发酵工程实验讲义含生技生工.docx

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发酵工程实验讲义含生技生工

实验一酸奶的制作与乳酸菌的活菌计数（5学时）

实验类型：

综合性

实验目的：

1、学习并掌握酸奶制作的基本原理与方法。

2、了解市售酸奶的生产工艺。

3、掌握乳酸菌活菌计数方法与操作。

实验原理：

乳酸菌在乳中生长繁殖，发酵分解乳糖产生乳酸等有机酸，导致乳的pH值下降，使乳酪蛋白在其等电点附近发生凝集。

乳酸菌属于兼性厌氧微生物，其在无氧条件下生长繁殖较好，实验室条件下利用混菌培养的方法，尽可能让乳酸菌在无氧条件下生长，每个单菌落代表一个微生物细胞。

实验内容：

（一）酸奶制作

1、10%脱脂奶粉溶解于热水（80℃左右）中，充分搅拌均匀，配成调制乳；

2、添加蔗糖：

为了缓和酸奶的酸味，改善酸奶的口味，在调制乳中加人4-8％的蔗糖。

3、灭菌：

方法有两种：

将乳加热至90℃，保温5min；

4、接种：

往冷却到43-45℃灭过菌的乳中加入乳酸菌，接种量为2%-5%。

5、分装：

酸奶受到振动，乳凝状态易被破坏，因此，不能在发酵罐容器中先发酵然后再进行分装，须是将含有乳酸菌的牛乳培养基先分装到小容器中，加盖后送入恒温室培养，在小容器中发酵制成酸奶。

6、发酵：

发酵的温度保持在40-43℃，一般发酵时间为3-6h。

发酵终点的确定有两种方法：

1）检测发酵奶的酸度，达到65-70T°。

2）倾斜观察，瓶内酸奶流动性差，而且瓶中部有细微颗粒出现。

7、冷却：

发酵结束，将酸奶从发酵室取出，用冷风迅速将其冷印到10℃以下，一般2h，使酸奶中的乳酸菌停止生长，防止酸奶酸度过高而影响口感。

8、冷藏和后熟：

经冷却处理的酸奶，贮藏在2-5℃的冷藏室中保存。

9、感官指标

1）色泽：

色泽均匀一致，呈乳白色，或稍带微黄色。

2）组织状态：

凝块稠密结实均匀细腻，无气泡，允许少量乳清析出。

3）气味、味道：

具有清香纯净的乳酸味，无酒精发酵味，无霉味和其他外来不良气味。

（二）乳酸菌活菌检测

①、检测培养基：

蛋白胨15g，牛肉膏5g，葡萄糖20g，氯化钠5g，碳酸钙10g，琼脂粉10g，水1000ml，115～121℃灭菌20min，灭菌后放置水浴52℃保温备用。

②、稀释：

取10克样品放入添加90ml无菌水的带玻璃珠的250ml三角瓶中，摇床180rpm震荡30min，即为10－1样品溶液；再从中取1ml至添加9.0ml无菌生理盐水的三角瓶中，稀释至10－2，……以此类推稀释至10－8，即稀释了1亿倍;

③、倒制培养平板，从上述已稀释了1亿倍的乳酸菌悬液中取1ml，在无菌操作台上注入9.0cm培养皿中，再将已经灭了菌的保持在52℃水浴锅中的呈溶解状态的培养基，倒入15毫升左右于培养皿中，全部浸到培养皿，与菌悬液充分混合均匀（倒入培养基后，马上用手转动培养皿，转动几下，让其混合均匀），然后等其凝固再移入培养箱中培养，注意最后一步倒平皿必须在超净台无菌操作，以免杂菌污染。

每次稀释均要换灭好菌的移液管。

④、培养条件：

37℃恒温培养箱培养48～72h

⑤、培养完毕后，取出进行计数，因为是稀释了1亿倍，所以一个透明圈菌落代表1亿/克，如果有200个透明圈，则是200亿/克。

例：

实验要求：

1、要求学生在实验前做好预习，了解实验原理方法步骤，独立操作，及时提交实验报告。

2、要求对自己实验的酸奶作出评价与分析。

3、每人菌数实验做2-3个平行，结果测定值之间差异不悬殊。

4、要求有效单菌落数为30-300之间。

实验器材及试剂：

菌种：

市售酸奶

试剂：

白糖奶粉培养基各成分

器材：

培养箱、电炉、铝锅5L，培养皿

酸奶发酵瓶：

自带

实验结果：

1、详细描述自己制作的酸奶结果：

2、测定酸奶PH:

3、记录个人酸奶中各平行数据，计算最终平均值。

思考题：

乳酸菌的保藏通常为低温条件，这给运输带来很大的成本，请问可采用什么方法使乳酸菌在常温条件下有很高的存活率以减少运输成本？

实验二枯草芽孢杆菌固态发酵及活菌数测定（5学时）

实验类型：

综合性

实验目的：

1、学习了解固态发酵原理；

2、以枯草芽孢杆菌为对象，了解固态发酵的控制技术；

3、掌握枯草芽孢杆菌活菌计数方法与操作。

实验原理：

作为抗生素的替代品，益生菌和酶制剂等的研究与开发近几年成为绿色饲料添加剂的热点，其中益生菌倍受关注。

作为益生菌的一种，芽孢杆菌制剂在动物生产中的研究和应用一直都是畜牧业科研和生产人员关注的焦点。

目前芽孢杆菌多采用液体深层发酵技术，再经喷雾干燥进行生产，对设备要求高，生产工艺复杂；而固体发酵采用的原料一般是廉价的农副产品（如草粉、麸皮等），采用的设备也较液体发酵简单，生产成本大大低于液体发酵。

所以近年来各生产厂家都在积极探索芽孢杆菌的固体发酵技术，以求简化生产工艺，提高产量，降低生产成本。

固态发酵定义：

指没有或几乎没有自由水存在下，在有一定湿度的水不溶性固态基质中，培养一种或多种微生物的生物反应过程，其是以气相为连续相的生物反应过程。

枯草芽孢杆菌属于好氧微生物，实验室条件下利用稀释涂布培养的方法，让菌在有氧条件下生长，每个单菌落代表一个微生物细胞。

实验内容：

1、液体种子培养基配制：

葡萄糖0.2%，NaCl0.5%，酵母膏0.5%，蛋白胨1%，pH7.0。

2、液体种子培养：

每300mL三角瓶装量50mL液体种子培养基，在115℃条件下灭菌30min。

降温后从斜面接一环菌苔至种子培养基。

置37℃控温摇床培养。

转速200r·min-1，至芽孢率达90%以上时停止，约需24h。

3、固体发酵培养基：

麸皮60%，稻壳10%，玉米粉5%，豆粕25%，硫酸镁0.05%，硫酸铵0.5%，料水比为1:

1.1。

4、三角瓶固体发酵培养：

每250mL三角瓶装量20-30g（湿重），固体发酵培养基原料试剂混合料，加水，料水比为1:

1.1，搅拌均匀，培养基经121℃灭菌30min，降温后接种量为2%（V/M：

V—液体菌种体积数，M—固体发酵培养基的质量），然后置37℃培养箱中静止培养，间时拍打，使其均匀生长。

至脱落芽孢率为80%以上时，停止发酵，约需48h。

然后于60℃烘干、粉碎、计活菌数。

（二）枯草芽孢菌活菌检测

①、检测培养基：

葡萄糖0.2%，NaCl0.5%，酵母膏0.5%，蛋白胨1%，琼脂粉2%，pH7.0。

115℃灭菌20min，灭菌后放置水浴52℃保温备用。

②、稀释：

取10克样品放入添加90ml无菌水的带玻璃珠的250ml三角瓶中，摇床180rpm震荡30min，即为10－1样品溶液；再从中取1ml至添加9.0ml无菌生理盐水的三角瓶中，稀释至10－2，……以此类推稀释至10－8，即稀释了1亿倍;

③、倒制培养平板，将已经灭了菌的保持在52℃水浴锅中的呈溶解状态的培养基，倒入15毫升左右于培养皿中，全部浸到培养皿，待培养基凝固；从上述已稀释了1亿倍的菌悬液中取0.2ml于已凝固的培养基表面，用玻璃刮铲涂布均匀，静止10min，然后再移入培养箱中培养。

④、培养条件：

37℃恒温培养箱培养24～48h；

⑤、培养完毕后，取出进行计数，因为是稀释了5亿倍，所以一个透明圈菌落代表5亿/克，如果有200个透明圈，则是1000亿/克。

（三）芽孢率测定:

采用芽孢革兰氏染色后显微镜下观察

实验要求：

1、要求学生在实验前做好预习，了解实验原理方法步骤，独立操作，及时提交实验报告。

2、要求对芽孢杆菌固体培养产物有初步的判断。

3、每人菌数实验做2-3个平行，结果测定值之间差异不悬殊。

4、要求有效单菌落数为30-300之间。

实验器材及试剂：

菌种：

枯草芽孢杆菌

试剂：

培养基成分

器材：

培养箱、灭菌锅，培养皿

实验结果：

1、详细描述枯草芽孢杆菌固态培养物（外观、气味、培养物状态等）：

2、记录个人活菌测定中各平行数据，计算最终平均值。

思考题：

在枯草芽孢杆菌固态培养过程中，为了防止霉菌与酵母的污染，可采用什么方法？

实验三、淀粉糖化与酒精发酵（5学时）

实验类型：

综合性

实验目的：

1．了解酒精发酵的主要类型、工艺原理及其控制条件

2．熟悉酒精生产的工艺流程、掌握酒精发酵的操作方法

3.掌握用酶法从淀粉原料到水解糖的制备原理及方法

4.掌握在实验室中模拟酒精发酵的工艺流程

实验原理

玉米粉、大米粉中可供发酵的物质主要是淀粉，而酿酒酵母由于缺乏相应的酶，所以不能直接利用淀粉进行酒精发酵，因此必须对原料进行预处理，包括蒸煮（液化）、糖化等，蒸煮可使淀粉糊化，并破坏细胞，形成均一的醪液，能更好的接受糖化酶的作用，并转化为可发酵性糖，以便酵母进行酒精发酵。

在无氧条件下酵母菌利用可发酵性糖转化为酒精和二氧化碳的作用，称为酒精发酵，是生产酒精及各种酒类的基础，可通过测定发酵过程中产生CO2的量和最终产物酒精的量得知酵母的发酵能力。

实验内容

1、原料的粉碎

将玉米、大米用粉碎机粉碎到一定程度，玉米淀粉含量为70%，大米淀粉含量为75%。

2、蒸煮糊化

称取一定量的粉碎后淀粉质原料，按照一定的料水比（100g：

200ml），调制淀粉乳，90-100℃条件下恒温水浴加热，淀粉乳受热后，在一定温度范围内，淀粉粒开始破坏，晶体结构消失，体积膨大，粘度急剧上升，呈粘稠的糊状，即成为非结晶性的淀粉。

3、糖化

经蒸煮糊化后的醪液，经过淀粉酶的糖化作用，将原料中的淀粉转化为可发酵性糖，供酵母利用。

为加快糖化速度，可以提高酶用量，缩短糖化时间，但酶用量太高，反而使复合反应严重，最终导致葡萄糖值降低，在实际生产中，应充分利用糖化罐的容量，尽量延长糖化时间，减少糖化酶用量。

酶参考用量：

淀粉乳33%，60℃，ph4.5，酶240U/g绝干淀粉，糖化时间16h。

糊化醪液调整pH4.5，往其中加入一定量的淀粉酶（120U/g）、糖化酶（120U/g），60℃恒温下不断搅拌，直至粘度下降到一定程度，淀粉完全糖化（如何简易快速判断？

）。

4、发酵

（1）干酵母活化

将干酵母按1:

20的比例投放于37℃的温水中复水20min。

目的：

恢复酵母细胞的正常功能。

（2）淀粉醪液糖化后，取400ml上清液于洁净的大可乐瓶中，加相同体积的水稀释，加入活化好的酵母种液5ml，混匀，28度培养箱中静止培养36h左右。

5、二氧化碳生成的检验

（1）观察三角瓶中的发酵液有无气泡溢出；

（2）滴入10%氢氧化钠1ml于发酵液试管中，观察，如气体逐渐消失，则说明有二氧化碳的存在；

6、二氧化碳生产量的测定

（1）接种完，擦干瓶外壁，于天平上称量，记为W1;

（2）实验结束，取出瓶轻轻摇动，使二氧化碳尽量溢出，在同一天平上称量，记为W2；

（3）二氧化碳生成量=W1-W2

7、酒精生成的检验

（1）打开瓶塞，嗅闻有无酒精气味；

（2）取发酵液5ml，加10%硫酸2ml；

（3）再加入1%K2Cr2O7溶液10-20滴，如颜色由黄色变为黄绿色，则说明有酒精产生。

K2Cr2O7+H2SO4+CH3CH2OH——CH3COOH+K2SO4+Cr2（SO4）3

实验要求：

1、要求学生在实验前做好预习，了解实验原理方法步骤，独立操作，及时提交实验报告。

2、要求仔细观察实验现象；计算酒精的理论生成与实际产量两者之间的关系。

3、实验数据翔实。

实验器材及试剂：

菌种：

活性干酵母

试剂：

培养基各成分、大米粉、活性干酵母、淀粉酶、糖化酶、大可乐瓶（学生自备）

溶液：

10%H2SO4、1%K2Cr2O7、10%NaOH

器材：

试管、培养箱、灭菌锅、三角瓶、水浴锅、粉碎机、离心机

实验结果：

1、详细记录实验过程中各参数及数据。

2、对实验结果的判断与分析。

思考题：

现有3株不同来源的酒精酵母，请设计实验判断哪株酵母发酵酒精能力最强？

实验四米曲霉固体发酵生产纤维素酶及酶解底物反应（5学时）

实验类型：

综合性

实验目的：

1、了解米曲霉固体发酵产酶情况

2、掌握微生物固体发酵操作技术

3、了解纤维素酶提取方法及酶活性定性测定方法

实验原理

纤维素酶是降解纤维素的一组酶的总称，是起协同作用的多组分酶系，属于诱导酶，其产生需要纤维素类物质的诱导。

实验中以米曲霉为发酵菌株，稻草作为产酶诱导物。

实验内容

1、米曲霉菌种活化

（1）配制PDA培养基：

称取200g马铃薯，洗净去皮切碎，加水1000ml煮沸半个小时，纱布过滤，再加20g葡萄糖和20g琼脂，充分溶解后趁热纱布过滤，分装试管，每试管约5-10ml（视试管大小而定），15磅蒸气（121℃）灭菌20分钟左右后取出试管摆斜面，冷却后贮存备用。

（2）在无菌超净台上接种保藏的米曲霉于PDA斜面，28℃培养5-7天，斜面上长满孢子。

2、配制发酵培养基：

15g麸皮+10g稻草粉，0.5%KH2PO4，0.5%（NH4）2SO4，加15ml水（加水量40%～60%），拌匀，装瓶；

3、灭菌

121℃灭菌30min，冷却至室温。

4、米曲霉孢子悬浮液制备

已培养好的米曲霉孢子斜面一支，加入约10ml无菌水，洗下孢子，制成孢子悬液。

5、接种：

用移液管在无菌条件下吸取一定量的悬液，移入灭菌好的固体培养基中，于30度条件下培养96h，期间每隔12h摇动三角瓶一次。

6、提取粗酶液

向瓶中加入无菌水约50ml，浸泡固体曲30min-1h；过滤得粗酶液。

7、酶活性测定

（1）配制1%CMC底物平板：

配方：

1g羧甲基纤维素钠，1.8g琼脂，100ml，琼脂完全溶解后，加入0.03g曲利本蓝，倒平板，每皿约15ml。

（2）打孔：

打孔器经酒精燃烧灭菌后，每平板打4孔，并在酒精灯火焰上稍稍加热打孔处，使孔周围的培养基微融，然后平放冷却。

（3）加样：

往孔内加入粗酶液适量（约100ul），同时需设对照。

（4）培养（反应）：

将加样后的平板小心平端放入30℃培养箱，放置20小时左右。

（5）观察结果：

可直接观察透明圈有无、测定透明圈直径。

实验要求

1、要求学生在实验前做好预习，了解实验原理方法步骤，独立操作，及时提交实验报告。

2、米曲霉生长状态良好。

3、实验数据能否反映实验操作、实验结果。

实验器材及试剂：

菌种：

米曲霉

试剂：

土豆、稻草、麸皮、硫酸铵、羧甲基纤维素钠（CMC）

器材：

培养箱、灭菌锅、三角瓶、摇床、离心机、天平、三角瓶

实验结果：

1、仔细观察固体培养基发酵前后的状态，并描述；

2、仔细观察底物平板酶解前后的现象，并测量水解圈大小。

思考题：

纤维素是自然界最丰富的资源，从理论角度分析如何最大限度地通过酶法利用该资源？

而现实存在什么问题？

实验五甘露聚糖酶液体发酵及酶解反应（6学时）

实验类型：

综合性

实验目的：

1.了解并掌握液体发酵产酶操作及酶反应条件的控制

2.与固体发酵产酶进行比较分析

实验原理

甘露聚糖是植物半纤维素的重要组分，其主链是由吡喃甘露糖残基以1,4-β-D糖苷键连接而成。

当主链的某些残基被葡萄糖取代，或半乳糖通过1,6-α-糖苷键与甘露糖残基相连形成分枝，则称之为异甘露聚糖，主要有半乳甘露聚糖、葡萄甘露聚糖和半乳葡萄甘露聚糖。

甘露聚糖是半纤维素的第二大组分，在自然界中分布广泛，且多以异甘露聚糖的形式存在，同型甘露聚糖十分少见。

β-甘露聚糖酶以内切方式降解甘露聚糖主链产生不同聚合度的甘露寡糖和少量甘露糖，是甘露聚糖降解酶中最关键的酶。

甘露聚糖酶可广泛应用于食品、造纸、纺织印染等行业。

利用β-甘露聚糖酶可以制取有特殊保健作用的甘露寡糖。

在纸浆制造业，可用于代替碱法进行脱色、漂白。

在纺织印染方面，利用β-甘露聚糖酶与其它酶联合作用，能有效去除产品上粘附的多余染料，降低能耗和对环境的污染等。

甘露聚糖酶的工业化生产将在许多行业产生很大的经济和社会效益。

因此，近年来甘露聚糖酶逐渐成为国内外关注和研究的热点之一。

甘露聚糖酶是一种半纤维素酶，其产生需要一定的诱导物存在。

本实验以枯草芽孢杆菌为菌株，以魔芋粉为诱导物。

实验内容

1.菌种活化

（1）配制LB固体培养基：

蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L，琼脂20g/L，待琼脂充分溶解后趁热纱布过滤，分装试管，每试管约5-10ml（视试管大小而定），15磅蒸气（121℃）灭菌20分钟左右后取出试管摆斜面，冷却后贮存备用。

（2）在无菌超净台上接种保藏的枯草芽孢杆菌于LB斜面，28℃培养2天。

2.配制产酶培养基：

蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L，魔芋粉30g/L，

3.以10%的体积量分装于三角瓶中（25ml液体培养基/250ml三角瓶），121℃灭菌20分钟；

4.菌悬液的制备

已培养好的枯草杆菌斜面一支，加入约10ml无菌水，洗下菌体，制成菌悬液。

5.接种

用移液管在无菌条件下吸取一定量的悬液，移入灭菌好的固体培养基中，于37度200rpm条件下培养72h。

6.粗酶液提取

3000rpm离心收集得到粗酶液

7.酶解底物分析

准备两三角瓶，分别加入50ml自来水，46度水浴保温

8.往两三角瓶中各加入1g魔芋粉，然后其中一个加入粗酶液1ml，另一个加入1ml蒸馏水（做空白对照）。

以后每隔5-10min往两三角瓶中各加入1g魔芋粉，前后共加5g

9.酶解反应30-60min，期间观察反应现象。

实验要求：

1、要求学生在实验前做好预习，了解实验原理方法步骤，独立操作，及时提交实验报告。

2、仔细观察酶解反应现象，做好记录。

3、实验数据翔实。

实验器材及试剂：

菌种：

枯草芽孢杆菌

试剂：

蛋白胨、酵母粉、氯化钠、魔芋粉

器材：

培养箱、灭菌锅、三角瓶、摇床、离心机、天平、三角瓶

实验结果：

1、仔细观察液体培养基发酵前后的状态，并描述；

2、仔细观察底物水解前后的现象。

思考题：

以本人液体发酵产酶为例，请详细介绍甘露聚糖酶定量测定的原理与方法。

实验六从土壤中分离筛选产抗生素放线菌及抗菌谱分析（6学时）

实验类型：

设计性

实验目的：

学生自己补内容

实验原理：

学生自己补内容

实验内容：

学生自己补内容