、裂叶状等形态

菌落隆起形态：

有扁平、隆起、草帽状、胶状等

透明度：

可分为秀明、半透明、不透明等

2．酵母菌菌落形态的描述：

可参照细菌

3．放线菌和霉菌菌落的描述：

菌落表面的形态：

粗糙、同心圆、辐射状沟纹、粉状、绒毛状或皮革状等。

菌落颜色：

菌落正面颜色（包括气生菌丝或孢子颜色）；菌落反面颜色（指营养菌丝颜色）；有否水溶性色素？

（色素会渗入培养基中，使菌落周围的培养基改变颜色）。

（二）将已知菌落形态的观察和描述记录于表1中

（三）将对未知菌落的辨别结果记录在表2中

六、注意事项

1每张实验台上各有一套已知菌落和未知菌落，观察时请勿随意搬动，以免搞混菌号。

2观察和判断菌落大小时，要注意单菌落在平板上分布疏密的情况，一般菌落密集处勤菌落小，分布稀少的部位菌落大。

表1                      已知菌落形态的观察记录

大

类

菌   名

辨别要点

      菌   落   描   述

  湿

  干

表面

边缘

隆起形状

   颜    色

透明度

厚薄

大小

松密

大小

正面

反面

水溶性色素

细

菌

大肠杆菌

金黄色葡萄球      菌

枯草 杆菌

酵母菌

酵酒 酵母

粘红 酵母

热带 假丝

酵    母

放线菌

细黄链

霉   菌

霉菌

青   霉

曲   霉

根   霉

表2                  未知菌落的观察记录

菌落号

  湿

   干

    菌   落   描   述

判断结果

厚或薄

大或小

松或密

大或小

表面

边缘

隆起形状

  颜  色

透明度

正面

反面

水溶性色素

┊     ┊          ┊            ┊                                    ┊ 

分离的基本方法

微生物分离的方法很多，主要有连续稀释分离法，平板划线分离法和单细胞分离法等方法。

其中，单细胞分离法需要贵重精密仪器，中学无法开展，而连续稀释分离法和平板划线分离法却简便易行，中学完全具备开展条件。

现将这两种方法说明如下。

1.连续稀释分离法

①取1克土样，在火焰旁放入装有99毫克无菌水的锥形瓶内，充分摇匀，将菌分散。

②用移液管吸取上述菌悬液1毫升，放入盛有9毫升无菌水的试管中，并进一步稀释成1000倍，即10-3的菌悬液。

按10倍稀释法连续稀释到10-8（每1次稀释，都须更换移液管）。

③取3支1毫升移液管分别从10-8、10-7、10-6菌悬液中吸取1毫升菌悬液，分别注入编号10-8、10-7和10-6的培养皿内，同一稀释液重复做3个培养皿。

④将温度为45～50℃的营养琼脂培养基（其成分和配制方法见本章第三节）倒入上述各培养皿内，轻轻旋转使菌悬液充分混合均匀，凝固后，将培养皿倒扣放置在温暖处（28℃左右），每天观察培养基表面有无微生物菌落。

⑤经过一定时间培养后，培养基上长出菌落，根据菌落特征，初步判断属于何种类型的微生物，并在显微镜下检查，若菌体形态一致，则可认为是初步分离到纯菌种。

⑥将分离培养所得的纯菌种，从平板培养基转移到试管斜面培养基上培养。

2.平板划线分离法

①取1克土样，在火焰旁加进装有99毫升无菌水的锥形瓶中，堵塞棉塞，制成菌悬液待用。

②取一培养皿置于实验台上，左手将培养皿打开稍许，向培养皿内注入熔化的营养固体培养基10～12毫升，轻轻转动培养皿，使其中的培养基分布均匀，平放桌上，使其凝成平板。

然后在皿底用蜡笔划分A、B、C、D几个区。

应连续制作几份平板培养基。

③将培养皿底部用姆指和无名指固定成倾斜状态，在火焰旁将培养皿稍微打开。

在此同时，用环状接种针在火焰旁取少许菌悬液，迅速送入培养皿内，在平板培养基的一边，作第1次平行划线6～7条，转动培养皿约70°角，用烧过冷却的接种针，通过第1次划线部分作第2次平行划线，然后再用同样方法，作第3次平行划线。

划线时，应使平板培养基表面向下，以免空气中杂菌落入。

接种针应与平板表面成30°角左右。

不要使接种针碰到培养皿边缘，也不要将培养基划破。

④将划线后的培养皿倒放在28℃左右的温暖处进行培养，待长出菌落后，鉴定微生物类群，并根据镜检结果，判断是否已分离到了纯菌种。

如果菌种很纯，则可转移到斜面培养基上进一步培养。

连续稀释分离法和平板划线法，均须在无菌室或接种箱内进行。

二、各类微生物的分离

1.从土壤中分离好气性及兼性厌气细菌

其分离方法见本节“分离的基本方法”

2.从土壤中分离放线菌

①制作高氏一号培养基，趁热注入培养皿中，凝成平板，待用。

②称取土壤10克，放入装有100毫升无菌水的锥形瓶中，并加入10%酚10滴，以抑制细菌生长。

振荡10分钟，制成10-1菌悬液。

按照连续稀释分离法，进一步制成10-3菌悬液。

③用移液管吸取0.1毫升10-3菌悬液，注入平板培养基上，用无菌玻璃刮刀将菌悬液均匀涂抹在整个培养基上。

然后将培养皿倒置于25～30℃温箱中，培养7～10天，培养基上会出现微生物菌落。

如果菌落的硬度较大，干燥致密，且与基质紧密结合，不易被针挑起，这就是放线菌菌落。

④挑取放线菌菌落，接种于斜面培养基上。

3.从土壤中分离霉菌

①制作豆芽汗葡萄糖培养基，并添加80%乳酸数滴，以抑制细菌生长。

将培养皿中，凝成平板，待用。

②称取10克土壤，按上述分离放线菌的方法制成10-4或10-5的菌悬液。

③取0.1毫升菌悬液注入培养皿内培养基上，用玻璃刮刀涂抹均匀。

然后将培养皿倒置于25～30℃温箱内培养3～4天。

培养基上会出现微生物菌落。

霉菌菌落常长成绒状、棉絮状或蜘蛛网状，可根据这一特征寻找霉菌菌落。

④挑取培养皿内的霉菌菌落接种于斜面培养基上。

4.从饮水中分离大肠杆菌

①制作伊红美蓝培养基，趁热注入培养皿中，凝成平板，待用。

②用灭过菌的锥形瓶盛取河水或沟水，按1：

10稀释。

③取0.1毫升稀释液接种于伊红美蓝培养基上。

用平板划线分离法进行分离。

④将划线后的培养皿倒置37℃温箱中培养18～24小时。

培养基中会出现大肠杆菌菌落，菌落中心呈暗蓝黑色，发金属光泽。

⑤将菌落接种于斜面培养基上（由营养琼脂培养基制成）。

一、平板划线分离法

由接种环以菌操作沾取少许待分离的材料，在无菌平板表面进行平行划线、扇形划线或其他形式的连续划线，微生物细胞数量将随着划线次数的增加而减少，并逐步分散开来，如果划线适宜的话，微生物能一一分散，经培养后，可在平板表面得到单菌落。

二、稀释倒平板法

先将待分离的材料用无菌水作一系列的稀释（如1∶10、1∶100、1∶1000、1∶10000…），然后分别取不同稀释液少许，与已溶化并冷却至45℃左右的琼脂培养基混合，摇匀后，倾入灭过菌的培养皿中，待琼脂凝固后，制成可能含菌的琼脂平板，保温培养一定时间即可出出菌落。

如果稀释得当，在平板表面或琼脂培养基中就可出现分散的单个菌落，这个菌落可能就是由一个细菌细胞繁殖形成的。

随后挑取该单个菌落，或重复以上操作数次，便可得到纯培养。

稀释涂布法：

优点：

可以计数，可以观察菌落特征。

缺点：

吸收量较少，较麻烦，平板不干燥效果不好，容易蔓延。

一般用于平板培养基的回收率计数！

！

稀释混合平板法：

优点：

可以计数，吸收量为1ml，较方便。

优点：

不能观察菌落特征。

一般用于菌落总数的计数！

！

平板划线法：

优点：

可以观察菌落特征，对混合菌进行分离！

！

缺点：

不能计数

一般用于从菌种的分纯！

涂布法使用较多，但有时不均匀

稀释倒平板法操作相对麻烦，不适合好氧和对热敏感的细菌培养

应用范围：

涂布法适用于 好氧菌

         稀释倒平板法适用于厌氧，兼性厌氧

菌种的分离取lmL卤汁以10倍递增稀释方法（一份酸奶，九份无菌水，再取一份第一只管中溶液，加九份无菌水，依次类推），将其稀释至1/10～10的-10次幂（我打不上去），然后从不同浓度稀

释液中分别取lmL倾注在平皿中，再倒入培养基相混合，待培养基凝固后倒置于30~C恒温下

培养48h。

挑取长势良好的单个茵落划线分纯，直至纯化（茵落单个大小一致，革兰氏染色镜

检，茵体一致）。

结果分离得到3株不同菌株，分别编号为菌株1、菌株2、菌株3。

再分别转移

到试管斜面上进行保存。

分离用培养基：

牛肉膏5g，蛋白胨10g，氯化钠5g，蒸馏水1000mL，琼脂20g，pH7．0—7．2

；保存用斜面培养基：

酵母膏1％，碳酸钙2％，葡萄糖1％，琼脂2％，pH7．0。

培养条件

将分离出的菌株1、菌株2、菌株3分别接种在上述4种不同的培养基上，

在30。

【=恒温条件下培养48h后观察并测定其培养结果。

测定方法菌落总数采用逐级稀释法来计数；pH值用pHS一2C酸度计测定；乳酸定性

及含量测定依据食品检验技术

1I．2．1乳酸菌的分离与筛选的试验程序自然发酵酸奶---稀释---培养---挑起单菌落染色、镜检一挑

选革兰氏阳性球菌单菌落一Ⅲ号培养基一挑选溶钙圈大的球菌反复在Ⅲ号培养基上几次纯化筛选一单菌落优

良菌株一试管穿刺低温保存。

1．21．2乳酸菌的鉴定用光学显微镜、放大镜进行乳酸菌的形态特征鉴定。

生理生化特征鉴定：

产乳

酸定性试验——乳酸纸层析法0-、过氧化氢酶（接触酶）反应⋯、明胶水解反应、硫化氢反应、乳酸菌

发酵营养型试验0、耐盐、酸、温度试验。

1．2．I．3乳酸菌的保存⋯采用定期移植低温保藏法。

培养基配方：

葡萄糖1％、蛋白胨02％、

l（}l2PQ|0．2％、琼脂20％、pH值70，分装试管，121。

c灭菌30min。

将使用对数生长期后期的细胞进行穿刺

培养，然后密封存于冰箱玲藏室内（5qc左右），2个月移植1次。

1．2．2分离乳酸菌的生理特点试验

122．1最适生长温度的测定OD值以同温下不接种培养基作对照，定期取出接种培养基在721分光光度

计上，用最大吸收光波长=6001RIifl测定。

1．2．2．2生长周期的测定oD值（方法同上）；pH值：

PHB一4pH计；可滴定酸（以乳酸计）：

吸取ImL菌液

加入9Ⅱ1L蒸馏水，加入1～2滴酚酞，用0．1NNaOH滴定。

1．22．3最适pH值的测试、最适盐浓度的测试。

供试样品及培养基

分离用样品：

酸奶、酸奶及西红柿均为市售

分离用培养基：

①BCP培养基：

酵母膏25g，蛋白胨5g，葡萄糖5g，溴甲酚紫004g，琼脂15g，

蒸槽水lO00ml，pH70；②MRS培养基见文献。

菌种保藏用培养基：

脱脂乳培养基：

新鲜牛乳离心去掉上层乳脂，下层奶液分装试管，105℃

灭菌20mln。

菌利鉴定用培养基见文献6。

12方法

121乳酸菌的分离纯化取泡菜汁、酸奶、西红柿表面洗液进行梯度稀释，分别用倾注法、涂布

法和划线法在BCP和MRS培养基平板上进行菌种分离。

挑取在BCP平板上有透明目的菌落，在

MRS平扳上有溶钙圈的菌落，反复纯化至纯种，挑菌至脱脂牛奶试管中保存

1．22乳酸菌复筛对初筛菌株进行革兰氏染色，保留革兰氏阳性菌株．并对其所产乳酸能力进

行定性、定量分析，筛选出产酸高的菌株保存，再把产酸高的菌株经萝l、汁发酵】，进一步选择产

酸高、_l】味纯正的菌株保存鉴定

123乳酸定性测定果用纸层析法。

溶剂系统为乙醇：

浓氨水：

水=80：

5：

15，显色剂为004％

的溴甲酚紫酒精溶液。

层析时将乳酸、柠檬酸配成1％的标准溶液，两种标准溶液及乳酸发酵液

均点样3．上行层析，显色与标准样比较

1．24乳酸的定量测定采用气相色谱法，利用苄酯化法制备乳酸衍生物，将待测乳酸菌株在产

酸培养基内37"C培养3d，离心。

取上清液剃备衍生物，气相色谱分析含量。

气相色谱工作条件为：

EGS色谱柱，柱温160'C，气化温度180'17．，检测器温度l70"C，载气为N，。

1．25菌种鉴定根据《简明第八版伯杰细菌鉴定手册》和《一般细菌常用鉴定手册》[6对复筛

出的菌株的形态、生理生化、碳源利用等方面进行系统鉴定，并提取乳酸菌株DNA，采用熔链温度.

、固体培养基分离

1、稀释倒平板

特点：

菌落分离较为均匀，进行微生物计数结果相对准确。

但操作相对麻烦，热敏感菌有时易被烫死，而严格好氧菌也可能因被固定在培养基中生长受到影响。

2、涂布平板法

特点：

操作相对简单，是较常使用的常规方法。

但有时会因涂布不均匀使某些部位的菌落不能分开，进行微生物计数时需对稀释和涂布过程的操作特别注意，否则不易得到准确的结果。

3、平板划线法

特点：

操作简单，多用于对已有纯培养的确认和再次分离。

应用：

这三种方法可用于所有能在固体培养基表面形成菌落的微生物的纯培养分离。

并且，通过选用适当的选择平板及培养条件，可直接分离各种具有特定生理特征的微生物。

和厌氧罐或厌氧手套箱技术结合，这3种方法也可用于获得各种厌氧菌的纯培养。

4、稀释摇管法

特点：

稀释倒平板法的一种变通形式，但由于菌落形成在琼脂柱的中间，观察和挑取都相对困难。

应用：

在缺乏专业的厌氧操作设备的情况下对严格厌氧菌进行分离和观察。

二、液体培养基分离

1、稀释法

特点：

工作量大，是否获得纯培养需依靠统计学的推测。

应用：

不能或不易在固体培养基上生长的微生物进行纯培养分离或数量统计。

2、富集培养

特点：

一般不能直接获得微生物的纯培养，在通过富集培养使原本在自然环境中占少数的微生物的数量大大提高后，需再通过平板法进行相应微生物纯培养的分离和检测。

应用：

（1）根据某种微生物的特殊生长要求，按照意愿从自然界中对这种微生物进行有针对性的有效分离；

（2）分离培养出由科学家设计的特定环境中能生长的微生物，尽管我们并不知道什么微生物能在这种特定的环境中生长。

三、显微操作

单细胞（孢子）挑取

特点：

分离过程直观，可靠，但对仪器和操作技术要求较高，多限于高度专业化的科学研究。

而挑取的微生物单细胞或孢子需经固体或液体培养基培养后才能获得其纯培养物。

应用：

从样品中直接分离所需的微生物细胞或孢子，获得其纯培养。

分离纯化米曲霉

米曲霉菌种里感染了黄曲霉,怎么将米曲霉分离纯化出来?

具体方法是什么?

怎么检测纯化完全了?

如果你愿意将你的答案告诉我,请你详细点,谢谢！

实在不行只有从头开始了。

从划线培养开始吧。

单菌落的挑取在10倍系列稀释的平板中进行，选取菌落数在30～300之间的平板，划线纯化方法如下：

对低于30个左右菌落的平板，每个菌落均挑取，划线纯化。

对50个左右菌落的平板，挑取1/2菌落划线纯化。

对100个左右菌落的平板，挑取特殊的菌落纯化。

反复划线纯化，至菌落形态和菌株形态分别完全一致，可认为是纯菌株。

优势菌的挑取在浸海2h～14d挂片系列稀释培养平板中进行，挑取1～2株优势菌落形态的菌株于2216E平板上划线纯化。

在纯化的菌株中加入适量甘油，保存于-80℃超低温冰箱中和-23℃冰箱中。

菌株鉴定

细菌鉴定按照《一般细菌常用鉴定方法》进行，将挑取纯化的菌株鉴定至属。

鉴定试验包括形态观察、革兰氏染色、鞭毛染色、氧化酶反应、过氧化氢酶反应、运动性试验、葡萄糖氧化发酵试验、硫化氢试验、0/129试验、吲哚产生试验、色素产生试验及发光现象观察等项目，参照J.D.Oliver海洋细菌鉴定表，将附着细菌分类至属。

采用硫酸铵沉降法分离纯化米曲霉M3所产中性蛋白酶,并对其酶学性质进行了研究.结果表明:

用硫酸铵沉降法所得粗酶粉的酶活力高达159781.1u/g;该酶的最适反应温度为50℃,最适作用pH值为7.5;该酶在30～40℃时具有良好的热稳定性,在pH值6.5～7.5的条件下酶是稳定的;NH14,K1对该蛋白酶有明显的激活作用,Fe3则对其表现出强烈的抑制作用.

菌种的分离取lmL卤汁以10倍递增稀释方法（一份酸奶，九份无菌水，再取一份第一只管中溶液，加九份无菌水，依次类推），将其稀释至1/10～10的-10次幂（我打不上去），然后从不同浓度稀

释液中分别取lmL倾注在平皿中，再倒入培养基相混合，待培养基凝固后倒置于30~C恒温下

培养48h。

挑取长势良好的单个茵落划线分纯，直至纯化（茵落单个大小一致，革兰氏染色镜

检，茵体一致）。

结果分离得到3株不同菌株，分别编号为菌株1、菌株2、菌株3。

再分别转移

到试管斜面上进行保存。

分离用培养基：

牛肉膏5g，蛋白胨10g，氯化钠5g，蒸馏水1000mL，琼脂20g，pH7．0—7．2

；保存用斜面培养基：

酵母膏1％，碳酸钙2％，葡萄糖1％，琼脂2％，pH7．0。

培养条件

将分离出的菌株1、菌株2、菌株3分别接种在上述4种不同的培养基上，

在30。

【