便携式植株水分测定仪检测水稻植株水分状况相关QTL.docx

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便携式植株水分测定仪检测水稻植株水分状况相关QTL

便携式植株水分测定仪检测水稻植株水分状况相关QTL

摘要

日益严重的水资源危机使水稻的耐旱育种尤为迫切，干旱环境下较高的植株水分含量有助于提高或维持作物产量的稳定性，挖掘与耐旱性密切相关的分子标记有助于提高耐旱品种的选育效率。

从供体Lemont（粳稻）导入到特青（籼稻）背景的254个高代回交导人系中筛选出覆盖供体全基因组的55个回交导入系，采用PVC管栽培，分析了干旱（胁迫）条件下水稻植株水分状况相关性状与籽粒产量、生物量的相关性并定位了相关QTL。

研究表明，植株水分相关性状（相对含水量、叶片水势、渗透势、卷叶度）均与籽粒产量显著相关。

使用浙江托普仪器的TYS-3N型便携式植株水分测定仪检测到7个相对含水量QTL，7个叶片水势QTL，5个渗透势QTL及5个卷叶QTL；另检测到5个产量QTL。

7个生物量QTL。

分析发现，不仅QLwp5、QLr5、QRwc5和Q份同时分布在RM509～RMl63区域，且该区域还分布有对水分环境表现稳定的产量QTL（QGyS），效应方向一致，从遗传学角度解释了籽粒产量与水分相关性状之间的显著相关性。

另外QLr5．QRwc5、a怖、QLr2QLr7、QLr8、QLr9、QRwc3、QRwc4a、QRwcl2及Q啊等11个QTL曾在不同遗传背景群体中被检测到，它们控制相同目标性状。

研究认为RM509-RMl63区域及QLr2、QLr7、QLr8、QLr9、QRwc3、QRwc4a、QRwcl2和Q啊所分布的染色体区域对水分环境或者遗传背景相对稳定，在水稻分子标记辅助选择（MAS）耐旱育种实践中有较重要利用价值。

关键词：

水稻；干旱；植株水分状况；便携式植株水分测定仪；数量性状位点

随着全球水资源的日益枯竭和分布不均匀，干旱已成为21世纪农业面临的最主要问题之一。

作为全球主要粮食作物的水稻，其安全生产更受到水资源短缺的严重威胁。

培育耐旱节水品种已成为水稻主要育种目标之一。

挖掘与耐旱基因位点紧密关联的分子标记是促进分子标记辅助选育（MAS）耐旱品种的有效途径。

近年来随着DNA分子标记技术的不断发展与完善，已涌现出大量水稻耐旱QTL的研究报道”西。

相比之下，耐旱育种进展仍然十分缓慢。

究其原因，传统耐旱育种多以产量为筛选指标，而产量是复杂遗传基础与环境因素互作的结果，在逆境下产量的遗传力极不稳定，造成选择效率低下。

因此，有学者认为，明确作物耐旱的生理生化特征及其紧密连锁的分子标记可能有助于提高育种效率。

通过研究干旱胁迫下水稻的形态特征和生理生化变化，发现反映植株水分状况的一些性状，如相对含水量、叶片水势、渗透调节能力等不仅是鉴别抗旱性的有效参数，且与逆境下的水稻产量有一定相关性。

目前虽已有干旱环境下水稻植株水分状况相关性状遗传学研究的报道，但其与干旱条件下产量的遗传关系尚不明了，这在一定程度限制了耐旱生理参数在育种实践中的应用。

因此，明确这些水分相关性状与水稻耐旱性的关系，定位与耐旱相关的重要水分性状位点，鉴别其紧密连锁的分子标记将有助于提高抗旱育种的效率。

本研究利用Lemont（粳稻）导人到特青（籼稻）遗

传背景的跨叠整个供体基因组的高代回交导入系为材料，分析了干旱环境下水稻植株相对含水量（relativewatercontent，RWC）、叶片水势（1eafwaterpotential，LwP）、渗透势（osmoticpotential，吵）、卷叶度（1eafrolling，LR）及产量（grainyield，GY）、生物量（biomass，BM）等性状之间的相关性，并定位了目标性状QTL。

旨在挖掘与水稻耐旱性密切相关的水分相关性状QTL，为辅助选育耐旱品种提供理论依据。

1材料与方法

1．2试验材料

特青是我国大面积推广的高产籼稻品种，Le—mont则是美围南部推广的优质高产粳稻品种。

采用的定位群体来自供体Lemont导入特青遗传背景的254个高代回交导入系（IL）群体【3】。

利用已构建完成的遗传图谱（含160个均匀分布的SSR标记，连锁图全长1677cM，两个标记之间的平均距离为11．3cM）及导人系的基囚型分析结果，从254个导入系群体中筛选出55个导入系（ILs）用于本研究。

这55个ILs的平均每个株系导人的杂合片段数为4．9个（0。

19），纯合片段数为9。

7个（2—25），导入片段的平均长度37．4cM，55个株系导入片段总长度15569．6cM，为Lemont基因组的9．3倍，而且各株系的导入片段相互跨叠覆盖整个供体基因组。

曾利用55ILs和254ILs分别定位旱环境下水稻粒重QTL，发现在两个群体中榆测到的主效QTL除效应大小略有差异外，其在染色体上的分布及效应方向基本一致m，说明利用这套跨叠系定位QTL是有效的。

同时，由于55个IL的遗传背景已接近轮回亲本特青，多数株系生育期与特青相仿，抽穗期变幅为86—89d，基本排除了由于生育期不同而引起株系问耐旱性反应不同的可能性。

本实验主要采用浙江托普仪器的便携式植株水分测定仪来检测植株的水分情况。

便携式植株水分测定仪简介

便携式植株水分测定仪型号：

TYS-3N

便携式植株水分测定仪又名：

植物养分速测仪，植物氮素测定仪，植物叶绿素测定仪。

便携式植株水分测定仪仪器用途和意义：

植物氮素含量、叶绿素和叶片温度是植物生长的重要营养和生理参数，是反映植物生命体征的重要参数。

也是进行植物施肥和灌溉的重要依据。

氮素含量一般情况下直接反应作物的健康情况，生长状态、了解植物真实的硝基需求量和土壤硝基的缺乏程度或是否过多地施加了氮肥，广泛应用于氮肥管理，除草剂应用，叶片衰老，环境胁迫等研究，叶绿素测量仪在农业种植过程中有很大的意义。

叶绿素含量的测定结果是SPAD值，是叶片在两种波长650nm和940nm，叶片传输光的数量进行比值计算，来确定叶片当前叶绿素的相对数量（两种波长范围内的透光系数来确定叶片当前叶绿素的相对数量），SPAD值与叶绿素之间成正比关系，因此SPAD值往往间接地可代表叶绿素值，从而可以评估植物健康状况、生长状态，因而在农业中，时常使用叶绿素计来进行对植物叶绿素含量进行检测，以此来进行指导氮肥的施用量，因而在农业种植过程中使用叶绿素计来进行指导氮元素含量的施肥，同时在很多植物中，以此来进行判断植物的抗逆性。

叶温常用来表示植物的体温状况，植物叶片中所有的化学反应,都受叶片温度的影响，在植物生理活动的分析中经常用到。

叶温与气温的差值，可以表明植物的缺水情况或受旱程度。

因为当水分供应充足时，植物蒸腾正常，蒸腾耗热可以降低植物体温，这时叶温比气温低；反之受旱时，植物体温上升，可高于当时的气温。

但现在国内外能用于快速检测氮素的仪器只有叶绿素仪，测试的是SPAD值，仅仅只能依照SPAD值大概推断植物氮含量的高低。

我公司突破传统，和浙江大学合作开发出国内第一台基于近红外光谱无损检测方法及数据挖掘技术的植物营养快速测定仪。

可在田间快速无损测试植物的叶绿素，叶片氮含量，叶温三种养分和生理生长信息，在为农业研究和生产中具有重大意义。

便携式植株水分测定仪仪器特点

1.三种参数（叶绿素、氮素、叶温），同时显示，可保存，便于植物养分等信息分布图形的绘制，为植物精确施肥提供依据。

2.快速无损地进行植物活体检测，不损害作物，不影响植物的成长。

3.多参速快速一次测定：

一次操作同时测定植物的叶绿素、氮素、叶温。

4.测试点定位信息的获取：

通过仪器内内置的GPS模块，通过NAME－83协议方式由串口中断方式接收，将接收到的数据解码为经度、纬度、速度、时间（时钟与日历，年月日时分秒）、方向角等信息同步显示并存储，时间可手动设定。

（多功能型号配有该项功能）

5..历史数据查看，三种参数同时显示。

7.实现计算机数据传送，便于植物养分管理和分析。

8.彩屏测量结果显示，直观清晰，带背光功能。

9.测量数据保存方便、历史数据显示直观。

10.内置充电电池，携带和使用非常方便。

便携式植株水分测定仪仪器参数

测定指标：

氮素、叶绿素、叶温

氮范围：

全程

氮精度：

±5%

叶绿素范围：

0.0-99.9SPAD

叶绿素精度：

±2SPAD

叶温范围：

0-90℃

叶温精度：

±1℃

存储量：

999组数据

1．2试验设计于2005年在国际水稻研究所（IRRI）进行试验。

材料种植在高70cm，直径25em的PVC管中。

管内套一适合内径与高度的尼龙布袋，袋中装17kg混合土壤（壤土：

河土=3：

1）并在秧苗移栽前定量浇透3次水。

播种14d后，每个管中移栽3株长势一致的幼苗，秧苗返青后间为1株苗。

试验设干旱胁迫和对照两个处理，均为3次重复。

胁迫处理的株系

移栽15d后断水，在断水40d时，不同株系之间表现出显著的胁迫差异，考查反映植物水分状况的相关指标，包括相对含水量、叶片水势、叶片渗透势及卷叶度，之后复水至收获，收获后考查对照与胁迫处理下植株的生物量及产量，一方面用于QTL定位，另一方面用于标记胁迫处理强度。

对照为正常灌水，保持2～3cm水层。

1．3性状考查

1．3．1叶片卷叶度（LR）参考IRRI（1996）方法【17】目测LR。

LR分为5级，1级为叶片完全展开，部分叶片略微卷曲为2级，依此类推，完全卷曲为5级。

1．3．2叶片水势（LWP）采用压力室法测量黎明前植株最上部完全展开叶的LWP（SoilmoistureEquipmeCorp．，SantaBarbara，CA）。

测量过程中先在钢筒里面放置一浸湿纸巾，以避免水分过度蒸发。

1．3．3叶片渗透势（吵）取植株的倒2叶的部分叶片，在液氮中冷却20min后贮存于一20℃冰箱中备用。

检测前，叶片在室温下平衡。

采用托普仪器的TLD-3000型露点水势仪测定不同处理叶片汁液的渗透浓度。

渗透势：

职MPa）=一iCRT,其中i=1，C，R，T分别为渗透浓度、气体常数及卡尔文温度。

1．3．4相对含水量（RWC）渗透势取样后余下的倒2叶用于RWC的检测。

称重后（鲜重）放人盛有蒸馏水的50mL试管，置4℃冰箱过夜后取出，轻轻拭去附着在叶片表面的水分，再称重（饱和重），并在烘箱中杀青，80。

C烘至恒重。

RWC=【（鲜重一干重）／（吸涨后饱和重一干重）]x100％120I。

1．3．5生物量（BM）及产量（GY）收获植株后，考查单株地上部干重及籽粒产量。

1．4QTL检测

以水、早条件下分别测得的BM、GY，干旱条件下的LWP、致RWC和LR等性状值为输人数据，利用已构建的分子标记连锁图，采用SASPROCGLM软件的单向方差分析检测影响各性状的QTL，以P<0．005显著水平作为取舍主效QTL的临界值。

当1个QTL与两个或两个以上标记连锁时，以F值最高的标记作为与QTL连锁的标记列出【31。

2结果与分析

2．1亲本与导入系群体的性状表现

干旱胁迫处理使特青和Lemont的GY分别降低74％和92％，BM分别降低48％和57％，表明胁迫处理严重，且干旱对产量的影响显著大于对生物量的影响（表1）。

对照条件下，两个亲本间GY、BM差异不显著，而在干旱环境下轮回亲本特青的GY、BM显著高于Lemont，表明特青的耐旱力强于Lemont。

特青的RWC、LWP和罗分别比Lemont高出20．80％、3．37bar和1．20MPa，LR则比Lemont低1．58，表明干旱环境下特青的保水能力显著强于Lemont。

ANOVA分析表明，各目标性状在IL表现出显著差异，且呈正态超亲分布。

相关分析表明，干旱环境下反映植株水分状况的几个相关性状LWP、RWC及屿GY之阎呈显著正相关（分别为r=0．32“，0．42”+，0．28+）（表2），表明相对较高的RWC、LWP及哺助于植株细胞膨压的维持，促进产量的形成。

LR与GY、BM之间分别为显著负相关及正相关（，．=-0．37”及0．324），表明卷叶度高，植株耐旱性就相对较差，在干旱条件下的

产量就低；而BM高的植株，由于植株叶面蒸腾耗水相对较多，叶片卷曲度就随之增加。

GY与BM问的显著负相关（r=-0．45”’），表明在土壤水分受限的条件下BM大的植株籽粒产量受损较多。

LWP、RWC、少及LR等几个性状之间也存在显著的相关性，其中RWC与少之间的，=0．81”，表明干旱条件下较高渗透势有利于植株维持较高的RWC。

2．2水稻植株水分相关性状QTL

在第3、4-7及12染色体上检测到7个影响干旱环境下水稻叶片相对含水量（RWC）的位点（QRwc3、QRwc4a、QRwc4b=．QRwc5、QRwc6、QRwc7和QRwcl2）。

Lemont等位基因在QRwc3、QRwc7和QRwcl2等3个位点对RWC有增效作用，而在其余4个位点有减效

作用（表3，图1）。

在第2、3、5、6、8和12染色体上检测到7个与黎明前叶片水势显著相关的QTL（QLwp2、QLwp3、QLwp5、QLwp6、QLwp8a、QLwp8b和QLwpl2）。

除QLwp2及QLwp5外，在其余位点Lemont等位基因均提高LWP（表3，图1）。

在第2、5、7、11—12染色体上检测到5个影响干旱环境下水稻渗透势的位点（Q嘲、O燃、a奶∥、aW，r11和a蜊2）。

Lemont等位基因在a畅咿和a吲2对渗透势有正向效应，而在其余3个位点为负向效应（表3，图1）。

在第2、5、7-9染色体上检测到5个影响干旱环境下水稻叶片卷叶度的位点（Qlr2、Qlr5、Qlr7、Qtr8和Qlr9）。

除Qlr7外，Lemont等位基囚在其余4个位点均增加干旱环境下叶片卷叶度（表3，图1）。

2．3水稻产量与生物量QTL

在第1、5、6、8和12染色体上检测到影响水稻GY的5个QTL。

其中灌溉条件下检测到3个（QGy5、QGy6和QGy8），干旱胁迫下3个（QGyl、QGy5和QGyl2）（表4，图1），QGy5在对照、干旱胁迫环境下均被检测到，Lemont等位基因在两种环境下都减少GY；QGy6和QGy8只在对照条件下被检测到，Lemont等位基因在前后两个位点分别降低和增加GY；QGyl和QGyl2受干旱诱导，只在干旱环境下表达，Lemont等位基因均减少GY。

在第3。

4、6、10和12染色体上检测到5个影响水稻生物量的QTL。

其中对照条件下4个（QBm3、QBm6、QBmlO和QBml2），干旱条件下2个（QBm4和QBmlO）（表4，图1），QBmlO在两个环境下均被检测到，但效应方向相反。

Lemont等位基因在水田环境下增加BM，而在干旱环境下降低BM。

Lemont等位基因在QBm4和QBm6位点增加BM，而在QBm3和QBml2位点则降低BM。

3讨论

干旱环境下植株水分状况与产量有着一定相关性，是田间筛选耐旱株系的参考指标【171，而相对含水量、叶片水势和渗透势是反映植物体内水分状况的重要有效参数‘17,21-22]，与耐旱性密切相关。

当作物感受到干旱胁迫时，渗透势主动降低以维持叶片水势【231，继而维持细胞膨压及与膨压密切相关的各种生理生化代谢过程；较高相对含水量的维持则与气孑L开闭、光合作用及植株的生长直接相关‘16,24-25]。

缺水条件下，植株叶腹面的泡状细胞失水，膨压降低导致叶片卷曲，因卷曲度与植株水分之间显著相关，且评价方法简单方便，是育种家田间选育耐旱品种时参考的一个重要形态指标∞之7l。

但是尽管这些性状与耐旱性显著相关，由于表型性状的检测大多耗时耗力。

且对植株的破坏性较大，一定程度上限制了其遗传学基础的研究进展。

分子标记技术的完善，有助于挖掘与其紧密关联的分子标记，对MAS耐旱水稻品种有着重要的理沦指导价值。

近年来，人们用回交导入系或染色体片段替换系定位了许多重要QTLl28-30J，但对干旱环境下水稻相对含水量、叶片水势、渗透势、卷叶度等性状进行QTL定位的报道还较少，且与生物量、产量QTL同时进行定位及比对分析的报道则更少。

植株水分状况相关性状的田间考察受环境条件的影响较大，因此定位群体不能太大以便性状考察能在一个较短的时间段完成，保证数据的可靠性。

本研究从Lemont导入到特青背景的254IL中，根据基因型分析结果，筛选到导入片段彼此跨叠且覆盖整个供体Lemont基因组的55IL，其生育期接近，基本排除了生育期不同导致植物耐旱性反应不同的可能性，大大提高了表犁鉴定的准确度，确了QTL定位的可靠性。

植株水分状况与籽粒产量显著相关（表2），且相关QTL定位结果部分解释了其高度相关的遗传学基础（表4，图1）。

如在第5染色体RM509一RMl63区域附近，不仅同时分布有控制LWP、RWC、吵和LR等性状的QTL，亦有控制GY的QTL，且基因效应方向一致，从遗传学角度解释了干旱条件下作物含水量与产量的正相关性；同时，该位点还影响对照环境下的籽粒产量，并且效应方向一致。

利用相同遗传背景的254IL亦多次检测到该区域与水旱环境下籽粒产量密切相关【3．311。

表明该位点通过影响植量，表现为对水分环境相对稳定，为重要的耐旱位点之一。

进一步分析发现，除分布在第2—4染色体上的影响植株水分状况的相关性状QTL区域外，其余目标区域（RMl9一RM204、RM238～RM248、RM223。

RM2l0、RM242-RM278、RM209-R229、RM20～RM277）均在前人研究中被检测到有GY—QTL分布‘3删，表明植物水分性状确实与产量有一定的遗传相关性。

叶片相对含水量、叶片水势、渗透势、卷叶度等性状是对生理生化过程不同阶段不同角度的反映，存在一定的因果关系[17,221，因此，各个性状之间存在显著的遗传相关（表2）。

如7个RWC．QTL中有4个（QRwc5、QRwc6、QRwc7和QRwcl2），5个弘-QTL有4个（Q9'3、a吩、a竹和Q朔2），7个LWP—QTL中有5个（QLwp2、QLwp5、QLwp6、QLwpSb和QLwpl2），5个LR—QTL有3个（QLr2、QLr5和QLr8）分别与其他性状定位在相同位点（表3，图1）。

借助相同的SSR标记或比较图谱132。

4l，发现本文定位到的5个LR．QTL（QLr2、QLr5、QLr7、QLr8和QLr9），7个RWC—QTL的4个（QRwc3、QRwc4a、QRwc5和QRwcl2）和5个弘-QTL的2个（a眄和Q叨均被前人检测到‘15加，27，35l，且QLr7，QRwc3、QRwc5和a9-'7在不同的研究中被多次检测到。

说明这些QTL受遗传背景的影响相对较小，具有较好的稳定性，在分子标记辅助选择中可能具有应用价值。

由于土壤干旱刺激直接作用于植物根部，将本文的植物水分状况相关QTL与近年发表的利用相同染色体标记定位的根系相关性状QTL进行比较，发现除第3染色体的RM36一RM282及第4染色体RM260～RM307标记区域外，在其余水分相关区域，均有根部相关性状（根长、根生物量及根容量）QTL被检测到‘36-391，表明干旱环境下的根系对植株地上部分的生理活动有重要的调控作用。

地上部耐旱性状与根系之间的遗传相关性及对植株耐旱性表达的影响将在下一步工作中深入研究。

4结论

定位到7个叶片水势QTL（QLwp2、QLwp3、QLwp5、QLwp6、QLwp8a、QLwp8b和QLwpl2），5个卷叶QTL（Qlr2、Qlr5、Qlr7、Qlr8和Qlrg），7个相对含水量QTL（QRwc3、QRwc4a、QRwc4b、QRwc5、QRwc6、QRwc7和QRwcl2），5个渗透势QTL（Q％眩、a嘲，a哟衫、a彬zrll和a嘲2）及5个生物量QTL（QBm3、QBm4、QBm6、QBmlO和QBml2），5个产量QTL（Qgy』、Qgy5、Qgy6、agy8和QgyJ2），其中QGy5、QBmlO在水旱环境均被检测到，QGy5在两种环境下效应方向一致，对水分环境相对稳定，而QBmlO则对环境不稳定，在两个环境条件下效应方向相反。

在第5染色体的RM509～RMl63区域同时分布有控制相对含水量、叶片水势、渗透势、卷叶及对水分环境稳定的产量QTL，且效应方向一致，表明该区域对利用植株水分相关QTL的水稻MAS耐旱育种实践有重要理论价值；另外，QLr2、QLr5、QLr7，QLr8．QLr9、QRwc3，QRwc4a，QRwc5lQRwcl2、Q妨和a啊在前人研究中均被检测到，它们能在不同环境或遗传背景下稳定表达，在分子标记辅助选择中可能具有一定应用价值。

参考资料

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